CN113337414A - 一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌及其应用，本发明涉及环境微生物及水处理技术领域。该菌株命名为Pseudomonas sp.MSD4。本发明通过筛选分离得到了一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌，其耐盐范围为0–10％，耐pH范围为5–11。该菌株在高盐废水处理、盐碱性修复等过程中具有广阔的应用前景。

Description

一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌及其应用

技术领域

本发明涉及环境微生物及水处理技术领域，具体而言，涉及一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌及其应用。

背景技术

近年来，随着社会经济的快速发展，大量的高氮废水被排放到水体中，引起水体富营养化问题。水体中氮的去除成为目前亟需解决的重要环境问题。生物法因能有效脱氮并不引起二次污染的优势，成为目前最为环保经济的处理手段。传统的生物脱氮过程中包括硝化和反硝化两个过程，其中，反硝化细菌为兼性厌氧菌，而硝化细菌为好氧菌，因此硝化过程和反硝化过程通常在两个反应池中进行，导致污水处理难度和成本显著增加。为解决上述问题，一种新型的生物脱氮技术——好氧反硝化成为研究热点。好氧反硝化是利用好氧反硝化菌，在有氧的条件下，利用NO₃ ^-作为电子受体，还原脱氮。好氧反硝化菌具有生长速度快、活性高、容易控制等优点，在污水脱氮处理方面有着广阔的应用前景。

但是，我们也注意到，目前筛选的好氧反硝化菌主要来自淡水环境，对于处理石油、医药、皮革、海产品加工等行业产生的高盐含氮废水，它们的生长和代谢易受到高盐度的抑制或毒害，进而难以有效脱氮。因此，筛选能够耐盐的好氧反硝化细菌，对解决高盐含氮废水的脱氮问题具有重要意义。

另外，研究表明，反硝化菌酶活性的最适pH为中性或微碱性，而反硝化过程是一个不断产碱过程，现有筛选的菌株在强碱环境下会出现反硝化效率降低的现象。因此，为开拓好氧反硝化细菌在实际废水处理中的应用，筛选出能够耐盐耐碱的高效好氧反硝化菌是一项极为迫切的任务，同时对工业废水处理具有重要的理论价值和工程实践意义。

发明内容

本发明目的在于提供一株耐盐耐碱好氧反硝化菌株。

本发明另一目的在于提供上述耐盐耐碱好氧反硝化菌株在高盐废水处理中的应用。

为实现上述目的，本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌，所述的耐盐耐碱好氧反硝化菌通过16S rDNA鉴定为假单胞菌(Pseudomonas)，命名为Pseudomonas sp.MSD4。

本发明公开的Pseudomonas sp.MSD4具有以下表型特征：在30℃下，营养琼脂培养基上培养24–72h后，菌落呈圆形，淡黄色，中间略凸起，淡黄色，表面光滑湿润，边缘整齐，单菌落较小；在扫描电子显微镜下菌体呈短杆状，大小为(0.4–0.7)×(0.8–1.6)μm。

本发明公开的Pseudomonas sp.MSD4 16S rDNA基因序列特征：如序列表中序列所示，序列长度为1474bp。

本发明公开的Pseudomonas sp.MSD4能够在盐度0％–10％、pH 5–11范围内生长和脱氮，其中盐度优选5％，pH优选9。

本发明公开的Pseudomonas sp.MSD4对实际高盐化工废水(盐度：3％，pH:9) 中的总氮和COD去除效果较好，去除率分别为50.9％和60.9％，初步探究了该菌株的应用潜力。

有益效果：

本发明筛选得到了一株假单胞菌，命名为Pseudomonas sp.MSD4。该菌株是一种好氧反硝化细菌，其耐盐范围为0％–10％，可以在盐度0％–7％的范围内脱氮。同时该菌株耐pH范围为5–11，其耐碱性较强。本发明公开的Pseudomonas sp.MSD4能适应高盐及强碱的极端环境，可以用于高盐条件的生物脱氮过程，包括高盐废水处理、盐碱地修复、控制水体富营养化、净化水体等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为耐盐耐碱假单胞菌Pseudomonas sp.MSD4细胞的扫描电子显微镜 (SEM)照片(比例尺为5μm)。

图2为耐盐耐碱假单胞菌Pseudomonas sp.MSD4在高盐度(盐度：3％)条件下的生长曲线图。

图3为耐盐耐碱假单胞菌Pseudomonas sp.MSD4在高盐度(盐度：3％)条件下对总氮和COD的降解曲线图。

图4为耐盐耐碱假单胞菌Pseudomonas sp.MSD4在不同盐度下的OD₆₀₀及对总氮的去除率图。

图5为耐盐耐碱假单胞菌Pseudomonas sp.MSD4在不同pH下的OD₆₀₀及对总氮的去除率图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下所列举的具体实施方式。

