CN114214229A - 泛养副球菌菌株ma3、生产方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株，被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.23770。本发明还公开了泛养副球菌MA3菌株的生产方法。本发明还公开了生物脱氮的方法，将泛养副球菌MA3菌株接种于待处理的含氮液体中进行脱氮处理。本发明还公开了用于生产单细胞蛋白质的方法，将泛养副球菌MA3菌株接种于培养基中进行培养并收获单细胞蛋白质。本发明还公开了泛养副球菌MA3菌株于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料及于生物脱氮中的应用。本发明MA3菌株以甲酸为唯一碳源，可以高效脱除水体中的氮，菌体收获后可以作为饲料蛋白使用。

Description

泛养副球菌菌株MA3、生产方法及其应用

技术领域

本发明属于微生物和发酵技术领域，涉及泛养副球菌菌株MA3、生产方法及其应用。

背景技术

工业、农业和生活废水的不达标排放对环境造成了一定的氮负荷。此外，当污水处理厂(WWTP)尾水中的过量氮排放到水体中时，就会发生富营养化。与物理和化学方法去除废水中的氮相比，生物脱氮(BNR)技术具有成本低、效果好、无污染等优点。然而，传统脱氮过程硝化和反硝化中的脱氮效率受到自养硝化菌的不活跃生长及其对环境和操作的敏感性的影响。这个问题通常通过在不同罐中自养硝化菌和异养反硝化菌在地理和时间上的分离来解决，这个解决方案也有一个问题，那就是这个过程需要大量的安装空间，无疑会增加经济成本。异养硝化细菌的发现突破了自养硝化的既定概念。一些硝化细菌还具有反硝化作用，它可以在有氧条件下实现同步硝化反硝化。这些菌被称为“异养硝化-好氧反硝化菌”。目前，关于此类菌的报道很多，比如Exiguobacterium mexicanum sp., Paracoccussp.，Barnettozyma californica,Pseudomonas sp.和Bacillus sp.。然而，很少有报道关于异养硝化-厌氧反硝化的菌株。

同时，碳源对异养微生物具有重要的影响，目前关于其碳源多为碳化合物。甲酸是一种重要的化工原料，可以通过CO₂的催化加氢和电化学还原合成，可以缓解温室效应，具有重要的环境保护意义。此外，有效利用过剩能量合成的甲酸盐可作为微生物生长的来源，将甲酸盐转化为多种产品，包括燃料、溶剂、聚合单体、色素，甚至供人类和动物食用的蛋白。可见，甲酸来源便宜易得，可以成为多碳化合物的替代能源。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株。

本发明另有一个目的是提供一种泛养副球菌MA3菌株的生产方法。

本发明另有一个目的是提供一种生物脱氮的方法。

本发明另有一个目的是提供一种用于生产单细胞蛋白质的方法。

本发明再有一个目的是提供所述的甲酸基单细胞蛋白菌株MA5于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料及于生物脱氮中的应用。

为此，本发明提供的技术方案为：

泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株，该泛养副球菌MA3菌株被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.23770，保藏时间为：2021年11月10日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

