CN109913382A

CN109913382A - 一种不动杆菌及其应用

Info

Publication number: CN109913382A
Application number: CN201811084608.1A
Authority: CN
Inventors: 李军; 王秀杰; 王维奇; 张晶; 张阳
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2018-09-18
Filing date: 2018-09-18
Publication date: 2019-06-21

Abstract

本发明公开了一株不动杆菌及其应用，该菌命名为不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004，于2018年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCCNo.15414。上述不动杆菌为一株异养硝化好氧反硝化菌，可在同一好氧条件下,以有机碳为碳源进行硝化反硝化,能够分别以氨氮和硝氮为氮源进行生长。本发明的不动杆菌具有耐高浓度氨氮负荷的特性，能够在氨氮浓度为0～2000mg/L条件下进行增殖和代谢。

Description

一种不动杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株不动杆菌(Acinetobactor)及其在废水处理中的应用。该菌株是一株异养硝化好氧反硝化菌,能够在好氧条件下以有机碳为碳源,氨氮或硝酸盐氮为氮源进行生长代谢。此外,该菌株对高浓度氨氮具有很强的耐受性,故在处理高浓度氨氮有机废水领域具有很大的应用潜力。

背景技术

高氨氮废水的治理已经成为废水处理领域,尤其是氨氮产污单元废水处理的一个难点。高氨氮废水的排放主要来源于石化、焦化、合成氨和制革等领域,有些废水的氨氮浓度会超过1000mg/L,部分垃圾渗滤液的浓度会超过3000mg/L,有的甚至会超过10000mg/L。这些废水如果处理不当直接排放到自然界中,会对受纳水体造成严重的污染,从而导致水体富营养化等系列问题。高浓度氨氮废水的处理技术主要有物化处理技术和生物处理技术。由于生物处理技术具有能耗低、处理效果良好、产物无污染等优点,已经被越来越广泛的应用于高氨氮废水处理领域。传统的生物处理技术是基于硝化反硝化的生物脱氮理论,另外几年来还发展了厌氧氨氧化、短程硝化以及它们的组合工艺等新型脱氮理论。这些生物处理工艺大多依赖于自养型的好氧/厌氧菌,由于自养菌世代周期长、生长缓慢、抗冲击能力差、易受外界环境影响等缺点使得传统生物脱氮工艺难以稳定长期运行。

近年来,在废水处理领域,越来越多的异养脱氮菌被研究者发现。这些细菌通常不但具有异养硝化作用而且能够在好氧条件下进行反硝化,即能够在同一好氧条件下,以有机碳为碳源, 进行异养硝化好氧反硝化,从而实现有机氮和氮素的同步去除。这类细菌还具有异养菌特有的世代周期短,增殖速度快,对环境因子具有较强的耐受性等优点。另外研究表明,很大一部分的异养硝化好氧反硝化菌株对高浓度氨氮具有一定的耐受性。Joo等利用异养硝化菌株 Alcaligenes faecalis strain No.4来处理高氨氮的实际养猪废水并取得了很好的处理效果。另外,有学者将异养硝化好氧反硝化菌株Thiosphaera pantotropha等以生物添加的方式投加于 SBR工艺中,并用于处理高盐高氨氮废水,实现了脱氮系统的稳定运行并取得了良好的处理效果。这些脱氮工艺的建立表明,异养硝化好氧反硝化菌株在处理高氨氮废水领域具有巨大的应用潜力和广阔的应用前景。

发明内容

针对现有的生物脱氮技术存在的上述不足,本发明的目的在于提供一种对高浓度氨氮和有机物具有较强耐受性的,并且在完全好氧条件下能够同步去除有机碳和氮源的异养菌株及其用途。

本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供一株不动杆菌，命名为不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004，于2018年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.15414，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

不动杆菌JQ1004为革兰氏阴性菌，该菌为短杆菌，无鞭毛，细菌大小为0.8-0.9μm；在平板上的菌落形态为:白色，圆形，凸起，直径1.5-2mm，无核，表面光滑湿润。

本发明还提供一种不动杆菌在废水处理中应用。

作为优选，在同一好氧条件下，以有机碳为碳源将氨氮彻底转化为氮气及氮的氧化物，并且无羟胺、亚硝酸盐氮以及硝酸盐氮中间产物积累；同时在好氧条件下，以硝酸盐氮为氮源进行生长代谢，将硝酸盐氮转化为气态氮且无氮的中间产物积累。