实施例中TN和COD监测分析方法参考哈希水质分析法中的方法10071和方法10031由哈希多参数水质分析仪(DR3900)测定。pH通过便捷式多功能水质分析仪(MYRONLULTRAMETERⅢTM 9P 9302034,USA)测定。OD₆₀₀通过分光光度计(UV5100B)测定。

实施例1

耐盐耐碱好氧反硝化菌株的筛选。

具体步骤如下：

1)配制好氧反硝化细菌富集用培养基：酵母膏0.5g/L、蛋白胨0.5g/L、氯化钠30g/L、葡萄糖0.5g/L、淀粉0.5g/L、丙酮酸钠0.3g/L、磷酸氢二钾0.3g/L、硫酸镁0.05g/L，用去离子水溶解，调pH为7，于121℃下蒸汽灭菌30min。

2)取10mL高盐活性剩余污泥(天津大沽化工化工有限公司污水处理厂) 接种于装有100mL上述液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃、140r/min摇床培养5天，共进行三代培养富集得到混合菌液。

3)配制好氧反硝化细菌分离用BTB培养基：硝酸钾1g/L、琥珀酸钠8.5g/L、氯化钠30g/L、磷酸氢二钾1g/L、六水氯化亚铁0.5g/L、七水氯化钙0.2g/L、七水硫酸镁1g/L、琼脂粉20g/L，用去离子水溶解，调pH为7，于121℃下蒸汽灭菌30min。

4)将富集得到的混合菌液接种到上述好氧反硝化细菌分离用BTB培养基，采用稀释涂布平板的方法，从中分离单菌株。平板在30℃恒温培养箱中静置培养，每天观察菌落的生长情况及在菌落周围是否出现蓝色晕圈，将生长良好且出现蓝色晕圈的单菌落作为筛选用菌株。

5)菌体形态观察：扫描电子显微镜(SEM)观察(QUANTA200,USA)。

6)菌株鉴定：16S rDNA基因序列测定。

由此分离出一株好氧反硝化菌株，根据其形态特征及其基因序列在Genbank 中的检索结果，鉴定该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas)。该菌体形态如图1 所示，呈短杆状，大小约为(0.4–0.7)×(0.8–1.6)μm。

实施例2

菌株在高盐(盐度:3％)条件下的脱氮实验

具体实施步骤如下：

将上述反硝化细菌菌株MSD4接种到装有100mL液体反硝化DM培养基 (硝酸钾0.72g/L、琥珀酸钠2.8g/L、氯化钠30g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁1g/L)的250mL锥形瓶中，置于30℃、140r/min摇床中培养，以未接菌的空白培养基作空白对照。接菌后按0h，24h，48h，72h，96h和120h取少量菌液，其中一部分样品用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，以时间为横坐标， OD₆₀₀值为纵坐标绘制反硝化细菌的生长曲线，观察菌株的生长周期。其余部分菌液经10 000rpm离心2min后，取上清液测总氮和COD浓度。根据公式(1) 计算总氮和COD降解率。

降解率(％)＝((C₀-C_t)/C₀)×100％ (1)

其中C₀代表初始浓度，C_t代表某时间(t)时的浓度。

菌株MSD4的成长曲线图及对总氮和COD的去除结果分别如图2和3所示，菌株在高盐条件下生长良好，且对总氮和COD有较好的去除效果。在0–72h 内，菌株处于对数生长期，随后在72–120h内菌株处于生长稳定期(如图2所示)。最终菌株在3％的盐度下对总氮的去除率达到70.2％，对COD的降解率达到82％(如图3所示)。因此，该菌株在高盐条件下有效实现了脱氮过程，同时也对COD有很好的降解效果。

实施例3

菌株在不同盐度条件下的脱氮实验

具体实施步骤如下：

将菌株MSD4接种于盐度(以NaCl计)为3％的反硝化DM培养基中，于 30℃、140r/min的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后，取30mL 菌液接入到新鲜300mL盐度(以NaCl计)为0％、3％、5％、7％、10％和12％的反硝化DM培养基中，初始pH设为7，于30℃、140r/min的摇床中进行振荡培养。未接种菌液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。接菌后于0 h和120h取少量菌液,其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀)，其余部分在10 000rpm下离心2min，取上清液测定总氮浓度。

结果如图4所示，该菌株在盐度0–10％范围内，均可生长且有效去除总氮，其中在盐度为5％时其生长情况及对总氮的去除性能最好，OD₆₀₀为0.695，总氮的去除率达到72.4％。由此可见，该菌株为对高盐有良好耐受能力的耐盐菌，其能够在高盐条件下有效实现氮的去除。

