CN111909867A

CN111909867A - 一种异养硝化-好氧反硝化菌及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN111909867A
Application number: CN202010705541.XA
Authority: CN
Inventors: 孙巍; 夏春雨; 林彩琴; 魏登枭; 韦明肯; 李长秀; 向音波; 江利梅
Original assignee: Guangdong University of Petrochemical Technology
Current assignee: Guangdong Jinst Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111909867B

Abstract

本发明公开了一种异养硝化‑好氧反硝化菌，其特征在于，所述异养硝化‑好氧反硝化菌菌株为施氏假单胞菌XN9(Pseudomonas stutzeri XN9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2019年3月25日，保藏编号为GDMCC No：60532。该菌株具有高效的HN‑AD脱氮性能，几乎不积累中间代谢物，在处理高C/N的NO₃ ^‑‑N和NO₂ ^‑‑N废水和高浓度NH₄ ⁺‑N和NO₃ ^‑‑N废水领域具有广阔的应用前景。

Description

一种异养硝化-好氧反硝化菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种异养硝化-好氧反硝化菌及其培养方法和应用。

背景技术

近年来，随着社会发展和工业化推进，氮素含量高的工业废水、生活废水以及养殖废水的大量排放严重破坏了我国的水生态环境，主要表现在水质劣化以及水体富营养化。根据我国《2018年中国生态环境状况公报》，在各类水体中主要超标指标均包括无机氮。无机氮含量过高引起水体富营养化现象，破化了水体正常的氮素循环。其中NO₃ ^--N进入人体被还原成NO₂ ^--N会导致人体产生中毒、呕吐以及休克等症状危及人类的生命健康。因此，氮含量高的污水脱氮处理显得尤为重要。

目前主要利用物理法、化学法和生物法进行脱氮处理。前两者具有费用高和易造成二次污染等缺陷，而生物脱氮法具有费用低、脱氮效率高、无二次污染等优势，因此生物脱氮法被广泛应用。硝化作用在有氧时将NH₄ ⁺-N转化为NO₂ ^--N或者NO₃ ^--N，反硝化作用在无氧时将NO₂ ^--N和NO₃ ^--N还原成N₂。传统生物脱氮技术占地面积较大，需在两个反应器进行，过程较为繁琐并且脱氮效率不高。

新型的脱氮技术主要有短程反硝化技术、厌氧氨氮化技术、和同步硝化技术^[9]。Vote等在1975年率先提出了短程硝化反硝化技术，使NH₄ ⁺-N硝化成NO₂ ^--N，阻止NO₂ ^--N硝化成NO₃ ^--N，直接反硝化生成N₂。短程硝化反硝化技术省去了NO₂ ^--N转化为NO₃ ^--N的过程，此工艺减少运行成本，但抗干扰能力和稳定性较差。T.Lotti提出了厌氧氨氧化技术，在严格厌氧环境中，将NH₄ ⁺-N和NO₂ ^--N直接转化为N₂。厌氧氨氧化技术无需外加碳源，但具有倍增时间长，对环境条件敏感等缺点。L.A.Robertson等1983年在废水脱硫反硝化体系中发现了第一株HN-AD菌株Thiosphaera pantotropha，该菌株在有氧条件下将NO₂ ^--N和NO₃ ^--N还原为N₂。HN-AD菌可同时进行硝化与反硝化作用，具有脱氮效率高、对溶解氧浓度需求低等优点，成为了生物脱氮研究与应用的热点。此后，众多研究人员陆续从湖泊、废水中发现筛选分离出异氧硝化-好氧反硝化菌株，主要有Bacillus subtilis、Pseudomonas stutzeri、Klebsiella pneumoniae、Alcaligenes faecalis等。

HN-AD技术有诸多优点，但自身也存在不足。目前已筛选得到的部分HN-AD菌生长与代谢速度缓慢，积累NO₂ ^--N，不适用于实际污水处理。因此，筛选分离出脱氮效率高、不积累NO₂ ^--N的HN-AD菌是迫切的任务。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有高效的HN-AD脱氮性能的异养硝化-好氧反硝化菌，还相应提供该菌的培养方法，以及在处理含氮废水中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种异养硝化-好氧反硝化菌，所述异养硝化-好氧反硝化菌菌株为施氏假单胞菌XN9(Pseudomonas stutzeri XN9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2019年3月25日，保藏编号为GDMCC No：60532。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的异养硝化-好氧反硝化菌的培养方法，包括如下步骤：

将施氏假单胞菌XN9接种于LB培养基中，25-35℃，100-200rpm培养10-15h，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水制成OD₆₀₀为0.6～0.8的菌悬液。

作为一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的异养硝化-好氧反硝化菌在处理含氮废水中的应用。

上述的应用，优选的，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和NO₂ ^-中的一种或多种。

上述的应用，优选的，所述含氮废水为含NH₄ ⁺废水时，施氏假单胞菌XN9以柠檬酸钠为碳源、NH₄ ⁺-N为氮源进行异养硝化脱氮；所述含NH₄ ⁺废水的C/N比值为10～30，所述NH₄ ⁺的浓度为100mg·L^-1～500mg·L^-1。

上述的应用，优选的，所述含氮废水为含NO₃ ^-废水时，施氏假单胞菌XN9以柠檬酸钠为碳源、NO₃ ^-为氮源进行好氧反硝化脱氮；所述含NO₃ ^-废水的C/N比值为10～50，所述NO₃ ^-的浓度为100mg·L^-1～500mg·L^-1。

