CN109486699A - 一株耐盐好氧反硝化菌及应用 - Google Patents

一株耐盐好氧反硝化菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐盐好氧反硝化菌及其应用。该菌株可用于高效脱除高盐废水中的硝态氮，命名为假单胞菌Pseudomonassp.DN‑23，于2018年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018290。本发明通过富集驯化、初筛、复筛得到了一株耐盐好氧反硝化菌，提供了一种新的微生物资源。本发明筛选的假单胞菌是从皮革废水中得到的，能够在高盐环境下生长良好并有效去除水体中的硝态氮。该菌株应用在高盐废水的处理过程中具有广阔的前景。

Description

一株耐盐好氧反硝化菌及应用
技术领域
本发明属于环境生物技术领域和环境保护领域。具体涉及一株耐盐好氧反硝化菌及其在高盐水体脱氮中的应用。
背景技术
随着工业和农业的迅速发展，生产生活过程中向水体中排放的含氮有机物迅速增加，大量含氮有机物的排放造成了严重的水体富营养化和水体污染。如何高效的去除水体中的氮已成为现在研究的热点问题。一直以来，传统脱氮理论认为反硝化菌的酶系统在O2存在的情况下会被抑制，只有在厌氧条件下，反硝化菌才能利用NO3 -、NO2 -作为电子受体，进行反硝化作用。然而，随着好氧反硝化菌的不断发现，打破了固有的反硝化脱氮的工作模式，为新型脱氮提供了理论和基础。同时，短程硝化反硝化和同步硝化反硝化成为了可能，这不仅能大大的减少反应器的占地面积，还能缩短处理周期和节省运行成本。
然而，由于我国的污水类型不断增加，其中，类似餐饮和皮革行业的高盐废水排放量也在增加。由于盐的存在使得废水中的脱氮处理过程受到很大影响。因此，筛选出能够耐盐的好氧反硝化菌并应用到水体中成为时代所需。能够在高盐环境下进行反硝化的菌株，可以简化高盐废水的预处理，为解决高盐废水的脱氮问题提供良好的基础。对耐盐反硝化菌的脱氮特性、脱氮机理和应用性能的进一步研究和探索可以大大提高废水的脱氮效率，对工业水处理有很重要的理论价值和工程实践意义。
本研究发现的假单胞菌Pseudomonas sp. DN-23能够高效快速的脱除废水中的硝态氮，为好氧反硝化菌的理论研究和应用提供材料，也为开发新型脱氮技术提供了理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐盐好氧反硝化菌株。
本发明的目的在于提供一种上述耐盐好氧反硝化菌的应用。
所述的耐盐好氧反硝化菌通过16S rDNA鉴定为假单胞菌（Pseudomonas），命名为Pseudomonas sp. DN-23。该菌株于2018年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号CCTCC NO: M2018290。
本发明所提供的耐盐好氧反硝化菌（Pseudomonas sp. DN-23），经鉴定该菌为革兰氏阴性菌、短杆菌。在反硝化培养基上，其菌落为圆形、不透明、乳白色、表面褶皱。
本发明提供的好氧反硝化菌在氯化钠为6%的反硝化培养基中下仍具有良好的生长性能（OD600=0.73）和反硝化速率(92.28%)。
附图说明
图1 DN-23在不同盐浓度下的生长和反硝化性能。
具体实施方式
实施例1：耐盐好氧反硝化菌的筛选。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
（1）富集驯化：将10 mL制革废水加入到含90 mL灭菌的富集培养基中，经过48 h摇床震荡培养后（30oC，150 rpm），将10 mL细胞悬液转移到新的90 mL灭菌富集培养液，并于上述培养条件下进行二次富集培养。将10 mL二次富集培养液转移到新的90 mL灭菌的富集培养基中，在同样条件下完成第三次富集驯化
（2）初筛：将第三次的富集培养液进行梯度稀释，通过平板涂布到加入2%琼脂的固体选择培养基上（30oC，48 h），根据选择培养基的变色情况，挑选培养基上出现的蓝色单菌落，将单菌落在平板上划线，从平板将单菌落接种于含有指示剂（溴百里酚蓝）及杜氏小管的液体选择培养基上培养（30oC，48 h），选取培养基变成蓝色且杜氏小管有气泡的菌株作为目标菌株，进行下一步复筛
