CN103497905A - 一种高效脱氮产絮菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效脱氮产絮菌株，其保藏名为不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14），于2013年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC No.M2013247。本发明还涉及一种高效脱氮产絮菌株的应用。本高效脱氮产絮菌株具有良好的异氧硝化、好氧反硝化以及去除实际生活污水中COD、氨氮和TN的能力，并能利用发酵培养基或替代培养基发酵产絮。菌株在在异氧硝化和反硝化体系中，对氨氮、总氮的去除率极高；对生活污水和猪场废水COD、氨氮、TN和TP的去除率极高；菌株发酵液投加到高岭土悬浊液中，其絮凝率极高。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效脱氮产絮菌株，具体涉及一种不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）新菌株。
背景技术
随着工农业生产的发展和人民生活水平的提高，含氮化合物的排放量急剧增加，已成为环境的主要污染源，引起各界的关注。氨态氮是水相环境中氮的主要形态，是引起水体富营养化和环境污染的一种重要污染物质。地表水中的氨氮已经逐步成为最主要的污染项目，甚至超过化学需氧量成为影响地表水环境质量的首要指标。对于水体而言，《国家环境保护“十二五”规划》在继续降低COD排放量的基础上将氨氮也加入约束性指标进行总量控制。因此，加强污水脱氮技术及理论研究显得尤为迫切。
目前，污水生物脱氮法与物理、化学法相比较，以它高效率、低成本、无二次污染等不可比拟的优点已被人们所广泛认可，成为水处理领域关注和研究的主要内容。传统生物脱氮理论认为生物除氮需要经历硝化反应和反硝化反应两个阶段。硝化和反硝化两个过程需要在两个隔离的反应器中进行，或在时间、空间上造成交替缺氧和好氧环境的同一个反应器中进行。因此，以传统硝化—反硝化为基础的生物脱氮工艺需设置多个反应器，如后置反硝化A/O、A2/O以及改进的UCT、JBH、AAA等。这些传统脱氮工艺在废水处理方面起到了一定的作用，但存在一些缺陷：①工艺流程复杂，且硝化菌群生长速度慢难以 维持较高的生物量；②硝化过程需在氧气存在的条件下完成，因而对氧的消耗大；③硝化过程还产生大量的酸，需要投加碱予以中和，增加了运行费用。目前，随着经济的发展和人们饮食结构的变化，低C/N比城市污水日益增多，特别是在南方城市中，对于低C/N比城市污水，按原有设计水质运行的二级污水处理厂大多数不能达标排放，使污水厂资源和资金浪费较大。如何以最低代价提高低C/N比城市生活污水的脱氮去除效果，已成为目前污水生物脱氮技术研究的热点和难点。
近年来，国内外已经有文献关于一些好氧反硝化菌同时兼具硝化性能的报道，该菌种可以将NH4 +～N直接转变成气态氮从水体中直接排出，这种菌具有很高的利用价值，有助于解决传统生物脱氮工艺启动时间长，要求条件苛刻以及硝化与反硝化不能同时在一个反应器中进行等缺点。随着越来越多的好氧反硝化菌从自然界或人工系统中被筛选出来，揭示了好氧反硝化细菌存在的广泛性和在自然界氮循环中存在的意义重大，对这种现象展开持续而深入的研究，可以对自然界中的氮循环过程的认识上升到一个新的高度，并增强人类对脱氮过程的控制能力，为废水的生物脱氮处理带来更广阔的前景。利用好氧反硝化菌强化污水生物脱氮具有以下几个优点：使硝化～反硝化反应在同一个反应器中进行，可以大大减少占地面积和建设资金，提高污水脱氮去除效果；好氧反硝化细菌可以减少处理过程中加入调节系统pH的化学物质，降低成本等。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种高效脱氮产絮菌株及其应用。
本高效脱氮产絮菌株保藏名为不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14），于2013年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC No.M2013247。
本高效脱氮产絮菌株应用于生活污水、高氨氮有机废水高效脱氮以及利用发酵培养基或替代培养基生产生物絮凝剂。
所述高效脱氮产絮菌株应用于处理污水的方法为，挑取不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落，于异养硝化培养基中活化培养20～24h，然后取其活化液，按照体积比1～5%的比例接种到待处理污水中，在30℃、160～220rpm下培养12～24h。
每升所述异养硝化培养基中含有(NH4)2SO40.25～0.50g、琥珀酸钠2.80～5.60g、维氏盐溶液50.00mL，其pH值为7.0～7.5；其中，每升所述维氏盐溶液中含有K2HPO45.00g，FeSO4·7H2O0.05g，NaCl2.50g，MgSO4·7H2O2.50g，MnSO4·4H2O0.05g。
所述高效脱氮产絮菌株生产絮凝剂的方法为，挑取不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落，于异养硝化培养基中活化培养20～24h，然后取其活化液，按照体积比1～5%的比例接种到发酵培养基或替代培养基中，在30℃、160～220rpm下培养24～48h。
每升所述发酵培养培养基中含有蔗糖4～40g、草酸铵0.50～1.33g、K2HPO43g、KH2PO42g、NaCl0.10g、MgSO4·7H2O0.10g、水1000mL，pH=7.0；
所述替代培养基为每升猪场废水中外加K2HPO41.20～1.60g、KH2PO40.60～1.20g，pH=7.0。
新菌株的鉴定
DNA提取：
将异养硝化菌接种于LB液体培养基中过夜培养18～24h，取适量细菌悬液采用TIANamp Bacteria细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，提取出的DNA即可用于下游的分子生物学实验或冷冻保存于冰箱中备用。扩增引物选用一对通用引物27f和1492r。
27f 5’～AGAGTTTGATCATGGCTCAG～3’
1492r 5’～TACGGTTACCTTGTTACGACTT～3’
反应体系为50μL，加入1μL模板DNA（0.1μg），1μL P1和P2（终浓度为0.5μM），1μLdNTP（每种NTP0.2mM），12.5μL2×Taq PCR Mastermix和34.5μL ddH2O。PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min，经30个循环后72℃延伸10min，4℃终止扩增反应。用1.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。
