CN107988125A - 一株耐低温硝化细菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株耐低温硝化细菌及其应用，本发明涉及一株耐低温硝化细菌及其应用。本发明的目的是要解决现有脱氮菌不适宜于低温水体的问题。本发明的一株耐低温硝化细菌为莫氏假单胞菌Pseudomonas mohnii.M‑8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2017年11月20日，保藏编号为：CGMCC No.14936。本发明的应用是指在低温水体处理上的应用。本发明耐低温硝化细菌在2℃，好氧状态下，初始氨氮浓度为50mg/L的情况下，该菌NH4 +‑N,的去除率为92％。本发明应用于环境微生物技术领域。

Description

一株耐低温硝化细菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株耐低温硝化细菌及其应用。
背景技术
氮是自然界水体中一种常见的污染物，过度的氮元素的积累会造成水环境富营养化和藻的加速生长，引起赤潮并导致水体水质恶化，使得水生生物大量死亡。水中的氮污染主要来源是生活污水，工业污水和农业废水。传统的生物除氮工艺主要采用自养细菌来对污水中的氨氮进行自养硝化去除。但是传统的自养细菌对于温度要求比较苛刻，当温度降低10℃以下时，自养细菌的生长和新陈代谢都将受到极大的抑制。
近年来，异养硝化细菌由于其高效的脱氮能力，以及相比于自养硝化细菌对于极端环境的更强的适应能力，越来越吸引广大研究者的目光。特别是针对于低温水体，很多科研机构已经筛选出了多种异养硝化细菌。但筛选出的异养硝化细菌可耐受的低温大多集中在10℃左右，并不符合北方冬季实际污水的温度。在我国北方地区冬季的气温常常降低至零下20度以上，进入污水厂中的污水温度也在5摄氏度左右，常常需要对污水进行加温预处理才能达到传统生物处理工艺所需温度。因此，筛选出高效的，能够在超低温下进行脱氮的微生物，并提高低温下生物脱氮技术的处理效能，对冬季污水，特别是北方地区的实际污水处理，是具有十分重要的实际意义的。
发明内容
本发明的目的是要解决现有脱氮菌不适宜于低温水体的问题，提供了一株耐低温硝化细菌及其应用。
本发明的一株耐低温硝化细菌为莫氏假单胞菌Pseudomonas mohnii.M-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2017年11月20日，保藏编号为：CGMCC No.14936。
本发明的一株耐低温硝化细菌的应用是指在低温水体脱氮上的应用。
本发明采用对松花江水进行处理的中式反应器中填料所筛选出的高效耐低温硝化细菌，经鉴定为革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，生长温度为2-35℃，最适温度为25-30℃，菌体长度为1-1.5μm，宽度为0.5-1μm，呈短杆状，无芽孢。菌落呈半径为1-2mm乳白色半透明规则圆形，湿润有光泽。
Pseudomonas mohnii.M-8的DNA提取采用CTAB法。PCR扩增16S rDNA基因，采取16SrDNA基因的通用引物。PCR扩增产物经纯化后直接进行双向测序。将该序列输入GenBank,用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Pseudomonas mohnii的16SrDNA序列相似性较高，为假单胞菌属。根据16SrDNA基因的系统发育结果分析以及生理生化特征，该细菌为莫氏假单胞菌(Pseudomonas mohnii)一株菌株。
本发明采用对松花江水进行处理的中式反应器中填料所筛选出的高效耐低温硝化细菌Pseudomonas mohnii.M-8，该菌株可在2℃条件下对以NH4 +-N为氮源的富营养水体进行脱氮处理。初始N浓度为50mg/L左右，接种浓度为4×108cfu/ml，初始OD600约为0.2-0.3，脱氮过程中无亚硝酸盐积累。Pseudomonas mohnii.M-8可在2-35℃生长，在好氧状态下实现硝化反应。在2℃，好氧状态下，初始氨氮浓度为50mg/L的情况下，该菌NH4 +-N,的去除率为92％，在氨氮降低的过程中，没有亚硝态氮和硝酸盐态氮的积累，说明该细菌能直接将氨氮转化成氮气等气体。相比其他耐低温菌种，该菌种具有适应更低温度，脱氮效率更高等优点。
附图说明
图1为Pseudomonas mohnii M-8的低温氨氮去除能力检测结果图；其中a为氨氮，b为细菌浓度；
图2为Pseudomonas mohnii M-8的生长适宜碳源试验图；
图3为Pseudomonas mohnii M-8的生长适宜pH试验图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一株耐低温硝化细菌为莫氏假单胞菌Pseudomonas mohnii.M-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2017年11月20日，保藏编号为：CGMCCNo.14936。
本实施方式采用对松花江水进行处理的中式反应器中填料所筛选出的高效耐低温硝化细菌，经鉴定为革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，生长温度为2-35℃，最适温度为25-30℃，菌体长度为1-1.5μm，宽度为0.5-1μm，呈短杆状，无芽孢。菌落呈半径为1-2mm乳白色半透明规则圆形，湿润有光泽。