上述的应用，优选的，所述含氮废水为含NO₂ ^-废水时，施氏假单胞菌XN9以柠檬酸钠为碳源、NO₂ ^-为氮源进行好氧亚硝化脱氮；所述含NO₂ ^-废水的C/N比值为10～50，所述NO₂ ^-的浓度为50mg·L^-1～150mg·L^-1。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1、菌株XN9具有高效的HN-AD脱氮性能，几乎不积累中间代谢物，在处理高C/N的NO₃ ^--N和NO₂ ^--N废水和高浓度NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N废水领域具有广阔的应用前景。

2、XN9对高浓度NH₄ ⁺-N具有优良的耐受性，在处理高浓度NH₄ ⁺-N废水方面具有一定应用前景，例如化肥厂、石油化工厂等污染废水；且在碳源浓度较低的条件下，异养硝化脱氮率仍然保持较高水平，处理低C/N的NH₄ ⁺-N废水处理中更具有一定应用价值。

3、XN9对高浓度NO₃ ^--N具有优良的耐受性，在污水处理中去除高浓度NO₃ ^--N方面有一定的应用价值，例如NO₃ ^--N浓度高的生活污水、工业废水等；且XN9耐受的C/N范围较宽，好氧反硝化脱氮率更高，适用于多种类型废水的脱氮处理，例如低C/N的生活废水，高C/N的屠宰场废水。此外，菌株XN9好氧反硝化脱氮中无NO₂ ^--N积累，不产生二次污染。

4、XN9好氧亚硝化脱氮C/N范围较宽，可耐受高负荷碳源，好氧亚硝化脱氮率较高，在处理高C/N的NO₂ ^--N废水方面具有潜在价值。

施氏假单胞菌XN9(Pseudomonas stutzeri XN9)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：60532，保藏时间为2019年3月25日。

附图说明

图1为XN9菌株的形态特征图

图2为XN9菌株的的功能基因条带图。

图3为基于16S rDNA序列同源性构建XN9的系统发育树图。

图4为基于nap序列同源性构建菌株XN9的系统发育树图。

图5为基于nir S序列同源性构建XN9的系统发育树图。

图6为XN9在好氧反硝化过程中的生长规律与脱氮曲线图。

图7为XN9在好氧亚硝化过程中的生长规律与脱氮曲线图。

图8为XN9在异养硝化过程中的生长规律与脱氮曲线图。

图9为碳源对菌株XN9生长和好氧反硝化脱氮性能的影响图。

图10为C/N对菌株XN9生长和好氧反硝化脱氮性能的影响图。

图11为温度、pH和装量对XN9菌株NO₃ ^--N去除率交互作用的响应面图与等高线图。

图12为NO₃ ^--N浓度对XN9菌株生长和好氧反硝化脱氮性能的影响图。

图13为C/N对菌株XN9生长和好氧亚硝化脱氮性能的影响图。

图14为NO₂ ^--N浓度对XN9菌株生长和好氧亚硝化脱氮性能的影响图。

图15为C/N对菌株XN9生长和异养硝化脱氮性能的影响图。

图16为NH₄ ⁺-N浓度对菌株XN9生长和异养硝化脱氮性能的影响图。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

菌株来源

本实验室从龙岩市龙津河溪南河段沉积物中，经过富集培养、分离纯化获得一株脱氮性能较好的HN-AD菌，命名为XN9。

培养基与实验仪器

培养基如表1所示。

表1 培养基类型以及配方

以上培养基配制好后将pH调节为7.00，在121℃下高温高压灭菌20min后方可使用。

实验仪器如表2所示。

表2 实验仪器

菌株的鉴定

形态学鉴定

将菌株XN9在平板上划线，置于30℃条件下24h后进行观察；用透射电子显微镜观察菌体形态与特征(由广东省微生物研究所完成)。

结果如图1(a)所示：淡黄色的圆形小菌落，边缘光滑，湿润，粘稠，不易挑取。菌株XN9电子扫描镜结果如图1(b)所示：菌株XN9属于短杆菌，一般以单个，成双或呈链状排列，有鞭毛，有荚膜。

生理生化鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定试验。试验项目如表3所示：

表3 生理生化鉴定指标

结果如表9所示：XN9可适应无氧与有氧环境，在高温与低温条件均能生长；接触酶阳性而氧化酶试验为阴性，表示菌株XN9为兼性厌氧菌；MR与VP试验为阴性，表示菌株的分解产物为非酸性物质且不产丙酮酸；乙酸氧化试验为阴性；吲哚实验阴性，表示不具有色氨酸酶；绿脓杆菌试验为阳性，表示菌株可发生可逆的氧化还原反应；硫化氢实验为阳性，分解含硫氨基酸；硝酸盐还原，可进行反硝化反应；明胶液化和尿素试验为阴性，不分泌蛋白酶和尿素酶；柠檬酸盐试验为阳性；果胶、淀粉和油脂水解试验为阳性，表示具有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶；葡萄糖和乳糖氧化发酵试验为阴性，表示不能分解葡萄糖和乳糖；石蕊牛奶试验为阴性，不分解蛋白质和糖。

