CN110468078A

CN110468078A - 一株莱茵海默氏菌hnad-02及其在废水脱氮中的应用

Info

Publication number: CN110468078A
Application number: CN201910797867.7A
Authority: CN
Inventors: 曹刚; 王萌萌; 张迪; 莫测辉; 潘涌璋
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2019-11-19
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110468078B

Abstract

本发明公开了一株莱茵海默氏菌HNAD‑02及其在废水脱氮中的应用。本发明首次分离得到了一株降解废水中氨氮、硝态氮和COD的效果非常显著的菌株莱茵海默氏菌HNAD‑02，该菌株已于2019年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60714。该菌株通过投加碳源可以对水体中氨氮进行异养硝化，同时对水体中硝态氮进行好氧反硝化，对氨氮的去除率高达92％，硝态氮的去除率高达86％，COD的去除率高达92％，且在脱氮的过程中不积累亚硝态氮，避免了二次污染。另外，利用该菌株进行废水脱氮的方法简单，可重复性好，在污水处理中具有很好的推广应用前景。

Description

一株莱茵海默氏菌HNAD-02及其在废水脱氮中的应用

技术领域

本发明属于微生物脱氮技术领域。更具体地，涉及一株莱茵海默氏菌HNAD-02及其在废水脱氮中的应用。

背景技术

由于经济的快速发展，导致河流地表水系统中氮营养盐的过量输入，超出了水体自净能力，进而造成水体氮污染的水体氮污染。传统的生物脱氮技术主要有好氧硝化和厌氧反硝化两个独立的过程，硝化和反硝化不能同时发生，只能序列式进行，导致了脱氮过程的不连续性和效率低下，大大限制了传统生物脱氮技术的应用和发展。

近年来，异养硝化-好氧反硝化菌的发现大大提高了脱氮效率。异养硝化-好氧反硝化菌具有显著的优势，例如，异养硝化-好氧反硝化菌可以在同一空间内进行硝化和反硝化，可有效节约反应空间，缩短水力停留时间；另外，异养硝化-好氧反硝化菌具有生长速率快、耐高有机负荷、环境适应性强等优点。因此，异养硝化-好氧反硝化菌具有广泛的应用前景，广泛受到人们关注。

目前，国内外对异养硝化-好氧反硝化菌的研究取得了一定成果，能够异养硝化-好氧反硝化的菌属有人苍白杆菌属(Ochrobactrum anthropi)、粪产菌属

(Alcaligenes faecalis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、泛养硫球菌属(Thiosphaera pantotropha)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、雷氏普罗威登斯菌(Providenciarettgeri)和嗜吡啶红球菌属(Rhodococcus pyridinivorans)等，以上异养硝化-好氧反硝化菌均在污水处理方面具有广泛的应用价值。因此，筛选更多、更优质的兼具异养硝化-好氧反硝化功能的菌株，对提高废水的脱氮效率具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有水体氮污染严重和传统的生物脱氮技术的缺陷和不足，提供一株莱茵海默氏菌HNAD-02及其在废水脱氮中的应用。

本发明的目的是提供一株莱茵海默氏菌(Rheinheimera sp.)HNAD-02。

本发明另一目的是提供莱茵海默氏菌在废水脱氮的应用。

本发明又一目的是提供莱茵海默氏菌在制备废水脱氮微生物菌剂中的应用

本发明再一目的是提供一种废水脱氮的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明经过长期的筛选和分离，研究发现，莱茵海默氏菌具有同时降解废水中的氨氮、硝态氮和COD的作用，可应用于废水脱氮和制备废水脱氮微生物菌剂，从广州市猎德污水处理厂好氧段活性污泥成功分离得到的莱茵海默氏菌(Rheinheimera sp.)HNAD-02，降解废水中氨氮、硝态氮和COD的效果非常显著，该菌株已于2019年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60714，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明首先提供了一株莱茵海默氏菌(Rheinheimera sp.)HNAD-02，该菌株已于2019年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60714。

本发明的莱茵海默氏菌HNAD-02是首次分离出来的一株异养硝化-好氧反硝化菌，兼具异养硝化和好氧反硝化菌功能，该菌株通过投加碳源可以对水体中氨氮进行异养硝化，同时对水体中硝态氮进行好氧反硝化，且在脱氮的过程中不积累亚硝态氮，避免了二次污染。该菌株丰富了脱氮菌株的资源库，且在废水处理方面具有极大的应用价值。

因此，莱茵海默氏菌在废水脱氮的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述应用为莱茵海默氏菌在降解废水中的氨氮、硝态氮和/或COD中的应用。

莱茵海默氏菌在制备废水脱氮微生物菌剂中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述莱茵海默氏菌为莱茵海默氏菌HNAD-02。