泛养副球菌MA3菌株的生产方法，包括如下步骤：

将所述的泛养副球菌MA3菌株接种于异养硝化培养基中进行培养，之后收获菌体，其中，所述异养硝化培养基仅以甲酸或甲酸钠作为唯一碳源。

优选的是，所述的泛养副球菌MA3菌株的生产方法中，硝酸盐被用作唯一的氮源；

所述培养为于温度2℃-45℃和pH4.5-10条件下，培养6-168h。

生物脱氮的方法，包括如下步骤：

将所述的泛养副球菌MA3菌株接种于待处理的含氮液体中进行脱氮处理，其中，所述泛养副球菌MA3菌株的接种量为1％～5％。

优选的是，所述的生物脱氮的方法中，向所述待处理的含氮液体中加入甲酸或甲酸钠，以作为泛养副球菌MA3菌株的碳源；

保持待处理的液体中的C/N比为10-50:1。

优选的是，所述的生物脱氮的方法中，进行所述脱氮处理时，保持培养装置的转速为 0-180rpm。

优选的是，所述的生物脱氮的方法中，保持待处理的含氮液体中C/N比约为26，接种量约为3％，温度约为34.5℃，振荡速度约为180rpm。

优选的是，所述的生物脱氮的方法中，所述待处理的含氮液体为沼液，曝气速率为1.25vvm。

用于生产单细胞蛋白质的方法，包括如下步骤：

将所述的泛养副球菌MA3菌株接种于培养基中进行培养；

并以所述培养中生长的泛养副球菌的生物质的形式从培养基中收获单细胞蛋白质。

所述的泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料及于生物脱氮中的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株异养硝化效率和厌氧反硝化效率最高，其在4℃下以甲酸为碳源MA3也是可以生长的，且脱氮效率可以达到80％以上。本发明的生物脱氮的方法，以甲酸为唯一碳源，一定量比例的菌体接入富氮污水中，曝气或不曝气处理，可以高效脱除水体中的氮，菌体收获后可以作为饲料蛋白使用。本发明的菌体的蛋白含量达到50％以上，可以用于食品或饲料。

同时，本发明泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3在硝化过程中仅积累少量硝酸盐和亚硝酸盐。在厌氧条件下具有优异的反硝化能力。一些甲酸和氨代谢基因的相对表达水平在最佳条件下上调，这解释了氨氮去除效率提高和更多氨用于同化的机制。此外，菌株MA3对沼液中NH₄ ⁺-N的去除潜力高达11.50±0.06mg/L/h，表明MA3具有处理含氮废水的潜力。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中基于16S rDNA基因序列的MA3菌株系统发育树；

图2为本发明中其中一些实施例中不同因素对MA3菌株异养硝化能力的影响，(a)C/N 比，(b)振荡速度，(c)温度和(d)接种量；

图3为本发明其中一个实施例中最佳培养条件下菌株MA3的硝化性能图。

图4为本发明其中一些实施例中不同C/N比下菌株MA3厌氧反硝化性能图。

图5为本发明其中一些实施例中中厌氧条件下菌株MA3产生的气体成分。

图6为本发明其中一些实施例中两个因素相互作用对菌株MA3氨氮去除效率的影响， (a)C/N比和温度，(b)C/N和接种量和(c)温度和接种量。

图7为本发明其中一些实施例中甲酸盐和氨代谢途径和MA3菌株关键基因的相对表达水平分析图，(a)甲酸盐和氨代谢途径(上调基因标记为有下划线)。(b)MA3菌株关键基因的相对表达水平分析，缩写基因代表甲酸脱氢酶(FDH)、甲酸四氢叶酸连接酶 (FTFL)、5,10亚甲基四氢叶酸脱氢酶(5,10-CH2-THFDH)、丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)、呼吸硝酸还原酶β亚基(NxrA)、L-谷氨酰胺合成酶(L-GS)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)和谷氨酸合成酶(GOGAT)。

图8本发明其中一些实施例中菌株MA3于沼液中氨氮的去除性能图。

图9为本发明其中一些实施例中以甲酸为碳源菌株MA3在2℃、4℃、6℃、8℃和10℃下菌株的生长情况图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株，该泛养副球菌MA3菌株被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.23770，保藏时间为：2021年11月10日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供泛养副球菌MA3菌株的生产方法，包括如下步骤：

将如权利要求1所述的泛养副球菌MA3菌株接种于异养硝化培养基中进行培养，之后收获菌体，其中，所述异养硝化培养基仅以甲酸或甲酸钠作为唯一碳源。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，硝酸盐被用作唯一的氮源；

所述培养为于温度2℃-45℃和pH4.5-10条件下，培养6-168h。

本发明还提供生物脱氮的方法，包括如下步骤：

将如权利要求1所述的泛养副球菌MA3菌株接种于待处理的含氮液体中进行脱氮处理，其中，所述泛养副球菌MA3菌株的接种量为1％～5％。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，向所述待处理的含氮液体中加入甲酸或甲酸钠，以作为泛养副球菌MA3菌株的碳源；

保持待处理的液体中的C/N比为10-50:1。更优选地是，保持待处理的液体中的C/N比为40:1。

本发明以甲酸为唯一碳源，一定量比例的菌体接入富氮污水中，曝气或不曝气处理，可以高效脱除水体中的氮，菌体收获后可以作为饲料蛋白使用。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，进行所述脱氮处理时，保持培养装置的转速为0-180rpm。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，保持待处理的含氮液体中C/N比约为26，接种量约为3％，温度约为34.5℃，振荡速度约为180rpm。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述待处理的含氮液体为沼液，曝气速率为1.25vvm。

