CN103215202B - 一株好氧反硝化菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株好氧反硝化菌，其分类命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.）Strain N2，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年3月19日，保藏编号为CCTCC NO:M2013093。本发明还公开了上述好氧反硝化菌的应用。本发明采用自富营养化湖泊水体中筛选所得的高效好氧反硝化菌，该菌株同时具备异养硝化作用，可同时去除水体中硝态氮和氨氮，且反硝化作用过程中极少积累亚硝酸盐，无二次污染。经扩大培养后，直接用于湖泊水体的脱氮，避免了非土著菌种的环境不适应，在实际工程中具有较大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株好氧反硝化菌及其应用。
背景技术
好氧反硝化菌是利用好氧反硝化酶，在有氧条件下进行反硝化作用的一类反硝化菌。近年来，好氧反硝化菌不断从废水、活性污泥、土壤、养殖场等环境样品中被筛选得到，证实了这一作用的广泛存在。根据目前文献报导，好氧反硝化菌的筛选方法主要有以下三种：（1）间歇曝气法：根据好氧反硝化菌可同时利用O2和NO3 -，好氧、缺氧频繁转换有利于其在竞争中取得优势地位。（2）选择性培养基或呼吸抑制剂法：如氰化钾可终止呼吸链中电子向氧传递，从而抑制氧作为电子受体的呼吸反应，同时曝气状态下氧又抑制厌氧条件下酶的表达，筛选好氧反硝化菌。（3）酸碱指示剂法：在培养基中加入溴百里酚蓝（BTB），当好氧反硝化菌消耗硝酸盐后pH上升，指示剂由绿色变为蓝色，筛选平板上出现蓝色菌落。该方法目前仅用于好氧反硝化菌的初筛，需配合倒置杜氏小管等方法进行复筛。这几种方法或筛选条件苛刻、或步骤繁琐、试剂要求高。
随着工农业的发展和人类活动的加剧，大量营养盐通过各种途径进入湖泊水体，从而导致水体富营养化。氮素是生命活动所需的基本营养元素，也是引发水体富营养化的关键元素之一。水体中的硝酸盐、铵盐严重危害着水生生物及人类健康。湖泊水体脱氮最有效且无二次污染的方法即采用硝化反硝化微生物进行水体修复。微生物修复指利用微生物的生命代谢活动降低环境中有毒有害物质的浓度使其无害化，从而使被污染的环境能够部分或完全恢复到初始状态的过程，具有效果好、投资少、安全性高等特点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题，是提供一株好氧反硝化菌，可应用于湖泊水体脱氮。
本发明还要解决的技术问题，是提供上述好氧反硝化菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株好氧反硝化菌，其分类命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.）Strain N2，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏地址：武汉武汉大学，邮编：430072。保藏日期为2013年3月19日，保藏编号为CCTCC M2013093。该菌株是发明人于2010年11月从江苏省无锡市太湖梅梁湾水体中分离得到。菌株Acinetobactersp.strain N2的生理特性见表1。
表1
上述好氧反硝化菌，其16SrDNA基因上有效长度约为1425bp的核苷酸序列，16SrDNA序列如SEQ ID No.1所示，其GenBank登录号为KC782856。将该序列输入GenBank，用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Acinetobacter sp.菌的16S rDNA序列相似性较高，为100%。基于16S rDNA基因的系统发育分析结果以及生理生化特性，鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp.）的一株新菌株。
上述好氧反硝化菌在水体脱氮中的应用。
其中，所述的水体为富营养化水体。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用自富营养化湖泊水体中筛选所得的高效好氧反硝化菌，该菌株同时具备异养硝化作用，可同时去除水体中硝态氮和氨氮，且反硝化作用过程中极少积累亚硝酸盐，无二次污染。经扩大培养后，直接用于湖泊水体的脱氮，避免了非土著菌种的环境不适应，在实际工程中具有较大的应用潜力。
附图说明
图1为好氧反硝化菌复筛结果图。
图2好氧反硝化菌Acinetobacter sp.strain N2的生长曲线及总氮、硝态氮的去除。
