CN104830710A - 一株耐高温的好氧反硝化菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境微生物领域，公开了一株耐高温的好氧反硝化菌，其分类命名为斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日为2015年1月9日，保藏编号为CCTCC NO:M2015027。本发明还公开了上述耐高温好氧反硝化菌的应用，该菌株可以在50℃时生长良好，并且具有较强的反硝化能力，在反硝化过程中极少积累亚硝酸盐，无二次污染。本发明采用自富营养化湖泊水体中筛选所得的高效好氧反硝化菌，经扩大培养后，可直接用于湖泊水体的脱氮，避免了非土著微生物的环境不适应性。将此菌株应运用工业废弃的处理之上，会获得巨大的经济价值。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株耐高温的好氧反硝化菌及其在污水脱氮中的应用，是一种优良微生物的选育，由此拓宽富营养化水体的治理范围。
背景技术
氮素是污水中一类非常重要的污染物，可引起水体富营养化，危及水生生物及人类健康。水体中氮素主要以有机氮(如蛋白质、氨基酸等)和无机氮(氨氮，硝态氮和亚硝态氮)两种形式存在。其中，有机氮一部分被水生生物同化吸收，一部分被氨化菌转化为氨氮，然后经硝化菌的硝化作用和反硝化菌的反硝化作用最终转化为氮气释放到空气中，完成自然界的氮素循环。
生物反硝化脱氮是利用微生物的作用，在厌氧或缺氧条件下，以硝酸盐替代氧作为电子受体将硝酸盐逐步还原为气态产物脱除，是一种经济有效的脱氮方式。但往往由于受到厌氧和缺氧条件的限制，生物脱氮过程进行的并不彻底。好氧反硝化菌的出现使得反硝化过程更容易进行，利用好氧反硝化酶，在有氧条件下进行反硝化作用。目前，越来越多的研究证明细菌好氧反硝化的存在，并发现了一些在有氧条件下有较高反硝化率的细菌。
好氧反硝化细菌作用机制的电子理论为：早起理论认为，O2的得电子能力阻止了电子传递给NO3 -或NO2 -，从而抑制了反硝化的进行。而最近研究表明，细菌反硝化酶系和有氧呼吸系统同时存在。NO3 -被还原的同时，O2被还原，氧不是抑制反硝化酶活性和反硝化酶生成的直接因素。缺少NO3 -或O2都会降低细菌的生长率和反硝化率。Wilson等人提出了细菌反硝化过程中的电子传递模型，该模型中NO3 -、O2均可作为电子最终受体。反硝化菌可将电子从被还原的物质传递给O2，同时也可通过硝酸盐还原酶电子传递给NO3 -。
由于好氧反硝化较传统生物脱氮技术存在着明显的优势，近年来好氧反硝化技术成为了国内外废水生物脱氮新的发展方向。自20世纪80年代，Robertson等(Robertson et al.Archives of Microbiology，1984,139,351-354)在除硫和反硝化系统中首次分离出好氧反硝化菌依赖，人们对于好氧反硝化菌的脱氮性能已经进行了一定程度的研究。已筛选 出多种高效好氧反硝化菌株，到目前为止，好氧反硝化菌主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)和芽孢杆菌属(Bacillus)。但筛选的反硝化细菌都只适应处理中温环境的废水(20-40℃)，若处理高温废水则需对废水进行降温处理。若用常温好氧反硝化菌进行生物脱氮处理要装置降温设备，从而增加了脱氮成本。因此，筛选分离出高温条件下具有高效的好氧反硝化细菌，并将其应用于实际污水处理中，以节约脱氮成本，提高经济效益具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一株耐高温的好氧反硝化菌，用于湖泊富营养化水体脱氮，同时也可以用于处理湿法脱硫等后高温废水的脱氮。
本发明还要解决的技术问题，是提供上述耐高温好氧反硝化菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株耐高温好氧反硝化菌，其分类命名为Pseudomonas stutzeri N3-3，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2015年1月9日，保藏编号为CCTCC NO:M2015027。该菌株是发明人于2013年8月从江苏省无锡市太湖梅梁湾水体中分离得到。
表1
上述菌株斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)Strain N3的生理特性见表1。
上述耐高温好氧反硝化菌，其16SrDNA基因上有效长度约为1188bp的核苷酸序列，16SrDNA序列如SEQ ID No.：1所示。将该序列输入GenBank，用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Pseudomonas stutzeri sp.的16SrDNA序列相似性较高，为100％。基于16SrDNA基因的系统发育分析结果以及生理生化特性，鉴定为斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri sp.)的一株新菌株。
上述耐高温好氧反硝化菌在水体脱氮中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述耐高温好氧反硝化菌尤其适用于富营养化水体的脱氮。其中，富营养化水体中，硝态氮的浓度可以在20～100mg/L范围内，温度可以在4～60℃范围内，在上述硝态氮浓度和温度范围内，本发明的耐高温好氧反硝化菌都具有较好的脱氮能力。
本发明的耐高温反硝化菌在50℃高温条件下可以硝酸盐为电子受体进行反硝化反应，脱氮效率高。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用自富营养化湖泊水体中筛选所得的高效好氧反硝化菌，该菌株在50℃高温条件下可以硝酸盐为电子受体进行反硝化，12h脱氮效果可达100％，在此过程中极少积累亚硝酸盐，无二次污染。经扩大培养后，直接用于湖泊水体的脱氮，避免了非土著菌种的环境不适应性，在实际工程中具有较大的应用潜力。
附图说明
图1耐高温好氧反硝化菌复筛结果图。
图2耐高温好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3的生长曲线
图3耐高温好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3不同环境温度下的反硝化能力。