本发明还提供用于生产单细胞蛋白质的方法，包括如下步骤：

将权利要求1所述的泛养副球菌MA3菌株接种于培养基中进行培养；

并以所述培养中生长的泛养副球菌的生物质的形式从培养基中收获单细胞蛋白质。

本发明还提供所述的泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料及于生物脱氮中的应用。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

Paracoccus pantotrophus MA3是一种新分离的异养硝化-厌氧反硝化细菌菌株，以甲酸为唯一碳源评估其脱氮特性。基于Box-Behnken的响应面法获得了氨氮去除效率的最佳条件：C/N比为26.25，接种量3.39％，温度34.64℃，振荡速度180rpm。最大硝酸盐去除率为4.39mg/L/h，产生的气体只有N₂。此外，还实现了以11.50±0.06mg/L/h的速率从沼液中去除氨氮。

1材料和方法

1.1材料

LB培养基(每升蒸馏水)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和NaCl 10g。

异养硝化培养基(每升蒸馏水)：甲酸钠5g、NH₄Cl 0.2g、KH₂PO₄ 1.5g、 Na₂HPO₄·12H₂O 5.0g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、微量元素溶液2ml。固体培养基在液体培养基加入1.5％(w/v)琼脂粉。

反硝化培养基(每升蒸馏水)：甲酸钠5g、NaNO₃ 0.3g、KH₂PO₄ 1.5g、Na₂HPO₄·12H₂O5.0g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、微量元素溶液2ml。

微量元素溶液(每升蒸馏水)：EDTA 100mg，ZnSO₄ 4.4mg，CaCl₂ 13.2mg，MnCl₂·4H₂O 11.7mg，FeSO₄·7H₂O 22mg，(NH₄)₆Mo₂₄·4H₂O 6.4mg，CuSO₄·5H₂O 10.5mg·6H₂O 19.4mg。

1.2方法

1.2.1菌株评估和选定菌株的鉴定

如申请号2020113566272中记载，发明人筛选出5株以甲酸钠为碳源的菌株，MA1、MA2、MA3、MA4、MA5。从异养硝化板中挑取单个纯培养菌落接种于100ml LB培养基中，活化至对数期，PBS缓冲液(pH＝7.0)洗涤3次，接种于异养硝化反硝化培养基中。在异养硝化实验中，30℃，180r/min培养48h。在厌氧反硝化实验中，30℃，静置培养 48h。菌液10000rpm离心5分钟，测定上清液NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N浓度变化，从中选择异养硝化和厌氧反硝化效率最高的菌株。

在固体培养基中挑出异养硝化-厌氧反硝化最好的菌株的单菌落，在100℃水浴中加入 50μL水中变性10分钟，然后离心取上清液为模板，用通用引物F27和R1492进行16SrDNA菌落PCR扩增。PCR程序条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环，延伸在72℃下保持10分钟。PCR产物经纯化后送华大基因测序。将得到的序列在NCBI网站的BLAST工具上进行比对分析，然后选择BLAST获得的核酸序列高度相似的菌株和与脱氮相关的菌株，利用MEGA-X软件中的Neighbor-Joining方法建立系统发育树。

引物使用的是16SrDNA通用引物，引物序列如下：

F 27:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG(SEQ ID NO:1)

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT(SEQ ID NO:2)

1.2.2异养硝化的单因素优化

通过单因素试验，考察了MA3菌株在不同培养条件下的异养硝化特性，包括C/N比、摇床转速、温度和接菌量。C/N实验中，C/N比分别调整为10、20、30、40和50，温度为30℃，摇床转速为180r/min。摇床转速实验中，固定C/N为40，将转速调节为0r/min、 60r/min、120r/min和180r/min，温度为30℃。温度实验中，固定C/N为40，摇床转速为180r/min，培养温度分别调整为20、26、30、37、40℃。以上实验均以2％(v/v)的接菌量进行。接菌量实验中，固定C/N为40，摇床转速180r/min，接菌量调整为1％、2％、 3％、4％、5％，温度37℃。在所有实验中，每12h取一次样品，10000r/min离心5分钟收集上清液，测定残留NH₄ ⁺-N浓度。