作为优选，在0～2000mg/L的氨氮浓度条件下进行生长并且能够代谢氨氮，实现氨氮和有机碳的同步去除。

作为优选，在氨氮浓度增加至2500mg/L时菌株的生长被完全抑制。

作为优选，菌株在去除有机碳和氮源时的最佳条件为pH＝7.33，温度为31.80℃，转速为154.54r/min，C/N为7.76。

本发明的不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004及其应用具有以下技术优势：

1.能够实现有机碳和氮源的同步去除。即在好氧条件下,以有机碳为碳源,独立完成将氨氮转化为N₂O或N₂这一过程,且并无亚氮、硝氮、羟胺等中间产物的积累。

2.兼具异养硝化和好氧反硝化的作用。即在同一好氧阶段,独立实现对氨氮、硝氮或亚氮的去除。菌株的这一优势可以解决传统脱氮工艺中需将好氧的自养硝化过程和缺氧的异养反硝化过程分开进行的问题,减少占地面积,从而降低基建费用。

3.对高浓度氨氮具有较强的耐受性,在2000mg/L氨氮浓度的环境中仍能进行生长代谢。菌株的这一特点使得其在降解高氨氮有机废水处理领域具有广阔的应用前景。

4.硝化反硝化由单一菌株独立完成,避免了传统工艺中多种功能菌的协同作用,且反硝化过程产生的碱度能够弥补硝化过程产生的酸度,无需调节pH。另外,异养细菌世代周期短, 生长迅速,将该菌应用于反应器中可缩短启动时间,提高处理效率,避免了传统工艺中自养菌生长缓慢,水力停留时间长等问题。

附图说明

图1是菌株在平板培养基上(a)和扫描电镜下(b)的形态，

图2是菌株和相似菌株的16S rDNA基因序列构建的NJ系统发育树，

图3是菌株对氨氮的降解，

图4是菌株对硝氮的降解，

图5是菌株在不同浓度氨氮条件下的生长曲线，

图6是菌株对不同浓度氨氮的降解(以300,500,700mg/L为例)，

图7菌株对养猪废水中各污染物的降。

具体实施方式

以下结合具体实施案例对发明作进一步说明,但并不局限于此。

实施例1不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004的筛分

菌株分离自北京市高碑店污水处理厂某中试设备的活性污泥样品.

(1)培养基的配置

异养硝化培养基(g/L)：0.47(NH₄)₂SO₄,4.219(CH₂COONa)₂·6H₂O,50mL维氏盐溶液,C/N＝7.5.

反硝化培养基(g/L):0.72KNO₃,4.219(CH₂COONa)₂·6H₂O,50mL维氏盐溶液,C/N＝7.5.

维氏盐溶液(g/L):6.55K₂HPO₄·3H₂O,2.5MgSO₄·7H₂O,2.5NaCl,0.038MnSO₄·H₂O,0.05 FeSO₄·7H₂O.

LB培养基(g/L):10.00胰蛋白胨,5.00酵母提取物,10.00NaCl.

以上培养基中C/N指培养基中TC/TN(w/w).

(2)菌株的分离

采用梯度稀释法分离目标菌株。将10mL活性污泥匀液加入到90mL0.9％的无菌生理盐水中,用无菌玻璃珠将泥样充分打散,使细菌呈单细胞状态悬浮于溶液中。采用梯度稀释法将菌液稀释,稀释度选用10³,10⁴,10⁵,10⁶,10⁷五个梯度。将各浓度梯度的稀释液涂布于异养硝化固体培养基上,放置于生化培养箱中,30℃条件下培养2～3d。待菌落长出后,用接种环挑取生长茁壮的单菌落,并将其接种于液体的异养硝化培养基中继续培养,以验证其脱氮性能,培养条件为30℃、160r/min。摇瓶培养24h后,取菌悬液,10000r/min离心5min后测定上清液中氨氮、硝氮、亚氮的浓度变化,进而挑选出具有显著氨氮去除效果的菌株进行复筛。最终挑选出脱氮效果最好的菌株JQ1004。之后采用平板划线法对筛选出的菌株进行纯化,反复划线纯化5～7代,直至形成均匀单菌落,且无异常菌落出现,最终得到JQ1004的纯菌株。