表9 XN9菌株的生理生化特征

注：“﹢”表示阳性，“﹣”表示阴性

分子生物学鉴定

硝酸盐还原酶(Nar)催化NO₃ ^--N转化为NO₂ ^--N的反应，可分为膜结合硝酸盐还原酶-Nar和周质硝酸盐还原酶-Nap，前者只在厌氧条件下发挥作用，而后者在好氧和厌氧条件下均可发挥作用。亚硝酸盐还原酶(Nir)将NO₂ ^--N转为NO，有Nir S型和Nir K型。PCR扩增16S rDNA、nap、nir S和nir K基因，PCR引物、体系及条件分别如表4、5和6所示。产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像系统拍照，送至金唯智生物科技有限公司测序。据Blast同源性比对结果，在MEGA7软件采用Neighbor-Joining Tree法构建系统发育树。

表4 不同目的基因的引物及目的产物大小

表5 PCR反应体系

表6 PCR反应条件

各项水质测定项目与方法主要参照于国家标准分析方法规定，如表7所示。

表7 各项测定项目的测定方法

测定项目	分析方法
		OD<sub>600</sub>	超微量分光光度法
pH值	UB-7精密pH计
		NO<sub>2</sub><sup>-</sup>-N	N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法
NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N	麝香草酚分光光度法
		TN	碱性过硫酸钾消解分光光度法

经PCR扩增后，菌株XN9的功能基因条带位置如图2所示：nap、nir S均在正确位置，条带明显，XN9含有nap与nir S功能基因，没有nir K基因，说明XN9属于nir S型好氧反硝化菌。系统发育树分别如图3、4、5所示：XN9的16S rDNA与Pseudomonas stutzeri1W-1A的亲缘关系最接近；XN9与Pseudomonas stutzeri A501和Pseudomonas stutzeri SGAir0442的nap基因序列相似度达到100％；XN9与Pseudomonas stutzeri DW2-1的nir S基因序列相似度达到了99％。综上，我们可以确定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，命名为Pseudomonas stutzeri XN9。

XN9脱氮性能研究

种子液的制备

将菌株XN9接种至LB培养基，30℃，150rpm培养12h后取样，经4000rpm离心10min后丢弃上清液，用无菌水清洗3次并稀释菌液中的菌浓度，利用超微量分光光度计在600nm下检测菌株XN9的菌体生物量OD₆₀₀值，使其处于0.6～0.8范围内。

好氧反硝化性能

按3％接种量，将XN9种子液接种到好氧反硝化培养基，30℃，150rpm培养48h,每隔6h取样检测OD₆₀₀、pH值，NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、NO₃ ^--N以及TN的含量，每个处理设置三组平行实验。

菌株XN9反硝化作用时生长规律与脱氮性能如图6所示：0～6h，菌株生长缓慢，处于适应期；6-12h，菌株进入指数生长期，生物量快速上升，OD₆₀₀从0.096上升至0.348；18h，OD₆₀₀达到最大值0.392，之后进入了稳定生长期。菌株XN9在反硝化过程中产生碱，在培养过程中培养基的pH值逐渐上升，pH从7.13增长至8.87。

0～18h，随着菌株XN9进入对数生长期，NO₃ ^--N和TN去除速率较快，18h达到最高值，分别为98.83％与91.53％；18～48h，菌株XN9不再去除NO₃ ^--N和TN。6h，NO₂ ^--N和NH₄ ⁺-N积累量分别为6.30mg·L^-1和0.19mg·L^-1；30h，培养基中积累的NH₄ ⁺-N被全部去除；36h，培养基中所积累的NO₂ ^--N全部完全去除。

据报道Pseudomonas sp.sblny菌株和Ochobactrum sp.tbtd菌株经48h培养后，NO₃ ^--N去除率分别为32.26％和87.50％。Pseudomonas sp.DK1菌株在NO₃ ^--N浓度为87.07mg·L^-1时，经30h培养后NO₂ ^--N积累量为15.68mg·L^-1。菌株XN9的NO₃ ^--N去除率远远高于菌株sblny和菌株tbtd，并且与菌株DK1相比，菌株XN9无NO₂ ^--N积累。综上，菌株XN9具有优良的好氧反硝化脱氮性能，不产生二次污染。

好氧亚硝化性能

按3％接种量，将XN9种子液接种到好氧亚硝化培养基，30℃，150rpm培养48h，每隔6h取样检测OD₆₀₀、pH值，NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、NO₃ ^--N以及TN的含量，每个处理设置三组平行实验。

菌株XN9在亚硝化过程的生长规律与脱氮曲线如图7所示：0～18h，菌株在生长适应期；18～30h，菌株进入快速生长期，OD₆₀₀从0.073上升至0.366；30～48h，菌株进入生长平稳期。在好氧亚硝化过程中，培养基的pH值不断上升，说明菌株XN9在亚硝化过程中产碱。

24h，NO₂ ^--N去除率最高值达99.20％；30h，TN去除率最高值为91.40％；30～48h,NO₂ ^--N和TN去除率停止上升。好氧亚硝化培养基中几乎没有NH₄ ⁺-N积累，6h培养基中有0.60mg·L^-1NO₃ ^--N积累，36h NO₃ ^--N完全去除。

据报道Pseudomonas chengduensis ADM 2-2和Pseudomonas chloritidismutansADM8-1菌株经过48h培养后，NO₂ ^--N去除率仅28.64％和86.73％。Pseudomonas sp.BB17菌株在18h后快速生长，48h对NO₂ ^--N去除率达到最大值99.11％，36h TN去除率达到最大值74.33％。菌株XN9的NO₂ ^--N去除率明显优于菌株ADM2-2和菌株ADM8-1，与菌株BB17相比具有类似的脱氮迟缓期较长特点，这可能是因为初始NO₂ ^--N浓度较高，但XN9的TN去除率明显优于菌株BB17。综上，菌株XN9具有比较优良的好氧亚硝化脱氮性能，在污水的NO₂ ^--N去除方面具有较强的应用价值。