1.2.3菌株MA3的异养硝化-厌氧反硝化特性

为了研究菌株MA3的异养硝化能力，氯化铵被用作唯一的氮源，初始浓度氨氮浓度为52.34mg/L。C/N比、振荡速度和温度分别设置为40、180r/min和37℃。接菌量为2％(v/v)，每6h定期取样测定OD₆₀₀，然后测定上清液中NO₂ ^--N、NO₃ ^--N和NH₄ ⁺-N的浓度。

研究了不同的C/N比以探究菌株MA3厌氧反硝化能力。硝酸盐被用作唯一的氮源，硝酸盐的初始浓度为49.4mg/L。将2％的菌悬液接入装有80ml硝酸盐培养基的100ml 厌氧瓶中。厌氧静置培养11h，离心获得上清液测定NO₃ ^--N。对于反硝化产生的气态产物，采用带气球的血清瓶收集。气密注射器对气体样品(1000μL)进行采样，以通过带有 TCD检测器的气相色谱检测气体产物。温度条件设置为：进样口150℃，柱箱80℃，TCD 检测器温度150℃。

1.2.4基于Box-Behnken设计的异养硝化因素优化

基于Box-Behnken设计的中心组合实验设计原则，以氨氮去除效率为响应值，通过响应面分析优化培养条件。通过Design-Expert V 8.0.6软件设计C/N比(A)、温度(B)和接种量(C)三个水平的因素建立实验组，预测最佳培养条件。氨氮的初始浓度为52.34mg/L，根据不同的C/N比计算甲酸钠的质量。

1.2.5总RNA提取和实时定量PCR

为了评估在去除氨氮过程中产生的信使RNA(mRNA)的水平，在对数中期发展阶段(接种后培16小时)，在响应面优化之前和之后从培养基中分离细菌样品。以初始培养条件(5g/L甲酸钠，30℃，2％接种量)为对照组，响应面优化培养条件(6.67g/L甲酸钠， 34.64℃，3.39％接种量)作为实验组。从两组条件细菌中分离出总RNA，并使用Trizol 技术进行提取。然后，通过FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根生化科技有限公司，中国北京)将整个RNA逆转录成cDNA。qRT-PCR是在Applied Biosystems 7500Fast实时荧光定量聚合酶链反应仪上使用PowerUp^TMSYBR^TMGreen Master Mix(赛默飞世尔科技有限公司，中国上海)进行的。菌株MA3的GAPDH用作内参基因。选择八个基因， FDH、FTFL、5,10-CH₂-THFDH、SHMT、NxrA、L-GS、GLDH和GOGAT来量化相对表达水平，它们的引物如表1所示。qRT-PCR的反应体系和程序见表2-3。在相同的设置下，实验重复3次。

表1 qRT-PCR的引物(字母“F”和“R”分别表示正向和反向引物)

表2qRT-PCR反应体系

表3 qRT-PCR反应程序

1.2.6 MA3应用于沼液中的氨氮脱除

采用三颈1L发酵瓶和甲酸补充装置探索MA3从实际废水(沼液)中去除NH₄ ⁺-N的能力。所用沼液由猪粪发酵产生，该沼液的pH值为9.55，NH₄ ⁺-N浓度为683±24.04mg/L。将5％(v/v)的菌液接种到800ml沼液中。所用甲酸为88％分析纯原液稀释20倍，曝气速率为1.25vvm在酸补充至pH为8后，在30℃下持续发酵23小时。在0、6、12 和23小时测定NH₄ ⁺-N。挥发的NH₄ ⁺-N被200ml 4％硼酸吸收。

1.3分析方法及计算

通过多功能酶标仪(Synergy Neo2，美国)的600nm波长下测定细菌生长。此外，将发酵液以10000rpm离心5分钟，以方便后续的化学分析。NO₂ ^--N、NO₃ ^--N和NH₄ ⁺-N 的浓度由DR1900分光光度计(HACH，Colorado，USA)测定。气体样品通过气相色谱 (GC7900TECHCOMP，中国上海)使用热导检测器(TCD)进行测定。结果表示为平均值±标准偏差。qRT-PCR的数据使用2^ˉΔΔCt方法处理。最后，通过GraphPad Prism 8软件和T检验进行统计分析。显著差异定义为P<0.05(*)或P<0.01(**)。