Pseudomonas mohnii.M-8的DNA提取采用CTAB法。PCR扩增16S rDNA基因，采取16SrDNA基因的通用引物。PCR扩增产物经纯化后直接进行双向测序。将该序列输入GenBank,用Blast软件与数据库序列进行比对分析，结果表明与Pseudomonas mohnii的16SrDNA序列相似性较高，为假单胞菌属。根据16SrDNA基因的系统发育结果分析以及生理生化特征，该细菌为莫氏假单胞菌(Pseudomonas mohnii)一株菌株，命名为Pseudomonas mohnii.M-8。
本实施方式采用对松花江水进行处理的中式反应器中填料所筛选出的高效耐低温硝化细菌Pseudomonas mohnii.M-8，该菌株可在2℃条件下对以NH4 +-N为氮源的富营养水体进行脱氮处理。初始N浓度为50mg/L左右，接种浓度为4×108cfu/ml，初始OD600约为0.2-0.3，脱氮过程中无亚硝酸盐积累。相比其他耐低温菌种，该菌种具有适应更低温度，脱氮效率更高等优点。
具体实施方式二：本实施方式一株耐低温硝化细菌的应用是指在耐低温硝化细菌在低温水体处理上的应用。
本实施方式Pseudomonas mohnii.M-8可在2-35℃生长，在好氧状态下实现硝化反应。在2℃，好氧状态下，初始氨氮浓度为50mg/L的情况下，该菌NH4 +-N,的去除率为92％，在氨氮降低的过程中，没有亚硝态氮和硝酸盐态氮的积累，说明该细菌能直接将氨氮转化成氮气等气体。相比其他耐低温菌种，该菌种具有适应更低温度，脱氮效率更高等优点。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：耐低温硝化细菌在低温水体脱氮上的应用。其他与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：耐低温硝化细菌在2℃条件下对以NH4 +-N为氮源的富营养水体进行脱氮处理。其他与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：低温水体中耐低温硝化细菌的投加量为4×108cfu/mL。其他与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式耐低温硝化细菌Pseudomonas mohnii.M-8的筛选方法为：取稳定运行的反应器中的填料，震荡离心取上清液。采用稀释平板涂布法进行分离，在2℃下，初始NH4 +-N浓度为50mg/L，对分离出来的菌株置于培养基中进行NH4 +-N去除实验，对于NH4 +-N去除率最高的菌株即为所需低温脱氮菌株。具体菌种筛选步骤为:从运行稳定的反应器中取得填料10g。放置于50mL离心管中加入30mL无菌水，震荡均匀使细菌均匀分散至无菌水中。然后，从细菌悬浮液中取1mL接入装有9mL无菌水的试管中，得到浓度为101梯度的细菌悬浮液，重复此步骤，依次得到菌种浓度为102、103…107梯度的细菌悬浮液。然后采用平板涂布法，从各梯度的细菌悬浮液中取100μL放入平板培养基中进行2℃低温培养，分别挑取不同形态，菌落清晰的典型菌落，在平板培养基上进行划线分离，重复3-4次直至出现菌落特征一致的单一菌落。上述所有操作均在无菌条件下进行。
上述的平板培养基的成分为(g/L)：醋酸钠2，氯化铵0.5，磷酸氢二钠0.17，琼脂18和2mL微量元素溶液。微量元素溶液成分(g/L)：氯化锰0.5，硫酸亚铁0.5，硫酸镁1，氯化钙1，硫酸锌0.5和氯化钴0.2。
将初筛所得到的20株菌株分别加入到富集培养基中富集培养，富集培养基的成分为(g/L):氯化铵0.5，醋酸钠2，磷酸氢二钠0.17，氯化钾0.1和2mL微量元素溶液。取富集后的菌液离心，PBS溶液清洗三次后分别加入硝化培养基中，接种后的硝化培养基在2℃下进行培养并测量氨氮的去除效率，对氨氮去除效率最高的菌种进行鉴定。经鉴定为Pseudomonas mohnii M-8，保藏编号为CGMCC No.14936，主要生物学特性为革兰氏阴性菌，菌体为短杆状，菌落为规则乳白色半透明圆形。
硝化培养基成分为(g/L)：氯化铵0.2，醋酸钠0.9，磷酸氢二钠0.2，氯化钾0.1和1mL微量元素溶液。
具体实施方式七：Pseudomonas mohnii M-8的低温氨氮去除能力
将耐低温硝化细菌Pseudomonas mohnii.M-8在富集培养基中培养至对数生长期，接种于处于2℃下的硝化培养基中，初始氨氮浓度50mg/L，接种后OD600约为0.3，150rpm转速好氧培养，测量培养基中氨氮，硝酸盐氮，亚硝酸盐氮，总氮及细菌浓度随时间的变化。富集培养基的成分为(g/L):氯化铵0.5，醋酸钠2，磷酸氢二钠0.17，氯化钾0.1和2mL微量元素溶液。
图1中检测结果显示，该细菌可在2℃下生长，OD600达到0.7以上。在80小时后对氨氮的去除率达到在90％以上。在氨氮降低的过程中，没有亚硝态氮和硝酸盐态氮的积累，说明该细菌能直接将氨氮转化成氮气等气体。
具体实施方式八：Pseudomonas mohnii M-8的生长适宜碳源
将耐低温硝化细菌Pseudomonas mohnii.M-8在富集培养基中培养至对数生长期，分别接种于以淀粉，蔗糖，葡萄糖，柠檬酸钠，醋酸钠，甲醇，乙醇和丙三醇为唯一碳源的硝化培养基中，初始氨氮浓度50mg/L，接种后OD600约为0.3，150rpm转速好氧培养，分别测量培养基测试前和24小时后的氨氮浓度并计算去除效率。
图2结果显示该细菌可在2℃对可以以多种有机物为碳源对氨氮进行去除。当柠檬酸钠作为唯一碳源时，24小时后氨氮的去除率达80％以上。当葡萄糖，蔗糖和丙三醇为碳源时，去除率达到40％以上。但是当淀粉，甲醇和乙醇为唯一碳源时，该细菌对于氨氮的去除率只有20％左右。碳源实验证明，柠檬酸钠为Pseudomonas mohnii.M-8的生长适宜碳源，在水处理过程中如需补充碳源，应补充适宜碳源，适宜的碳源能够大大加强细菌对氨氮的去除效率。
具体实施方式九Pseudomonas mohnii M-8的生长适宜pH