实施例4

菌株在不同pH条件下的脱氮实验

具体实施步骤如下：

将菌株MSD4接种于盐度(以NaCl计)为3％、pH为7的反硝化DM培养基中，于30℃、140r/min的摇床中进行预培养。待菌株生长至对数生长期后，取30mL菌液接入到新鲜的pH已调为4、5、6、7.5、9、11和12的300mL 反硝化DM培养基中，初始盐度设为3％，于30℃、140r/min的摇床中进行振荡培养。未接种菌液的培养基进行同等条件下的实验作为空白对照。接菌后于0 h和120h取少量菌液，其中一部分直接用于测定菌体光密度(OD₆₀₀),其余部分在10000rpm下离心2min，取上清液测定总氮浓度。

结果如图5所示，该菌株在5–11pH范围内，均可生长且有效去除总氮，其中在pH为9时其生长情况及对总氮的去除性能最好，OD₆₀₀为0.57，总氮的去除率达到72.2％，说明该菌株对碱性环境有良好耐受能力。

实施例5

菌株对实际高盐化工废水的脱氮实验

以天津大沽化工有限公司产生的高盐化工废水为例，经测得该废水原始盐度约为3％，pH为9。将菌株MSD4按照10％的接种量接种到该废水中，其中以不接菌的废水作为空白对照。30℃、140r/min的摇床培养120h，接菌后按 0h和120h取少量样品，在10 000rpm下离心2min，取上清液测定总氮浓度和 COD浓度。

具体结果见下表1所示。

表1.接菌与未接菌对废水的处理情况

由表1结果所示，该菌株MSD4对实际高盐化工废水的处理效果优异，对其中的总氮去除率可达到50.9％，同时对废水中的COD也有较好的降解效果，降解率达到60.9％，由此可见，菌株MSD4具有很好的应用潜力。

序列表

<110> 南开大学

<120> 一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌及其应用

<141> 2020-02-26

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1474

<212> DNA

<213> 假单胞菌(Pseudomonas sp.)

<400> 1

cagctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcgg cagcgggtcc 60

ttcgggatgc cggcgagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg 120

gggataactc ggggaaactc gagctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagcggggga 180

tcttcggacc tcgcgctacc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tgaggtaaag 240

gctcaccaag gcgacgatcc gtagctggtc tgagaggatg atcagccaca ctggaactga 300

gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc 360

ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca ctttaagttg 420

ggaggaaggg cagtaagcta ataccttgct gttttgacgt taccgacaga ataagcaccg 480

gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc aagcgttaat cggaattact 540

gggcgtaaag cgcgcgtagg tggtttgata agttggatgt gaaagccccg ggctcaacct 600

gggaattgca tccaaaactg tctgactaga gtatggcaga gggtggtgga atttcctgtg 660

tagcggtgaa atgcgtagat ataggaagga acaccagtgg cgaaggcgac cacctgggct 720

aatactgaca ctgaggtgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc 780

cacgccgtaa acgatgtcga ctagccgttg ggatccttga gatcttagtg gcgcagctaa 840

cgcattaagt cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg 900

ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960

aggccttgac atgcagagaa ctttccagag atggattggt gccttcggga actctgacac 1020

aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga 1080

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tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac ggcctgggct 1200

acacacgtgc tacaatggtc ggtacaaagg gttgccaagc cgcgaggtgg agctaatccc 1260

ataaaaccga tcgtagtccg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag tcggaatcgc 1320

tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccat gggagtgggt tgctccagaa gtagctagtc taaccttcgg ggggacggtt 1440

accacggagt gattcatgac tggggtgaag tcgc 1474

Claims (10)

1.一株耐盐耐碱好氧反硝化细菌，其特征在于：所述细菌为假单胞菌，分类命名为Pseudomonas sp.MSD4。

2.根据权利要求1所述的好氧反硝化细菌，其特征在于：所述假单胞菌菌株的基因序列长度为1474bp。

3.根据权利要求1所述的好氧反硝化细菌，其特征在于：在营养琼脂培养基上30℃培养24–48h后，菌落为淡黄色，呈中间凸起的半透明状圆形菌落，表面光滑湿润，单菌落较小；菌体在扫描电镜下呈短杆状，大小为(0.4–0.7)×(0.8–1.6)μm。

4.一种如权利要求1所述的耐盐耐碱好氧反硝化细菌在高盐废水处理中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述好氧反硝化细菌在好氧条件下对高盐废水进行反硝化。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述好氧反硝化细菌在好氧条件下耐盐度为0％–10％。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述好氧反硝化细菌在好氧条件下耐盐度为5％。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述好氧反硝化细菌在好氧条件下耐受pH为5–11。

9.根据权利要求4所述应用，其特征在于：所述好氧反硝化细菌在好氧条件下耐受pH为9。

10.一种如权利要求1所述的耐盐耐碱好氧反硝化细菌在盐碱性修复中的应用。

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