16S rDNA测序：
将TN-14的16S rDNA的扩增产物进行序列测序。采用BLAST，将获得的16S rDNA片段序列。
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<210> 1
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<220>
<221> misc_feature
<222>
<400> 1
GGCCTTGGCGGGCGGCTTACACATGCAAGTCGAGCGGGGGAGATTGCTT
CGGTGATTGAC 60
CTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACTTAGGAATCTGCCTATTAATGGGGG
ACAACATCTC 120
GAAAGGGATGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATC
ACTTGTGACCT 180
TGCGTTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGG
CCTACCAAGG 240
CGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGA
GACACGGCCCA 300
GACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACC
CTGATCCAGCC 360
ATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGA
GGAGGAGGCTC 420
TCTTGGTTAATACCCAAGAAGAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACC
GGCTAACTCTG 480
TGCCAGCAGCCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTA
CTGGGCGTAAA 540
GCGTGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACT
TGGGAATTGC 600
ATTCGATACTGGGAAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGT
GTAGCGGTGA 660
AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGC
CTAATACTGAC 720
GCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAG
TCCATGCCGTA 780
AACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTA
ACGCGATAAG 840
TAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGA
CGGGGGCCCGC 900
ACAAGCGGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTT
ACCTGGGTCTT 960
GACATAGTAAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACA
TACAGGTGCT 1020
GCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA
CGAGCGCAAC 1080
CCTTTTCCTTATTTGCCAGCACTTCGGGTGGGAACTTTAAGGATACTGCC
AGTGACAAAC 1140
TGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGG
GCTACACACGT 1200
GCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTAGCGATAGGATGCTAATC
TCAAAAAGCC 1260
GATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATC
GCTAGTAATC 1320
GCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG
CCCGTCACACC 1380
ATGGGAGTTTGTTGCACCAGAAGTAGGTAGTCTAACCGTAAGGAGGACG
CTACCATCGGG 1440
TGCCCGAATTGGTC 1454
将本菌株TN-14的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较发现，本菌株TN-14与鲍式不动杆菌（Acinetobacter baumannii）多个菌株的同源性高达98～99%以上。综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，可确定本菌株TN-14属鲍式不动杆菌（Acinetobacter baumannii），名为不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）（即本脱氮产絮菌株）。
不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）为新菌株，已于2013年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO.M2013247。
查阅资料，尚未见鲍式不动杆菌属有关实际生活污水及高氨氮猪场废水条件下脱氮、产絮性能的具体报道。
本发明一种高效脱氮产絮菌株具有良好的异氧硝化、好氧反硝化以及去除实际生活污水和猪场废水中COD、氨氮和TN的能力。菌株在24小时内，在异氧硝化体系中，对氨氮、总氮的去除率分别达到97.13%和93.53%；在反硝化体系中，对硝态氮、总氮的去除率分别达到56.75%和58.28%；在12小时之内，对生活污水中的COD、氨氮和TN的去除率分别达到76.10%，96.53%和96.65%，尤其适于应用在污水处理领域；在24小时之内，对高氨氮猪场废水中的COD、氨氮、TN和TP的去除率分别达到85.3%，59.03%，58.9%和79.2%。
附图说明
下面结合附图对本发明一种高效脱氮产絮菌株及其应用作进一步说明：