2结果与讨论

2.1菌株评价和选定菌株的鉴定

MA3菌的异养硝化效率和厌氧反硝化效率见表4。

在以甲酸盐为碳源的异养硝化板上连续三次画线后获得菌株MA3的单菌落。形态上，菌落圆形，淡黄色，不透明，表面湿润，边缘光滑，直径约1mm。菌落利于挑起，接种环挑起时有粘性。BLAST同源性分析表明，菌株MA3与报道的Paracoccus pantotrophu的相似度达到100％。使用MEGA-X软件中的Neighbor-Joining方法研究MA3 和其他与副球菌相关的菌株，以获得菌株MA3的系统发育树。系统发育树(图1)显示菌株MA3和P.pantotrophus同源性高达100％。因此，该菌株属于Paracoccus pantotrophus。

表4培养48小时后分离株对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的去除效率

2.2单因素优化

C/N比对MA3菌株去除NH₄ ⁺-N 60h有显著影响，见图2(a)。提高C/N比，NH₄ ⁺-N 的去除率先上升后下降。在C/N比为40时，NH₄ ⁺-N的去除效率达到最大值96.9％。与低 C/N比相关的低去除效率可能是碳源耗尽的结果。例如，在C/N比为10和20时，NH₄ ⁺-N 的去除效率分别仅为55.6％和65.6％。在C/N比为20和50时，残留NH₄ ⁺-N的浓度相当，这意味着高C/N比可能不利于细菌的活性。考虑到时间和成本效益，40的C/N比被认为是用于以下实验的最佳选择。

细菌耗氧量由摇床的转速度确定。图2(b)描述了溶解氧对48h后去除NH₄ ⁺-N的影响。结果表明，最大振荡速度为180rpm的培养物具有较高的NH₄ ⁺-N去除效率，达到100％。

图2(c)说明了温度对48h异养硝化作用的影响。菌株MA3可以在20-40℃的宽温度范围内生长和去除氨氮。然而，过高或过低的温度都不利于除氮，因为它们会影响细菌中各种酶的活性。相反，20℃时氨氮浓度超过初始浓度，可能是由于细菌表面残留的有机氮氨化所致。在37℃时，获得了最大的氨氮去除效率。

24h不同接种量对脱氮性能的影响见图2(d)。可以看出，菌株MA3在接菌量为2％、3％、4％和5％时是稳定的，具有良好的细菌生长和NH4+-N去除效率，分别为48.7、97.1、98.6和98.1％。然而，1％的接种量只有1.9％的去除效率。这些结果反映了接菌量主要决定了菌株的增殖速度。如果接种量过低，会影响细菌的生长。结果表明，2～5％左右适合 MA3生长。

2.3菌株MA3的异养硝化-厌氧反硝化特性

图3显示了菌株MA3的生长曲线和培养过程中氮化合物的变化。菌株MA3在6h 开始进入对数生长期，6-36h(对数生长期)NH4+-N以相对稳定的速率进行有效降解。随着OD600从0.11增加到0.47，氨氮平均去除率为1.42mg/L/h。MA3菌株在异养硝化过程中没有明显NO3--N(≤0.8mg/L)和NO2--N(≤0.05mg/L)积累。NO3--N和NO2--N 的微量积累有利于处理含氮废水，尤其是具有生物毒性的亚硝酸盐。定性和定量分析结果表明，菌株MA3可以将NH4+-N转化为NO3--N和NO2--N，表明MA3具有异养硝化潜力。异养硝化的主要产物是NO3--N。

本研究发现菌株MA3在厌氧条件下具有较好的反硝化能力。因此，我们探讨了各种C/N比对反硝化作用的影响，如图4所示。硝酸盐去除率和效率随着C/N比的增加显示出相同的趋势。当C/N比为2.64时，硝酸盐的最大去除率和效率分别为4.39mg/L/h和98.57％。增加C/N比并没有提高硝酸盐的去除效率。此外，在C/N比为13.2时，去除效率仅为51.22％，表明高浓度的甲酸抑制了细菌的生长并干扰了反硝化酶的活性。此外，图5显示了气体产物的气相色谱结果。结果表明N₂是产生的唯一反硝化气体。