XN9异养硝化性能

按3％接种量，将XN9种子液接种到异养硝化培养基，30℃，150rpm培养48h，每隔6h取样检测OD₆₀₀、pH值，NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、NO₃ ^--N以及TN的含量，每个处理设置三组平行实验。

菌株XN9在硝化过程中的生长规律与脱氮曲线如图8所示：0-12h，菌株进入指数生长期，OD₆₀₀从0.052升高至0.333；30～48h，进入生长平稳期。培养基的pH值不断上升，从7.12上升至8.74。

0～12h，随着菌株XN9快速进入指数生长期，NH₄ ⁺-N和TN去除率升高；18h，NH₄ ⁺-N去除率高达98.55％；36h，TN去除率高达97.58％。硝化过程中基本没有NO₂ ^--N和NO₃ ^--N的积累。

据报道Alterominas macleodii 8D菌株在异养硝化培养基中，经过48h不间断培养后，NH₄ ⁺-N的去除率仅为58.64％。Pseudoxanthomonas sp.C2菌株在异养硝化培养基中培养24h后，NH₄ ⁺-N去除率达到最大值为78.87％；Acinetobacter oleivorans JY78菌株在异养硝化培养基中培养36h后，NH₄ ⁺-N去除率达到最大值为93.53％。菌株XN9的NH₄ ⁺-N去除率为98.55％，高于以上菌株的降解率，并且菌株XN9在18h时NH₄ ⁺-N去除率就达到最大值，异养硝化脱氮速率较高。综上，可见菌株XN9具有优良的异养硝化脱氮性能，在废水NH₄ ⁺-N去除方面具有一定应用价值。

XN9好氧反硝化性能影响因素

碳源对XN9好氧反硝化性能的影响

以乳糖、乙酸钠、柠檬酸钠、无水乙醇、草酸钠、丁二酸钠和葡萄糖分别为碳源，以无机碳源碳酸氢钠和无碳培养基作为对照，其余条件不变，将XN9种子液接种到好氧反硝化培养基，30℃，150rpm培养24h，取样检测OD₆₀₀、pH值、TN以及NO₃ ^--N的含量，每个处理设置三组平行实验。

碳源是微生物生长代谢所需的营养物质，碳源对HN-AD菌影响各不相同，一般分子质量较小的碳源更利于HN-AD菌株的生长。不同碳源对菌株XN9反硝化作用如图9所示：以蔗糖、乙酸钠和碳酸氢钠作为碳源时，菌株XN9菌体生物量OD₆₀₀较低，NO₃ ^--N和TN去除率较低，这表示菌株XN9对蔗糖、乙酸钠和碳酸氢钠的利用度较低，几乎不利用无机碳源，属于异养菌；以葡萄糖为碳源时，菌株XN9菌体生物量OD₆₀₀较高为0.220，生长状况较好但脱氮性能不理想，几乎不去除TN；碳源为丁二酸钠和柠檬酸钠时，XN9的OD₆₀₀和NO₃ ^--N去除率相近，但TN去除率分别为68.74％和83.42％，因此，选择柠檬酸钠为碳源，因为柠檬酸钠是三羧酸循环过程的产物，直接进入代谢过程，生长速度较快。

各碳源对不同菌株的脱氮的影响有所差异，例如Halomonas sp.B02菌株以丁二酸钠为碳源时，NO₃ ^--N去除率最高为82.25％，而以柠檬酸钠为碳源时NO₃ ^--N去除率仅67.44％；Halomonas sp.F10菌株以乙酸钠为碳源时，NO₃ ^--N去除率最高为92.71％，柠檬酸钠为碳源时NO₃ ^--N去除率仅48.10％；不同菌株利用同一种碳源时脱氮效率也不同，例如Achromobacter sp.L16菌株以柠檬酸钠为碳源，NO₃ ^--N去除率最高为99.15％，TN去除率仅38.85％；Pseudomanas mendocina PJ21菌株以柠檬酸钠为碳源时，NO₃ ^--N去除率最高为81.24％。

C/N对XN9好氧反硝化性能的影响

其余条件不变，C/N分别设成10、30、50、80、100、150，将XN9种子液接种至好氧反硝化培养基，30℃，150rpm培养24h，取样检测OD₆₀₀、pH值、TN以及NO₂ ^--N的含量，每个处理设置三组平行实验。

碳源和氮源是菌株生长代谢所必需的的能源，除了碳源和氮源对菌株的脱氮效果有重要影响外，C/N也会影响菌株的生长速率和好氧反硝化脱氮性能。当C/N过低时，培养基中不能向生长中的菌体供给充分的碳源，致使菌体生长缓慢，对NO₃ ^--N的去除率降低，不能充分发挥菌株自身的脱氮性能；当培养基中的C/N过高时，会出现营养物质过剩，抑制菌体的生长和脱氮。菌株XN9在C/N不同时，生长与反硝化性能的规律如图10所示：当C/N为10-50时，菌株XN9的生物量OD₆₀₀值较高，菌株生长速度较快，而当C/N为80-200范围内菌株生长缓慢。当C/N为10-50时，NO₃ ^--N去除率均为98.50％左右，可知菌株XN9脱氮耐受C/N范围为10-50，此时碳源提供足够的能源以供细胞代谢，使XN9处于生长和反硝化作用的稳定阶段，其中当C/N为20时，菌株XN9的生物量与对NO₃ ^--N和TN去除率均达到最高值，因此XN9好氧反硝化脱氮的最佳C/N为20；当C/N超过50时，XN9对NO₃ ^--N和TN去除率逐渐降低。