将该低温脱氮菌在富集培养基中培养至对数生长期，在2℃下分别接种于pH为5-10下的硝化培养基中，初始氨氮浓度50mg/L，接种后OD600约为0.3，150rpm转速下好氧培养，24h后测量硝化培养基中氨氮浓度。所测定的数值为离心菌体后上清液的氨氮浓度。
图3中结果显示该耐冷细菌在pH＝7至pH＝9时显示出最高的氨氮去除率(80％以上)，酸性条件能够明显抑制该细菌的低温脱氮效果，在中性和偏碱性的条件下，低温脱氮菌在2℃下对氨氮都有较高的去除效率。而在强碱或者偏酸的条件下，该菌对氨氮的去除效率受到了极大的抑制。在实际水处理过程中，如水体为强碱或者偏酸，应调节水体的pH值。
序列表
<110> 哈尔滨工业大学
<120>一株耐低温硝化细菌及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213>莫氏假单胞菌（Pseudomonas mohnii. M-8）
<400> 1
cgtggtaccg tcctcccgaa ggttagacta gctacttctg gtgcaaccca ctcccatggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcgacattct gattcgcgat 120
tactagcgat tccgacttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccggac tacgatcggt 180
tttatgggat tagctccacc tcgcggcttg gcaaccctct gtaccgacca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggccgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtctcctta gagtgcccac cataacgtgc tggtaactaa ggacaagggt 360
tgcgctcgtt acgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag 420
cacctgtctc aatgttcccg aaggcaccaa tccatctctg gaaagttcat tggatgtcaa 480
ggcctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcaactta 600
atgcgttagc tgcgccacta agagctcaag gctcccaacg gctagttgac atcgtttacg 660
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctcagtgtca 720
gtatcagtcc aggtggtcgc cttcgccact ggtgttcctt cctatatcta cgcatttcac 780
cgctacacag gaaattccac caccctctac catactctag cttgtcagtt ttgaatgcag 840
ttcccaggtt gagcccgggg ctttcacatc ccaacttaac aaaccaccta cgcgcgcttt 900
acgcccagta attccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg ctggcacaga 960
gttagccggt gcttattctg tcggtaacgt caaaattgca gagtattaat ctacaaccct 1020
tcctcccaac ttaaagtgct ttacaatccg aagaccttct tcacacacgc ggcatggctg 1080
gatcaggctt tcgcccattg tccaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac 1140
cgtgtctcag ttccagtgtg actgatcatc ctctcagacc agttacggat cgtcgccttg 1200
gtgagccatt acctcaccaa ctagctaatc cgacctaggc tcatctgata gcgcaaggcc 1260
cgaaggtccc ctgctttctc ccgtaggacg tatgcggtat tagcgtccct ttcgagacgt 1320
tgtcccccac taccaggcag attcctaggc attactcacc cgtccgccgc tgaatcagag 1380
agcaagctct cttcatccgc tcgacttgca tgtgttaggc ctgccgccag cgttcaatct 1440
gagccagatt ccaaactctc 1460

Claims (5)

1.一株耐低温硝化细菌，其特征在于它为莫氏假单胞菌Pseudomonas mohnii.M-8，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2017年11月20日，保藏编号为：CGMCC No.14936。
2.如权利要求1所述的一株耐低温硝化细菌，其特征在于耐低温硝化细菌在低温水体处理上的应用。
3.根据权利要求2所述的一株耐低温硝化细菌的应用，其特征在于耐低温硝化细菌在低温水体脱氮上的应用。
4.根据权利要求2所述的一株耐低温硝化细菌的应用，其特征在于耐低温硝化细菌在2℃条件下对以NH4 +-N为氮源的富营养水体进行脱氮处理。
5.根据权利要求2所述的一株耐低温硝化细菌的应用，其特征在于在低温水体中耐低温硝化细菌的投加量为4×108cfu/mL。
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