2.4响应面法(RSM)优化异养硝化

RSM用于检测关键环境因素对NH₄ ⁺-N去除效率的相互作用影响。指定C/N比(A)、温度(B)和接种量(C)的因素，每个因素选择三个水平。为了评估这些相互作用的影响，使用Box-Behnken实验设计，其中包括三个环境因素和三个水平。试验设计的因素和水平见表5。表6总结了从17个试验组获得的NH₄ ⁺-N去除效率的结果。菌株MA3模型推导如下：

Y＝79.26-27.01A+0.72B+26.01C+3.01AB+8.32AC-1.20BC-2.86A²-31.47B²-14.99C²。

表5 Box-Behnken design试验设计因素与水平

表6 Box-Behnken design试验设计方案及响应值

在表7中，显著性检验和方差分析表明菌株MA3模型是显著的。回归方程模型P<0.0001，表明回归方程所描述的因素与响应值之间的关系极显著，表明该模型是可靠的。当失拟项不显著时，说明实验误差很小。结果表明，C/N比和接种量对MA3菌株对 NH₄ ⁺-N的去除具有极其显著的影响。此外，C/N比和接种量之间的相互作用对NH₄ ⁺-的去除有显著影响。

表7响应面结果的方差分析

*表示显著(P﹤0.05)，**表示极显著(P﹤0.01)

图6展示了NH₄ ⁺-N去除效率的响应面的曲面图。形象的描绘了C/N比、温度和接菌量之间的相互作用对氨氮去除的影响。通过求解回归方程分析确定最佳值。通过将因素水平代入回归方程来找到解决方案。一个最佳NH₄ ⁺-N去除效率的计算结果如下：C/N为 36.25，温度34.64℃和接菌量为3.39％。考虑到摇床温度的精度，实际实验温度可设置为 34.6℃。在此条件下，经过3次重复验证实验的氨去除效率和相对偏差较低,与理论值 (100％)相比。此外，它比初始培养条件高10.13％。该结果表明该方程与实际情况吻合较好，说明脱氮条件响应面优化是可靠的，具有一定的实际应用价值。

2.5响应面优化基因表达水平的变化

如图7(a)所示，甲酸的代谢途径有两种，一种是通过酸脱氢酶(FDH)将甲酸快速转化为CO₂，另一种是甲酸在酸甲酸四氢叶酸连接酶(FTFL)的作用下生成四氢叶酸，然后通过5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶(5,10-CH₂-THFDH)生成5,10-甲基四氢叶酸和5,10- 亚甲基四氢叶酸，5,10-亚甲基四氢叶酸在丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)作用下与甘氨酸反应生成L-丝氨酸和四氢叶酸。此外，氨脱除可有两种主要方式，硝化和同化，其中可通过GLDH途径或L-GS-GOGAT等途径同化为有机化合物。

如图7(b)所示，与对照相比，FDH、FTFL、5,10-CH₂-THFDH和SHMT分别增加了 1.85倍、0.50倍、1.24倍和1.70倍。温度增加可能会增强基因表达。在响应面优化支持条件下，虽然甲酸浓度增加，但可以起到抑制作用，甲酸脱氢酶上调最大，抗更多的甲酸还原为CO₂。同时，NAD(P))+被为NAD(PH)，还原为细胞单体提供。此外，由于对氧的竞争增加，生物量的增加对甲酸的利用没有影响。氨氮氮代谢过程中，NxrA、L-GS、GLDH、 GOGAT等几个关键基因的相对表达量分别增加了0.57倍、0.78倍、3.83和3.21倍，呼吸硝酸还原酶β亚基(NxrA)是异养硝化化过程中的关键基因。氨同化关键基因的相对变化高于硝化基因，以及硝酸盐和亚硝酸盐的微量积累推测大部分氨氮是通过同化作用转化的。L-谷氨酰胺合成酶(L-GS)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)和谷氨酸合成酶(GOGAT)的存在表明MA3菌株存在两条基本的氨同化途径。此外，GLDH的相对变化比GOGAT高16.2％，表明通过GLDH途径的氨同化将优先发生。