与目前报道的大部分菌株相比，XN9好氧反硝化脱氮C/N范围较宽，脱氮效率较高。例如，Pseudomona sp.B菌株在好氧反硝化培养基的C/N在0～18范围内时，菌株对NO₃ ^--N去除率逐渐上升，最高可达98.00％，当C/N>18时，随着C/N升高NO₃ ^--N去除率逐渐降低；Diutina rugosa DW-1菌株在C/N为25时，NO₃ ^--N去除率最高88.30％，当C/N>25时，NO₃ ^--N去除率显著下降。相比之下，菌株XN9在C/N处于10-50时NO₃ ^--N去除率98.50％以上，可见XN9耐受的C/N范围较宽，好氧反硝化脱氮率更高，适用于多种类型废水的脱氮处理，例如低C/N的生活废水，高C/N的屠宰场废水。

培养条件对XN9好氧反硝化性能的影响

采用响应面法Box-Behnken设计了三因素三水平试验探究pH、温度、装量三者影响因素对菌株XN9反硝化性能的交互影响。其余条件不变，将XN9种子液接种到不同装量的反硝化培养基的250mL三角瓶中，30℃，150rpm培养24h，经4000rpm离心10min，取上清液检测NO₃ ^--N含量，每个处理设置三组平行实验。

根据NO₃ ^--N去除率拟合出响应面模型，实验设计的因素与水平如表8所示。

表8 Box-Behnken实验设计的因素与水平

a：培养器皿为250mL三角瓶

利用Design expert V8.0.6软件中进行响应面实验设计与分析，实验方案和结果如表10所示。

表10 Box-Behnken实验设计与结果

编号	温度(℃)	pH	装量(mL)	NO<sub>3</sub><sup>-</sup>-N去除率(％)
					1	25	6.5	100	90.38
2	35	6.5	100	85.79
					3	25	8.5	100	94.15
4	35	8.5	100	91.17
					5	25	7.5	70	91.07
6	35	7.5	70	94.83
					7	25	7.5	130	94.01
8	35	7.5	130	84.94
					9	30	6.5	70	93.95
10	30	8.5	70	87.67
					11	30	6.5	130	86.87
12	30	8.5	130	93.65
					13	30	7.5	100	95.96
14	30	7.5	100	95.09
					15	30	7.5	100	96.10
16	30	7.5	100	96.03
					17	30	7.5	100	95.98

通过Design Expert V8.0.6软件处理实验数据，得到二次回归方程：

R＝95.83-1.61A+1.21B-1.01C+0.40AB-3.21AC+3.27BC-2.39A²-3.07B²-2.23C²

其中R代表硝酸盐氮去除率，A为温度，B为pH，C为装量的编码值。方差分析数据如表11所示，F值为11.39，P值为0.0021(P<0.01)，表明这个实验设计是有意义的。

表11 Box-Behnken实验结果方差分析

方差来源	平方和	自由度	均方	F值	P值
						Model	219.22	9	24.36	11.39	0.0021**
A-温度	20.74	1	20.74	9.70	0.0170*
						B-pH	11.64	1	11.64	5.44	0.0524*
C-装量	8.10	1	8.10	3.79	0.0927*
						AB	0.65	1	0.65	0.30	0.5991
AC	41.15	1	41.15	19.24	0.0032**
						BC	42.64	1	42.64	19.94	0.0029**
A^2	24.07	1	24.07	11.26	0.0122*
						B^2	39.65	1	39.65	18.54	0.0035**
C^2	20.91	1	20.91	9.78	0.0167*
						残差	14.97	7	2.14
失拟项	14.27	3	4.76	27.18	0.0040
						纯误差	0.70	4	0.17
总误差	234.19	16

注：**为极显著(P<0.01)，*为显著(P<0.05)

温度与装量对NO₃ ^--N去除率的交互影响如图11(a)所示：从图11(a)左图的响应面来看，当250mL三角瓶装量接近于70mL，温度在25℃左右时，NO₃ ^--N去除率显著下降。从图11(a)右图的等高线来看，当温度为27-29℃，250mL三角瓶装量为90-110mL时，NO₃ ^--N去除率可达96.00％以上。等高线图呈椭圆形表明温度和装量交互作用显著，当温度与装量变化时，响应值的变化值相似。

温度与pH对NO₃ ^--N去除率的交互影响如图11(b)所示：从图11(b)左图的响应面来看，当温度趋近于35℃，pH为6.5左右时，NO₃ ^--N去除率显著下降。从图11(b)右图的等高线来看，当pH值为7.5-8.5，温度为25～32℃时，NO₃ ^--N去除率可达96.00％以上。等高线形状为椭圆形代表pH与温度之间具有极显著的交互影响，响应面呈钟罩形，响应值随温度的改变发生了更明显的变化，说明温度对NO₃ ^--N去除率影响更显著。

装量和pH对NO₃ ^--N去除率的交互影响如图11(c)所示：从图11(c)左图的响应面来看，当装量接近130mL,pH为6.5左右时为NO₃ ^--N去除率显著下降。从图11(b)右图的等高线来看，当pH值为7.5-8.5，温度为25-32℃时，NO₃ ^--N去除率可达94.00％以上。等高线的形状呈椭圆形代表pH与装量之间具有显著的交互影响，响应面呈钟罩形，响应值随装量的改变发生了更明显的变化，说明装量对NO₃ ^--N去除率的影响更大。