图3好氧反硝化菌Acinetobacter sp.strain N2富营养化湖泊水体脱氮实验。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
从太湖梅梁湾0.5m深处采集水样，注入灭菌采样瓶中，立即带回实验室，取该水样100mL，加入琥珀酸钠0.284g，NaNO3 10mM，KH2PO4 0.136g，(NH4)2SO4 0.027g，酵母浸出液0.1g，MgSO4·7H2O 0.019g，微量元素溶液0.1mL，调pH7.2，即SM培养基。将SM及1mm灭菌玻璃珠若干装入灭菌的500mL锥形瓶，灭菌棉花塞封口，置于30°C、180rpm摇床培养进行好养反硝化菌的富集。培养24h后，取菌悬液按10%接种量接入新鲜无菌的SM培养基（蒸馏水配置），连续传代富集三次，培养条件同上。富集得到的混合菌悬液梯度稀释之后，涂布至BTB平板。配方为：L-天冬氨酸10g，KNO3 10g，KH2PO4 10g，FeCl2·6H2O 0.5g，CaCl2 1.5g，MgSO4·7H2O 10g，BTB(1%in alcohol)10mL，去离子水1L，琼脂20g，调pH7.0～7.3。30°C培养至产生蓝色单菌落。将蓝色单菌落采用平板划线法在LB平板进行纯化并保存。将纯化后的菌株在ssBTB（琼脂10g，其余配方同BTB）中进行穿刺培养，如图1所示，选取1-2天内培养基顶端变蓝、穿刺部位含有气泡或培养基破裂的菌株即为高效菌株。
该实验经初筛得到120株好氧反硝化菌株，经ssBTB法复筛后，共有42株在5天内呈现好氧反硝化反应阳性（培养基变蓝、穿刺部位有气泡或培养基破裂）。其中3株在12h内呈现阳性反应。选取培养基出现阳性反应最为强烈的菌株，经鉴定为Acinetobacter sp.strain N2，保藏编号为：CCTCC M2013093。并对其进行生长速率及脱氮效率测定：将Acinetobacter sp.strain N2接种至DM培养基，配方为：KNO3 2.0g，柠檬酸三钠6.77g，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO4 1.0g，微量元素液2mL，去离子水1L，调pH7.0～7.5，30℃进行培养，并定期取样测定培养液OD600及硝态氮、亚硝态氮含量，计算好氧反硝化速率。如图2所示，该菌株在培养6h后即进入对数生长期，24h后生物量达到最高。最大比生长速率约为0.48-0.6h-1。培养24h后硝态氮去除率为50%左右，96h硝态氮去除率达80%以上。亚硝态氮在8h开始少量积累，60h后浓度开始下降，96h后几乎检测不到。
实施例2：
采集太湖水样，测定水样的pH、温度、总氮、硝态氮、亚硝态氮、氨氮及总碳。将500mL液体培养基摇瓶培养的处于对数增长期的Acinetobacter sp.strain N2菌株，培养16h后，无菌条件下经8000rpm离心10min，灭菌0.1mol/L的PBS缓冲液洗涤两次并重悬后，接至10L太湖梅梁湾表层水样进行实验。实验条件为：温度20℃，添加乙酸钠调节C/N比8，pH7，适量曝气约4至5天。每隔一定时间补足蒸发的水分，取样测定总氮、硝氮和氨氮含量，得到氮的去除率。脱氮结果如图3所示，培养第2天时，水体的氨氮、硝态氮、总氮含量已有较明显的降低，说明该菌株因筛选自富营养化的太湖梅梁湾水体，所以无需环境适应期，可大大缩短水体脱氮时间。培养4天后，氨氮、硝态氮、总氮去除率约为80%以上。7天后，硝氮和总氮含量由原来的7mg/L左右降低至约0.3mg/L，氨氮则几乎检测不到。依照《地表水环境质量标准》，该水样水质由V类水标准提升至II类水标准。
Claims (2)
1.一株好氧反硝化菌，其分类命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.）Strain N2，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2013年3月19日，保藏编号为CCTCC M2013093。
2.权利要求1所述的好氧反硝化菌在水体脱氮中的应用；所述的水体为富营养化水体。
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| CN102747015B (zh) * | 2012-06-21 | 2013-10-16 | 北京理工大学 | 一种脱氮不动杆菌及其应用 |
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| JPH1156350A (ja) * | 1997-08-27 | 1999-03-02 | Nippon P M C Kk | 微生物及びポリアクリルアミドの微生物による分解方法 |
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