2.6 MA3应用于沼液中的氨氮脱除

如图8所示，从0到23h，NH₄ ⁺-N逐渐减少。同时，pH值逐渐从8.0上升到9.03。在0-12小时内，尤其是6-12小时氨氮下降更快。NH₄ ⁺-N的最大去除率为24.33mg/L/h。除易挥发的NH₄ ⁺-N(约60mg/L)外，NH₄ ⁺-N的平均速率为11.50mg/L/h。因此，MA3 菌株证明其在废水处理技术方面具有广阔的前景。

2.7 4摄氏度低温下以甲酸为碳源的生长

由图9可知，4摄氏度下以甲酸为碳源MA3也是可以生长的，经过测定其脱氮效率可以达到80％以上。

2.8菌体收获

将培养的菌体收获，获得菌体，经过测定其蛋白含量达到50％以上，可以用于食品或饲料。

3.结论

菌株MA3被确认为P.pantotrophus。硝化过程中仅积累少量硝酸盐和亚硝酸盐。在厌氧条件下具有优异的反硝化能力。一些甲酸和氨代谢基因的相对表达水平在最佳条件下上调，解释了氨氮去除效率提高和更多氨用于同化的机制。此外，MA3对沼液中NH₄ ⁺-N 的去除潜力高达11.50±0.06mg/L/h。该研究表明MA3具有处理含氮废水的潜力。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 泛养副球菌菌株MA3、生产方法及其应用

<130> 2020

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gtctcctcgg acttcaacca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cataccaggt caggatgcg 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctggagaaca atcccgcctt 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ttgagaaaac ttctcggccc c 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gcccttgttg cggacataga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atcatcgacg gcaagggttt 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gccctcggca tatttgttgg 20

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

attcttcacc gagacgctgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cctttgatcc agtcctcggg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tgggcgtgat gctttacgat 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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gcccttctgc cggtaaaaga t 21

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<212> DNA

<213> 人工合成

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atcctgacgc cggatttctc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

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aagatgatct ggcgttcggg 20

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<213> 人工合成

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gacaagcttg cccccatcta 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ttacatcaac gccgaaacgc 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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caggaagttg gccttctcgt 20

Claims (10)

1.泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株，该泛养副球菌MA3菌株被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.23770，保藏时间为：2021年11月10日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.泛养副球菌MA3菌株的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

将如权利要求1所述的泛养副球菌MA3菌株接种于异养硝化培养基中进行培养，之后收获菌体，其中，所述异养硝化培养基仅以甲酸或甲酸钠作为唯一碳源。

3.如权利要求2所述的泛养副球菌MA3菌株的生产方法，其特征在于，硝酸盐被用作唯一的氮源；

所述培养为于温度2℃-45℃和pH4.5-10条件下，培养6-168h。

4.生物脱氮的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将如权利要求1所述的泛养副球菌MA3菌株接种于待处理的含氮液体中进行脱氮处理，其中，所述泛养副球菌MA3菌株的接种量为1％～5％。

5.如权利要求4所述的生物脱氮的方法，其特征在于，向所述待处理的含氮液体中加入甲酸或甲酸钠，以作为泛养副球菌MA3菌株的碳源；

保持待处理的液体中的C/N比为10-50:1。

6.如权利要求4所述的生物脱氮的方法，其特征在于，进行所述脱氮处理时，保持培养装置的转速为0-180rpm。

7.如权利要求4至6任一项所述的生物脱氮的方法，其特征在于，保持待处理的含氮液体中C/N比约为26，接种量约为3％，温度约为34.5℃，振荡速度约为180rpm。

8.如权利要求4或5任一项所述的生物脱氮的方法，其特征在于，所述待处理的含氮液体为沼液，曝气速率为1.25vvm。

9.用于生产单细胞蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求1所述的泛养副球菌MA3菌株接种于培养基中进行培养；

并以所述培养中生长的泛养副球菌的生物质的形式从培养基中收获单细胞蛋白质。

10.如权利要求1所述的泛养副球菌Paracoccus pantotrophus MA3菌株于利用甲酸或甲酸钠生产食物或饲料及于生物脱氮中的应用。

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