另外，本发明还提供了一种废水脱氮的方法，将所述莱茵海默氏菌HNAD-02接种于废水中，在25℃～35℃、100～140r/min的条件下处理废水12～78h。

优选地，在30℃、120r/min的条件下处理废水72～78h。

更优选地，在30℃、120r/min的条件下处理废水72h。

优选地，所述废水中氨氮的浓度为100～300mg/L。

更优选地，所述废水中氨氮的浓度为200mg/L。

优选地，所述废水中硝态氮的浓度为100～300mg/L。

更优选地，所述废水中硝态氮的浓度为200mg/L。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株莱茵海默氏菌HNAD-02及其在废水脱氮中的应用。本发明经过大量的探索，首次筛选分离得到了一株莱茵海默氏菌HNAD-02，该菌株具有显著的同时降解废水中的氨氮、硝态氮和COD的作用，利用该菌株可以对废水中氨氮进行异养硝化，同时对废水中硝态氮进行好氧反硝化，对氨氮的去除率高达92％，硝态氮的去除率高达86％，COD的去除率高达92％，且在脱氮的过程中不积累亚硝态氮，避免了二次污染。另外，利用该菌株进行废水脱氮的方法简单，可重复性好，在污水处理中具有十分广泛的应用前景。

附图说明

图1是菌株在SEM扫描电镜下的形态结构图。

图2是菌株的系统发育树结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例中用到的培养基配方如下：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0～7.5。

异养硝化培养基：NH₄Cl 0.76g/L，柠檬酸三钠6.54g/L，维氏盐50mL/L，pH 7.0～7.5。

好氧反硝化培养基：KNO₃ 1.44g/L，柠檬酸三钠6.54g/L，维氏盐50mL/L，pH 7.0～7.5。

维氏盐：K₂HPO₄ 5.00g/L，NaCl 2.50g/L，MgSO₄·7H₂O 2.50g/L，FeSO₄·7H₂O0.05g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05g/L。

实施例1莱茵海默氏菌(Rheinheimera sp.)HNAD-02的分离与鉴定

一、菌株分离与筛选

1、驯化和富集：实验污泥来自广州市猎德污水处理厂好氧段活性污泥，取充分混合的活性污泥10g，分别置于装有100mL硝化培养液和反硝化培养液的锥形瓶中，放置于摇床中，设置温度为28℃，转速为120r/min，驯化以3d为一周期。每周期结束后，将瓶中培养液静置片刻，倒掉上清液，再重新加入新鲜培养液各100mL进行驯化，得到驯化液。期间检测氨氮和硝态氮的去除情况。

2、分离纯化：用无菌水将1mL以得到的驯化液梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，然后分别涂布在异养硝化和好氧反硝化平板培养基上，置于生化培养箱中30℃培养3d，从中挑选形态各异的单菌落，用平板划线法分别在异养硝化和好氧反硝化固体培养基上划线，在同一条件下培养3d。然后，再挑选单菌落进行重复划线，直到获得纯化后的单克隆菌株。

3、菌株筛选：将以上得到的单克隆菌株接种至灭菌后的LB培养基中，置于摇床中在28℃、120r/min的条件下培养24h，在6000r/min条件下离心5min，收集菌体，用无菌水重悬菌体为OD₆₀₀为0.8～1.0的菌悬液。然后按10％的接种量分别接种于装有适量异养硝化和好氧反硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、120r/min摇床培养，实验设3个平行，同时设置未接菌的对照组，分别于12h、24h、36h、48h、60h和72h测定培养液中NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的含量。从中分别选出具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株。

4、同时硝化反硝化能力的测定：将分别具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株接种至灭菌后的LB培养基中，在28℃、120r/min条件下摇床培养24h后，于6000r/min离心5min收集菌体，用无菌水重悬菌体至OD₆₀₀为0.8～1.0的菌悬液，按10％的接种量分别接种至装有适量好氧反硝化和异养硝化培养液的锥形瓶中，置于28℃、120r/min下摇床培养，实验设3个平行，每隔12h取上清液测NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的含量。

二、单克隆菌株的形态学和生理生化特征鉴定

1、实验方法

(1)用革兰氏染色试剂盒对上述得到的单克隆菌株进行革兰氏染色，鉴定该菌株为革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌；

(2)进行氧化酶实验和接触酶实验；

(3)用透射电镜观察单克隆菌株的形态。

经革兰氏染色试剂盒鉴定，该菌株为革兰氏阴性；氧化酶实验呈阳性、接触酶实验呈阳性。菌株在SEM扫描电镜下的形态结构图如图1所示，可以看出，该菌株为杆状。

三、单克隆菌株的分子生物学鉴定

1、实验方法

应用常规方法对单克隆菌株的16S rDNA基因进行测序。

2、实验结果

单克隆菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，将其16S rDNA序列进行同源性比对，构建得到的菌株的系统发育树结果图如图2所示。综合菌株的形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定结果，判断该菌株属于Rheinheimera sp.，命名为莱茵海默氏菌(Rheinheimera sp.)HNAD-02，并于2019年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60714，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2莱茵海默氏菌HNAD-02对氨氮进行异养硝化的性能测定