根据软件分析得出菌株XN9好氧反硝化脱氮条件为pH为8.03，装量为250mL三角瓶装122mL，温度为26℃。

NO₃ ^--N浓度对XN9好氧反硝化性能的影响

将XN9种子液接种到初始NO₃ ^--N浓度设成100、300、500、800mg·L^-1的好氧反硝化培养基，30℃，150rpm培养7d，每天检测OD₆₀₀、pH值、TN以及NO₃ ^--N的含量，每个处理设置三组平行实验。

菌株XN9在NO₃ ^--N浓度不同时，其生长和好氧反硝化脱氮性能的影响如图12所示：NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1时，XN9菌体生物量OD₆₀₀达到0.430，NO₃ ^--N去除率为94.85％，TN去除率为94.98％；NO₃ ^--N浓度为300mg·L^-1时，经过3d培养，XN9菌体生长进入稳定生长期，菌体生物量OD₆₀₀达到0.806,NO₃ ^--N去除率为99.97％,TN去除率为98.80％；NO₃ ^--N浓度为500mg·L^-1时，经过5d培养后，XN9菌体生长量OD₆₀₀达到1.051，进入稳定生长期，NO₃ ^--N和TN去除率高至99.95％和98.83％；当NO₃ ^--N浓度为800mg·L^-1时，菌株XN9基本不生长，基本没有发挥脱氮作用。当NO₃ ^--N浓度为100～500mg·L^-1时，菌株XN9的生长状况良好，生物量OD600从0.430上升至1.051，并且NO₃ ^--N和TN去除率高，具有良好的脱氮能力，能够将NO₃ ^--N几乎完全去除。

与已报道的部分菌株相比，XN9可以耐受更高浓度NO₃ ^--N，脱氮效率更高。例如，Acinetobacter sp.TN-4菌株在NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率仅为58.28％；菌株Halomonas sp.F1当NO₃ ^--N浓度为400mg·L^-1时，NO₃ ^--N去除率仅为70.17％。相比之下，菌株XN9当NO₃ ^--N浓度在100-500mg·L^-1范围内，NO₃ ^--N去除率均达到94.85％以上，可见XN9对高浓度NO₃ ^--N具有更优良的耐受性，在污水处理中去除高浓度NO₃ ^--N方面有一定的应用价值，例如NO₃ ^--N浓度高的生活污水、工业废水等。

氮平衡分析

其余条件不变，将XN9种子液接种到初始NO₃ ^--N浓度为100mg·L^-1的好氧反硝化培养基，30℃，150rpm条件下培养3d，每天测定OD₆₀₀、pH值，NH₄ ⁺-N、NO₂ ^--N、NO₃ ^--N以及TN的含量，每个处理设置三组平行实验。

HN-AD菌对氮源的利用主要有同化和异化两种形式，一部分无机氮被还原催化为气态氮，另一部分通过同化作用被细菌转化为自身所需物质。菌株XN9在好氧反硝化培养过程中各种氮含量变化如表10所示：初始培养基中的氮素形式是NO₃ ^--N，反硝化过程中，NO₃ ^--N的含量迅速减少，培养3d后培养基中71.64％的NO₃ ^--N转化为气态氮，19.69％的NO₃ ^--N通过同化作用变成胞内氮；伴随着NO₃ ^--N的去除，培养基中无机氮只有0.97mg·L^-1NH₄ ⁺-N和0.15mg·L^-1NO₃ ^--N，没有NO₂ ^--N积累；好氧反硝化培养3d后，有机氮含量为7.09mg·L^-1。

菌株XN9在好氧反硝化过程中主要通过好氧反硝化作用去除NO₃ ^--N，将其转化为气态氮，只有少部分同化为胞内氮，这与目前已报道的大部分HN-AD菌株相似。例如，初始NO₃ ^--N为277.20mg·L^-1时，Diaphorobacter sp.PDB3菌株将67.30％的NO₃ ^--N转化为气态氮，29.00％的NO₃ ^--N被同化为胞内氮；初始NO₃ ^--N为225.65mg·L^-1时，Delftia YH01菌株将约78％的NO₃ ^--N转化为气态氮，17.24％的NO₃ ^--N被同化为胞内氮。

表12 氮平衡分析

XN9好氧亚硝化性能影响因素

C/N对XN9好氧亚硝化性能的影响

C/N分别设成10、30、50、80、100、150，其余条件不变，将XN9种子液接种到好氧亚硝化培养基，30℃，150rpm培养24h，取样检测OD₆₀₀、pH值、TN以及NO₂ ^--N的含量，每个处理设置三组平行实验。

XN9生长与亚硝化性能情况如图13所示：当C/N为10、30和50时，菌株XN9的OD₆₀₀值为0.370、0.357、0.361，生长状况良好；当C/N为80、100、150时菌株生长缓慢甚至几乎不生长，菌体生物量显著降低。当C/N为10、30和50时，NO₂ ^--N去除率分别为98.81％、99.09％和95.73％；当C/N为80、100和150时，NO₂ ^--N去除率显著降低，分别为12.27％、9.02％和3.26％，可知C/N处于10～50范围内比较适宜菌株XN9生长，同时具有良好的好氧亚硝酸盐脱氮作用，而当C/N处于80～150范围内时已经超过了菌体生长所需的量，造成碳源过剩，抑制了菌体的生长。