图1是本高效脱氮产絮菌株扫描电镜照片；
图2是本高效脱氮产絮菌株的异养硝化脱氮能力图；
图3是本高效脱氮产絮菌株的好氧反硝化脱氮能力图；
图4是本高效脱氮产絮菌株耐高氨氮能力图。
具体实施方式
实施例1：本高效脱氮产絮菌株的获得
取序批式生物反应器（SBR）系统内的适量污泥，接种于异养硝化培养基中培养，1～2d后再转接于好氧反硝化培养基进行反硝化培养，1～2d后取细菌悬液0.5～1mL，用灭菌蒸馏水进行梯度稀释，取10μL稀释倍数为103～1010倍的细菌悬液分别在BTB分离培养基上进行平板涂布，培养2～5d后，挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的菌落作为初筛菌；在新鲜的BTB分离培养基上进行重复划线以获得纯的单菌株，并对其进行形态观察，如图1所示。取18～24h的细菌培养液以1：2体积比分装于含甘油的基本培养基中，做好标记，置于-20℃下进行冷冻保存。
实施例2：本高效脱氮产絮菌株脱氮产絮性能
1）脱氮性能
（1）异氧硝化能力：取不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落，按照体积比1～5%的比例接种到异养硝化培养基内，30℃，160～220rpm下振摇培养48h，间隔6h检测培养液中菌体生长量OD600、氨氮、硝态氮、亚硝态氮和TN浓度变化。如图2所示，经测试计算，菌株在24小时内，对氨氮、总氮的去除率分别达到97.13%和93.53%，基本无硝态氮和亚硝态氮的积累。
（2）好氧反硝化能力：取不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14） 单菌落，按照体积比1～5%的比例接种到以NO3 --N和NO2 --N的反硝化培养基中，160～220rpm下振摇培养48h，间隔6h检测培养液中菌体生长量OD600以及NO3 --N、NO2 --N和TN的浓度变化。如图3所示，经测试计算，菌株在24小时内，对硝态氮、总氮的去除率分别达到56.75%和58.28%，反硝化过程中，基本无亚硝态氮积累，其含量极低，在0.098～0.740mg/L变化。
2）产絮性能
取不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落，按照体积比1%的比例接种到发酵培养基或替代培养基中，160～220rpm下振摇培养24h，取其上清液按照体积比为0.5～1.0：100投加到4g/L的高岭土悬浊液中，1%CaCl2溶液做助凝剂，pH值为7.0，快速220r/min，1min；慢速80r/min，30s进行搅拌，静置10min后，吸取上清液以蒸馏水作空白于721型分光光度计在550nm处测定其吸光度。絮凝率计算公式为：
式中，A为对照样上清液在550nm处的吸光度；B为絮凝后上清液在550nm处的吸光度。经测试计算，絮凝率可达94.74%。
实施例3：本高效脱氮产絮菌株应用于处理生活污水的具体操作
挑取不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落，于异养硝化培养基中活化培养20～24h，然后取其活化液，按照体积比1～5%的比例接种到待处理污水中，在30℃、160～220rpm下培养12～24h。所述待处理污水 [COD]=250～400mg/L；[NH4 +～N]=25～55mg/L，[TN]=30～60mg/L，[TP]=3.0～8.0mg/L。
测定处理前后污水COD浓度变化。经测试计算，在12小时之内对实际生活污水中的COD、氨氮和TN的去除率分别达到76.10%、96.53%和96.65%。
实施例4：本高效脱氮产絮菌株耐高氨氮能力的具体操作
将不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落按照体积比1～5%的比例，接种到不同氨氮浓度的异养硝化培养基内，30℃，160～220rpm下振摇培养60h，每4～6h检测培养液中菌体生长量OD600，菌株耐受氨氮的能力结果，如图4所示。菌株在氨氮浓度为250～1200mg/L（C/N=4:1）下生长良好。
实施例5：本高效脱氮产絮菌株应用于处理猪场废水的具体操作
将不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落按照体积比1～5%的比例于异养硝化培养基中活化培养20～24h，然后取其活化液，按照体积比1～5%的比例接种到实际养猪废水中，30℃，160rpm下培养1～2d。测定处理前后污水COD、氨氮、总氮、硝态氮、亚硝态氮以及TP的浓度变化。实际养猪废水：[COD]=4000～5000mg/L；[NH4 +-N]=600mg/L，[TN]=630～700mg/L，[TP]=20～40mg/L。
测定处理前后废水COD、氨氮、TN和TP浓度变化。经测试计算，在20～24小时之内对猪场废水COD、氨氮、TN和TP的去除率分别达到85.3%、59.03%，58.9%和79.2%。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用， 对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种高效脱氮产絮菌株，其特征是：该高效脱氮产絮菌株保藏名为不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14），于2013年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC No.M2013247。
2.一种高效脱氮产絮菌株的应用，其特征是：该高效脱氮产絮菌株为权利要求1所述的高效脱氮产絮菌株；其应用于处理生活污水和高氨氮猪场废水的脱氮以及利用发酵培养基或替代培养基生产生物絮凝剂。
3.根据权利要求2所述的高效脱氮产絮菌株的应用，其特征是：所述高效脱氮产絮菌株应用于处理污水的方法为，挑取不动杆菌属TN-14（Acinetobacter sp.TN-14）单菌落，于异养硝化培养基中活化培养20～24h，然后取其活化液，按照体积比1～5%的比例接种到待处理污水中，在30℃、160～220rpm下培养12～24h。
4.根据权利要求2所述的高效脱氮产絮菌株的应用，其特征是：每升所述发酵培养培养基中含有蔗糖4～40g、草酸铵0.50～1.33g、K2HPO43g、KH2PO42g、NaCl0.10g、MgSO4·7H2O0.10g、水1000mL，pH=7.0；所述替代培养基为每升猪场废水中外加K2HPO41.20～1.60g、KH2PO40.60～1.20g，pH=7.0。
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