（3）复筛：将初筛得到的菌株接种到反硝化培养基（30oC，150 rpm）振荡培养48 h后，测定细菌的浓度（OD600）和培养液中残留的硝态氮的含量，计算硝态氮降解率，得到一株生长良好和硝态氮降解量最高的耐盐反硝化菌。
所述的富集培养基为（g/L）：KNO3 0.72，无水乙酸钠 5，磷酸氢二钾 1，磷酸二氢钾 1，氯化镁 0.5，微量元素 2 mL，氯化钠 3%，pH 7.0。
所述的液体选择培养基为（g/L）：KNO3 0.72，无水乙酸钠 5，磷酸氢二钾 1，磷酸二氢钾 1，氯化镁 0.5，微量元素 2 mL，氯化钠 3%，溴百里酚蓝（0.1 g溴百里酚蓝溶于10mL酒精中）1 mL，pH 7.0。
所述的固体选择培养基为（g/L）：（液体选择培养基添加2%琼脂）KNO3 0.72，无水乙酸钠 5，磷酸氢二钾 1，磷酸二氢钾 1，氯化镁 0.5，微量元素 2 mL，氯化钠 3%，溴百里酚蓝（0.1 g溴百里酚蓝溶于10 mL酒精中）1 mL，琼脂 20，pH 7.0。
所述的反硝化培养基与富集培养基成分一致。
所述的微量元素为（g/L）：EDTA 50，硫酸锌 2.2，氯化钙 5.5，氯化锰 2.06，硫酸亚铁 5，（NH4）6Mo7O24.4H2O 1.1，硫酸铜 1.57，氯化钴 1.61，pH 7。
OD600和硝态氮的测定。
OD600：将细菌悬液离心后（10000 rpm，5 min）弃去上清液，并用蒸馏水离心洗涤两次，重悬到原来体积，在波长为600 nm处的紫外分光光度计下测定细胞的光密度
硝酸盐氮的测定：利用硝酸根离子的浓度可以通过紫外分光光度计在波长为220 nm下测定，而干扰物质在220 nm波长处也会有吸收，硝酸根离子在275 nm波长处并没有吸收。所以可以通过测量培养液在220 nm和275 nm两处波长的吸收状况来定量计算培养基中硝酸氮的浓度
计算公式：A校=A220-2A275
其中：A220-----220 nm波长测得的吸光度
A275-----275 nm波长测得的吸光度
计算得出的校正后的吸光度，可根据标准曲线计算出对应的硝态氮浓度。稀释后测量的，所得数据乘以相应的稀释倍数。
具体实施例2：耐盐好氧反硝化菌在不同盐浓度条件下生长和反硝化性能。
耐盐好氧反硝化菌在不同浓度的NaCl中生长和硝态氮降解情况。将DN-23种子液按1%的接种量接种到含不同盐浓度的反硝化培养基（0%、3%、4%、5%、6%），在30oC，150 rmp的摇床中培养48 h，按照[0016]方法使用紫外分光光度计检测生物量（OD600）和培养基中剩余硝态氮质量浓度，得出两者随NaCl浓度的变化趋势，如图1所示。随着盐浓度的升高，生物量有所降低，但硝态氮降解率还是处于很高的水平，同时，在氯化钠为6%的条件下仍具有较好的生长性能（OD600=0.73）和反硝化速率(92.28%)。表明该菌株在高盐环境下仍具有高效的硝态氮降解能力和良好的生长能力。

Claims (6)

1.一株耐盐假单胞菌Pseudomonas sp. DN-23，分离自制革废水，于2018年5月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2018290。
2.权利要求1所述的好氧反硝化菌，在高盐水体中的应用，其特征在于它能在高盐条件下高效降解水体中的硝态氮。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于它是按以下步骤进行的：将反硝化菌的种子液按1%的比例接种到反硝化培养基中，测定反应前后水体中硝态氮含量并计算反硝化速率。
4.根据权利要求3所述的反硝化培养基为 (g/L)：KNO3 0.72，无水乙酸钠 5，磷酸氢二钾 1，磷酸二氢钾 1，氯化镁 0.5，微量元素 2 mL，氯化钠 3%，pH 7.0。
5.根据权利要求4所述的微量元素为 (g/L)： EDTA 50，硫酸锌 2.2，氯化钙 5.5，氯化锰 2.06，硫酸亚铁 5，（NH4）6Mo7O24.4H2O 1.1，硫酸铜 1.57，氯化钴 1.61，pH 7。
6.根据权利要求2所述的应用条件为30oC，150 rpm的条件下培养48 h。
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