图4耐高温好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3高温环境(50℃)下的反硝化能力。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：耐高温好氧反硝化菌株分离
采集水样，注入灭菌采样瓶中，低温保存，立即带回实验室，取该水100ml，加入柠檬酸钠0.2g，K2HPO40.1g，KH2PO40.1g，KNO30.2g，MgSO4·7H2O 0.02g，调pH7.2-7.4，即反硝化培养基。将反硝化培养基及1mm无菌玻璃珠若干装入已经121℃、20min灭菌的500ml锥形瓶，灭菌纱布封口，置于30℃、200rpm摇床培养进行好氧反硝化菌的富集。培养约72h后，去菌悬液按10％接种量接入新鲜无菌的反硝化培养基(去离子水配置)，连续传代富集三次，培养条件同上。富集得到的混合菌悬液梯度稀释后，涂布于溴百里酚蓝(BTB)培养基平板。配方为：L-天冬酰胺10g，KNO310g，柠檬酸钠85g，KH2PO410g，FeCl3·6H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 2g，MgSO4·7H2O 10g，BTB(1％，in alcohol)10ml，去离子水1000ml，琼脂15g，调pH7.2-7.4。30℃培养至产生蓝色单菌落。将蓝色单菌落采用平板划线法在LB平板上进行纯化并保存。将纯化后的菌株在ssBTB(琼脂5g，其余配方铜BTB)中进行穿刺培养，如图1所示，选取2天内培养基顶端变蓝、穿刺部位含有气泡或培养基破裂的菌株即为高效菌株。
将实验初筛得到10株好氧反硝化菌株，经ssBTB法复筛后，共有4株在2天内呈现好氧反硝化反应阳性(培养基变蓝、穿刺部位有气泡或培养基破裂)。选取培养基出现阳性反应最为强烈的菌株，经鉴定为Pseudomonas stutzeri sp.strain N3，保藏编号为：CCTCC NO:M2015027，主要生物学特性为G-，菌体为短杆状，菌落淡黄色半透明，易挑起。并对其进行生长速率测定：将Pseudomonas stutzeri sp.strain N3接种至反硝化培养基中进行培养，定期取样测定OD600。如图2所示，该菌株在培养6h后进入对数生长期，其生长速度较快，20h后生物量达到最高，随后进入稳定生长期。
实施例2：耐高温好氧反硝化菌在不同环境温度下的反硝化能力。
采集水样，测定水样的pH、温度、总氮、硝态氮、亚硝态氮、氨氮及总碳。将上述所得好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3接种至液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养至生长对数期，无菌条件下经12000rpm离心5min，灭菌10mM的磷酸钠缓冲液洗涤两次并重悬后，10％接种量接种于含有20mg/l硝态氮的太湖梅梁湾表层水样进行实验。实验条件为：分别采用KNO3和柠檬酸钠调节C/N＝8，硝态氮含量为20mg/l，pH7.2-7.4。分别在不同环境温度：4-60℃，200rpm振荡培养12h。取样测定水 体中硝态氮和亚硝态氮的含量，得到氮的去除率。脱氮效果如图3所示，4-50℃范围内，好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3的反硝化能力随着温度的升高而逐渐增强，低温环境4-15℃条件下，具有一定的反硝化能力，12h内可将约45％的硝态氮还原，并且有较少量亚硝态氮的积累；20℃以上环境下，反硝化能力明显增强，50℃高温环境下，好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3在12h内可将完全将体系中的硝态氮还原，并且无亚硝态氮的积累；当温度升高至60℃时，好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3反硝化能力明显下降，但依然残余有37％左右的反硝化能力。
实施例3：好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3高温环境下的反硝化能力。
将上述所得好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3接种至液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养至生长对数期，无菌条件下经12000rpm离心5min，灭菌10mM的磷酸钠缓冲液洗涤两次并重悬后，10％接种量接种于含有不同浓度硝态氮的太湖梅梁湾表层水样进行实验。实验条件为：采用KNO3和柠檬酸钠调节C/N＝8，使硝态氮浓度范围为20-100mg/l，pH7.2-7.4，50℃、200rpm振荡培养12h。取样测定水体中硝态氮和亚硝态氮含量，得到氮的去除率。脱氮结果如图4所示，高温环境50℃条件下，好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3具有较强的反硝化能力。12h内可将60mg/l的硝态氮完全还原，并且无亚硝态氮的积累；当水体中硝态氮含量高于60mg/l时，好氧反硝化菌Pseudomonas stutzeri sp.strain N3同样具有较强的反硝化能力，12h内可还原约80％高浓度硝态氮水体(100mg/l)，并且有较少量亚硝态氮积累，无二次污染。
Claims (5)
1.一株耐高温的好氧反硝化菌，其分类命名为斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzerisp.)，菌株号为Strain N3，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年1月9日，保藏编号为CCTCC NO:M2015027。
2.权利要求1所述的耐高温好氧反硝化菌在水体脱氮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的水体为富营养化水体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的富营养化水体，其温度为4～60℃。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的富营养化水体，其中硝态氮的浓度为20～100mg/L。
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