实施案例2不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004的16S rDNA鉴定

挑取平板培养基上生长良好的单菌落,接种于异养硝化培养基中,160r/min,30℃培养12h 获得菌悬液。取一定量菌液于10000r/min,4℃离心5min获得菌体。将菌体重悬于无菌磷酸缓冲溶液中,再次离心获得菌体,重复三次,清洗菌体中的杂质。将菌体中加入400μL Buffer SCL,在65℃中水浴1h,并每隔10min混匀1次,直至混合液澄清,此时表明菌体已完全裂解。然后离心取上清液进行菌株DNA的提取。DNA的提取采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(上海生工),具体步骤参照说明书。以提取的DNA为模板,采用针对细菌16S rRNA基因的通用引物对27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)为： 10×PCRbuffer 5μL,dNTP(2.5mmol/L)1μL,27F(20μmol/L)和1492R(20μmol/L)各1μL,Taq DNA聚合酶(5U)0.5μL,DNA 0.5μL,加超纯水至50μL。PCR扩增条件为：首先95℃预变性 1.5min；其次95℃变性0.5min,60℃退火0.5min,72℃延伸2min,5个循环；之后95℃变性 0.5min,55℃退火0.5min,72℃延伸2min,5个循环；之后进行15个循环:95℃变性0.5min,50℃退火0.5min,72℃延伸2min；最后60℃延伸10min。将所得的PCR产物进行测序后,利用 BLAST在线程序将测得的序列与Genbank中已有的模式菌株序列进行比对后发现,菌株 JQ1004与Acinetobacter sp.An17相似性在98％以上,结合菌株形态可以初步鉴定JQ1004为不动杆菌.利用Neighbor-joining算法构建系统发育树(见附图2),进一步证明菌株JQ1004 为不动杆菌属(Acinetobacter sp.),命名为Acinetobacter sp.JQ1004.

实施案例3不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004异养硝化好氧反硝化性能的测定

将生长茁壮的单菌落接种于无菌的0.9％生理盐水水中并定容,制备成均匀菌悬液作为接种液,固定接种液OD₆₀₀值约0.5,实验中接种量为2％(v/v)。配置分别以硫酸铵、硝酸钾为唯一氮源的异养硝化培养基和反硝化培养基,探究菌株在不同氮源情况下脱氮性能。培养基的C/N设定为7.5,pH设定为7.0～7.1,培养条件为30℃,160r/min.定时取样测定氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮浓度。得到菌株对氨氮和硝氮的去除规律如附图3和图4所示。从而证明菌株JQ1004同时兼有异养硝化和好氧反硝化的作用。

实施案例4不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004对不同浓度氨氮的耐受性的测定

该案例中所采用的培养基为液体异养硝化培养基,固定C/N为7.5,通过改变硫酸铵的质量改变培养基初始氨氮浓度。菌株对不同浓度氨氮的耐受性的测定实验共设置8个批次,每个批次培养基的初始氨氮浓度分别设定为：100,300,500,900,1000,1500,2000,2500mg/L。每个批次均设置不接种菌液的空白组对位对照。培养时间为48h,培养条件为30℃,160r/min。定时取样测定氨氮浓度及菌悬液的OD₆₀₀值。菌株在不同初始氨氮浓度条件下的生长变化曲线如附图5所示。菌株对不同初始氨氮浓度的降解如附图6所示(以300,500,700mg/L为例)。由此可知,菌株能够在100～2000mg/L氨氮浓度条件下进行生长并代谢氨氮,在氨氮浓度达到 2500mg/L时,菌株活性被完全抑制无法生长。

实施案例5不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004对养猪废水的处理

本实验案例中采用水泡粪方式模拟养猪废水,该污水水质情况主要为：COD平均浓度为4500 mg/L,氨氮平均浓度为500.60mg/L,总氮为560.40mg/L,pH值在7.0左右.将上述菌株JQ1004 的种子培养液作为接种液按照接种量10％接种到猪场废水中,在30℃,160rpm条件下培养2d, 测定处理前后污水COD、氨氮、总氮浓度变化.

由图7可知,经过48h的培养,养猪废水中的COD、氨氮和总氮分别从初始浓度4500mg/L,500.60mg/L,560.40mg/L降解到1385.1mg/L,79.1mg/L,75.22mg/L.菌株对废水中 COD、氨氮和总氮降解速率分别为69.22％,84.20％,86.58％.

Claims

1.一株不动杆菌，其特征在于，命名为不动杆菌(Acinetobactor)JQ1004，保藏编号为CGMCCNo.15414。

2.一种如权利要求1所述的不动杆菌在废水处理中应用。

3.如权利要求1所述的不动杆菌在废水处理中应用，其特征在于，在同一好氧条件下，以有机碳为碳源将氨氮彻底转化为氮气及氮的氧化物，并且无羟胺、亚硝酸盐氮以及硝酸盐氮中间产物积累；同时在好氧条件下，以硝酸盐氮为氮源进行生长代谢，将硝酸盐氮转化为气态氮且无氮的中间产物积累。

4.如权利要求3所述的不动杆菌在废水处理中应用，其特征在于，在0～2000mg/L的氨氮浓度条件下进行生长并且能够代谢氨氮，实现氨氮和有机碳的同步去除。

5.如权利要求3所述的不动杆菌在废水处理中应用，其特征在于，在氨氮浓度增加至2500mg/L时菌株的生长被完全抑制。

6.如权利要求3所述的不动杆菌在废水处理中应用，其特征在于，菌株在去除有机碳和氮源时的最佳条件为pH＝7.33，温度为31.80℃，转速为154.54r/min，C/N为7.76。