与目前报道的大部分菌株相比，XN9好氧亚硝化脱氮C/N范围较宽，脱氮效率较高。例如：Bacillus scereu CZ1菌株当C/N为6时，NO₂ ^--N去除率达到最大值99.44％，当C/N＞6时NO₂ ^--N去除率明显下降；Bacillus licheniformis F6菌株当C/N处15-20范围时，NO₂ ^--N去除率均达100％，而后NO₂ ^--N去除率降低。相比之下，菌株XN9在C/N为10-50范围内时NO₂ ^--N去除率均达到了95.73％以上，可见XN9好氧亚硝化脱氮C/N范围较宽，可耐受高负荷碳源，好氧亚硝化脱氮率较高，在处理高C/N的NO₂ ^--N废水方面具有潜在价值。

NO₂ ^--N浓度对XN9好氧亚硝化性能的影响

其余条件不变，将XN9种子液接种到NO₂ ^--N浓度分别设成100、300、500、800mg·L^-1的好氧亚硝化培养基，30℃，150rpm培养7d，每天取样检测OD₆₀₀、pH值、TN以及NO₂ ^--N的含量，每个处理设置三组平行实验。

菌株XN9在NO₂ ^--N浓度不同时，其生长与脱氮情况如图14所示：在NO₂ ^--N浓度为100mg·L^-1的培养基中，XN9菌株培养1d后达到最高菌体生物量OD₆₀₀为0.344，进入菌体生长稳定期，NO₂ ^--N含量降低至0.88mg·L^-1,NO₂ ^--N的去除率达到99.06％，TN被完全去除。NO₂ ^--N浓度为300、500以及800mg·L^-1时，菌株生长速度慢，NO₂ ^--N的去除率显著下降，分别为5.64％、7.52％、4.49％，几乎没有发挥好氧亚硝化脱氮作用。由此可见，菌株XN9在100mg·L^-1NO₂ ^--N浓度条件下具有良好的生长状况和好氧亚硝化作用，而当NO₂ ^--N浓度在300～800mg·L^-1范围内时，NO₂ ^--N去除率极低，不适应NO₂ ^--N浓度高的环境。

与已报道的部分菌株同一条件下相比，XN9具有更优良的好氧亚硝化脱氮性能。例如，Acinetobacter sp.HA2菌株在NO₂ ^--N浓度为80mg·L^-1时TN去除率只有83.86％。Pseudomonas sp.HG-7菌株在NO₂ ^--N浓度为91.40mg·L^-1时TN去除率只有40.00％。相比之下，菌株XN9在NO₂ ^--N浓度为100mg·L^-1时NO₂ ^--N去除率高达99.06％，可见XN9具有优良的好氧亚硝化脱氮性能。

XN9异养硝化性能影响因素

C/N对XN9异养硝化性能的影响

其余条件不变，C/N分别设成10、30、50、80、100、150，将XN9种子液接种到100mL异养硝化培养基，30℃，150rpm培养24h，取样检测OD₆₀₀、pH值、TN以及NH₄ ⁺-N的含量，每个处理设置三组平行实验。

XN9生长与异养硝化性能情况如图15所示：当C/N设成10和30时，经24h培养后，菌株XN9的生物量OD₆₀₀达到了最大值，分别为0.436、0.399，菌株生长速度较快，而当C/N为50、100、150时，XN9菌株生长缓慢甚至几乎不生长。当C/N为10、30时，NH₄ ⁺-N去除率高达92.42％和92.30％，TN去除率高达98.96％和95.15％；当C/N处于50-150时，NH₄ ⁺-N去除率较低。由此可见，C/N处于10-30范围内比较适宜菌株XN9生长，并且对NH₄ ⁺-N的去除率达到最大值，而当C/N达到80以上已经超过了菌体生长所需的量，碳源过剩，抑制了菌体的生长，进一步抑制了XN9菌株的异养硝化脱氮性能。。

与目前报道的大部分菌株相比，XN9异养硝化脱氮C/N范围较宽，脱氮效率较高。例如，Bacillus hwajinpoensis SLWX2菌株在C/N处于5-25范围内时NH₄ ⁺-N去除率逐渐上升，在C/N为25时NH₄ ⁺-N去除率达到最大值为45.70％，C/N继续增大后菌体生长受到限制，NH₄ ⁺-N去除率也相应下降。Bacillus subtilis ZF2-3菌株在C/N为15时NH₄ ⁺-N去除率达到最大值71.87％，当C/N大于20时NH₄ ⁺-N去除率显著下降。相比之下，菌株XN9在C/N为10-30范围内时NH₄ ⁺-N去除率均达到了92.30％以上，可见XN9在C/N范围较宽条件下，均表现出较强的异养硝化脱氮性能，，碳源浓度较低的条件下，异养硝化脱氮率仍然保持较高水平，处理低C/N的NH₄ ⁺-N废水处理中更具有一定应用价值。

NH₄ ⁺-N浓度对XN9异养硝化性能的影响

其余条件不变，将XN9种子液接种到NH₄ ⁺-N浓度分别设成100、300、500、800mg·L^-1的100mL异养硝化培养基，30℃，150rpm培养7d，每天取样检测OD₆₀₀、pH值、TN以及NH₄ ⁺-N的含量，每个处理设置三组平行实验。