1、实验方法

配制氨氮浓度为200mg/L的异养硝化培养基，将莱茵海默氏菌HNAD-02扩大培养后，在6000r/min条件下离心5min，收集菌体，用无菌水重悬菌体为1g/L，然后按10％的接种量接种于含100mL的异养硝化培养基三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养78h，取样测定上清液中NH₄ ⁺-N(氨氮)、TN(总氮)、NO₃ ^-N(硝态氮)、NO₂ ^--N(亚硝态氮)、COD和OD₆₀₀值。

2、实验结果

莱茵海默氏菌HNAD-02对氨氮进行异养硝化的性能测定结果如表1所示，可以看出，莱茵海默氏菌HNAD-02经过12h的生长后进入对数生长期，24h～48h为稳定生长期，48h后进入衰亡期；在莱茵海默氏菌HNAD-02生长的同时，对氨氮的去除率高达92％，对总氮的去除率高达85％，对COD的去除率高达92％，且在脱氮的过程中，无硝态氮、亚硝态氮的产生，避免了二次污染。

表1莱茵海默氏菌HNAD-02对氨氮进行异养硝化的性能测定结果

实施例3莱茵海默氏菌HNAD-02对硝态氮进行好氧反硝化的性能测定

1、实验方法

将莱茵海默氏菌HNAD-02扩大培养后，在6000r/min条件下离心5min，收集菌体，用无菌水重悬菌体至1g/L，然后按10％的接种量接种于含100mL的好氧反硝化培养基的三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养78h，分别定期取样测定上清液中NO₃ ^-N(硝态氮)、TN(总氮)、NO₂ ^--N(亚硝态氮)、COD和OD₆₀₀值。

2、实验结果

莱茵海默氏菌HNAD-02对硝态氮进行好氧反硝化的性能测定结果如表2所示，可以看出，莱茵海默氏菌HNAD-02以NO₃ ^-N作为唯一氮源时，经过12h的生长后进入对数生长期，24h～36h为稳定生长期，36h后进入衰亡期；在莱茵海默氏菌HNAD-02生长的同时，对硝态氮的去除率高达86％，对总氮的去除率高达85％，对COD的去除率高达89％，且在脱氮的过程中，无亚硝态氮产生，避免了二次污染。

表2莱茵海默氏菌HNAD-02对硝态氮进行好氧反硝化的性能测定结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一株莱茵海默氏菌HNAD-02及其在废水脱氮中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1373

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

cggggacttc ggtcctagcg gcggacgggt gagtaatgta tagggagctg cccgacagag 60

ggggatacca gttggaaacg actgttaata ccgcataacg tctacggacc aaagtatggg 120

accttcgggc catatgctgt cggatgcacc tatatgggat tagctagttg gtggggtaat 180

ggctcaccaa ggcgacgatc cctagctggt ttgagaggat gatcagccac actggaactg 240

agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgcaag 300

cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc actttcagcg 360

gggaggaagg ggttgttgtt aatagtaaca atctttgacg ttacccgcag aagaagcacc 420

ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac 480

tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggtatgtt aagttggatg tgaaagcccc gggctcaacc 540

tgggaattgc attcaagact ggcatgctag agtatgtgag aggggggtag aattccaagt 600

gtagcggtga aatgcgtaga gatttggagg aataccagtg gcgaaggcgg ccccctggca 660

caatactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 720

ccacgccgta aacgatgtct actagctgtt cgtggtcttg tactgtgagt agcgcagcta 780

acgcactaag tagaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa atgaattgac 840

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga cgcaacgcga agaaccttac 900

ctactcttga catctacaga agattgcaga gatgcgattg tgccttcggg aactgtaaga 960

caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg 1020

agcgcaaccc ttatccttag ttgccagcac gtgatggtgg gaactctagg gagactgccg 1080

gtgataaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc 1140

tacacacgtg ctacaatggt acgtacagag ggaggcaagc tggcgacagt gagcggatct 1200

cataaagcgt atcgtagtcc ggattggagt ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg 1260

ctagtaatcg tggatcagaa tgccacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1320

cgtcacacca tgggagtggg ttgcaaaaga agtaggtagc ttaaccttcg gga 1373

Claims

1.一株莱茵海默氏菌(Rheinheimera sp.)HNAD-02，其特征在于，该菌株已于2019年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCCNO：60714。

2.莱茵海默氏菌在废水脱氮的应用。

3.莱茵海默氏菌在制备废水脱氮微生物菌剂中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为莱茵海默氏菌在降解废水中的氨氮、硝态氮和/或COD中的应用。

5.根据权利要求2～4任一所述的应用，其特征在于，所述莱茵海默氏菌为权利要求1所述莱茵海默氏菌HNAD-02。

6.一种废水脱氮的方法，其特征在于，将权利要求1所述莱茵海默氏菌HNAD-02接种于废水中，在25℃～35℃、100～140r/min的条件下处理废水12～78h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述废水中氨氮的浓度为100～300mg/L。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述废水中硝态氮的浓度为100～300mg/L。