菌株XN9在NH₄ ⁺-N浓度不同时，其生长与脱氮情况如图16所示：在NH₄ ⁺-N浓度为100mg·L^-1时，菌株XN9经培养1d后菌体生物量OD₆₀₀达到最大值0.425，NH₄ ⁺-N去除率达到99.71％。当NH₄ ⁺-N浓度大于300mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N去除率开始下滑，分别为77.90％、62.87％和8.30％。由此可见，菌株XN9在100-500mg·L^-1NH₄ ⁺-N浓度条件下具有良好的生长状况和异养硝化作用，可耐受较高浓度NH₄ ⁺-N。

与已报道的大部分菌株相比，XN9可以耐受更高浓度NH₄ ⁺-N，脱氮效率更高。例如，Cupriavidus sp.S1菌株在NH₄ ⁺-N浓度为300mg·L^-1和500mg·L^-1时NH₄ ⁺-N去除率分别为94.98％和45.71％；Pseudomonas putida ZN1菌株在NH₄ ⁺-N浓度为300mg·L^-1和500mg·L^-1时NH₄ ⁺-N去除率仅72.60％和38.70％；Acinetobacter sp.YN3菌株在NH₄ ⁺-N浓度为150mg·L^-1时，NH₄ ⁺-N去除率仅18.7％。相比之下，当NH₄ ⁺-N浓度在100-500mg·L^-1范围内时，菌株XN9的NH₄ ⁺-N去除率均达到62.87％以上，可见XN9对高浓度NH₄ ⁺-N具有更优良的耐受性，在处理高浓度NH₄ ⁺-N废水方面具有一定应用前景，例如化肥厂、石油化工厂等污染废水。

结论

(1)HN-AD菌株XN9的菌落呈淡黄色，质地黏滑，不易挑取，具有nap和nir S功能基因，命名为Pseudomonas stutzeri XN9。

(2)菌株XN9能够利用NO₃ ^--N、NO₂ ^--N和NH₄ ⁺-N为氮源进行生长与脱氮作用，对NO₃ ^--N、NO₂ ^--N和NH₄ ⁺-N去除率均超过98.00％，可见具有优良的好氧反硝化和异养硝化脱氮性能。(3)单因素和响应面优化实验表明：在反硝化过程中，菌株XN9的最适碳源是柠檬酸钠，pH 8.03，C/N＝20，温度26℃，250mL三角瓶装量为122mL，此条件下XN9具有优良的好氧反硝化作用；氮平衡分析表明菌株XN9将NO₃ ^--N主要通过好氧反硝化作用转化为气态氮，少部分通过细胞同化作用转化成胞内氮，几乎不积累中间代谢物；菌株XN9在C/N为10-50范围内时NO₃ ^--N去除率均高达98.50％以上，菌株XN9可耐受NO₃ ^--N浓度为100～500mg·L^-1。可见，XN9耐受的C/N范围宽且具有高效的好氧反硝化脱氮作用，对高浓度NO₃ ^--N具有优良的耐受性，在处理高C/N和高浓度NO₃ ^--N废水领域具有相当大的潜力。

(4)好氧亚硝化脱氮作用时，菌株XN9在C/N为10～50范围内时NO₂ ^--N去除率均高达95.73％以上，可耐受NO₂ ^--N浓度是100mg·L^-1。异养硝化脱氮作用时，菌株XN9在C/N为10～30范围内时NH₄ ⁺-N去除率均达到了92.30％以上，可耐受NH₄ ⁺-N浓度为100～500mg·L^-1。可见，菌株XN9在C/N范围较宽的条件下，具有优良的好氧亚硝化和异养硝化脱氮能力，适用于高C/N废水的脱氮处理且在处理高浓度NH₄ ⁺-N废水领域具有较强的应用价值。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims

1. 一种异养硝化-好氧反硝化菌，其特征在于，所述异养硝化-好氧反硝化菌菌株为施氏假单胞菌XN9（Pseudomonas stutzeri XN9），保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2019年3月25日，保藏编号为GDMCC No：60532。

2.权利要求1所述的异养硝化-好氧反硝化菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

将施氏假单胞菌XN9接种于LB培养基中，25-35℃，100-200 rpm培养10-15h，所得菌悬液离心去除上清液，洗涤后加无菌水制成OD₆₀₀为0.6～0.8的菌悬液。

3.一种如权利要求1所述的异养硝化-好氧反硝化菌在处理含氮废水中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述含氮废水含NH₄ ⁺、NO₃ ^-和 NO₂ ^-中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述含氮废水为含NH₄ ⁺废水时，施氏假单胞菌XN9以柠檬酸钠为碳源、NH₄ ⁺-N为氮源进行异养硝化脱氮；所述含NH₄ ⁺废水的C/N比值为10～30，所述NH₄ ⁺的浓度为100mg·L^-1～500mg･L^-1。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述含氮废水为含NO₃ ^-废水时，施氏假单胞菌XN9以柠檬酸钠为碳源、NO₃ ^-为氮源进行好氧反硝化脱氮；所述含NO₃ ^-废水的C/N比值为10～50，所述NO₃ ^-的浓度为100mg·L^-1～500mg･L^-1。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述含氮废水为含 NO₂ ^-废水时，施氏假单胞菌XN9以柠檬酸钠为碳源、NO₂ ^-为氮源进行好氧亚硝化脱氮；所述含NO₂ ^-废水的C/N比值为10～50，所述NO₂ ^-的浓度为50mg·L^-1～150mg･L^-1。