CN114317312A - 一种成都假单胞菌bf6及其脱氮应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)BF6及其脱氮应用，所述成都假单胞菌BF6菌株于2021年5月26日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61684。所述成都假单胞菌是一株高效异养硝化‑好氧反硝化细菌，不仅能够高效脱除水中的单独存在的氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮，亦能在混合氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮多种氮源的水体中进行高效除氮。该菌株对水生动物安全无毒，因此除适用于一般含氮废水除氮外，也能应用于改善养殖水体环境。

Description

一种成都假单胞菌BF6及其脱氮应用

技术领域

本发明属于环境微生物领域，涉及一种成都假单胞菌BF6及其脱氮应用。

背景技术

含氮废水是目前环境污染治理中的重大问题，大量氨氮废水排入水体不仅引起水体富营养化、造成水体黑臭，给水处理的难度和成本加大，甚至对人群及生物产生毒害作用。

近年来，污水脱氮处理技术不断发展，涌现了很多新方法和手段。其中生物脱氮技术能耗低，易于操作，无二次污染且成本低，是一项极具发展前景的技术，许多研究者投身其中，致力于提高脱氮效率，缩短脱氮工艺，降低污水处理成本的研究，并从土壤、深海火山口、污泥、湖水等处分离出多种具有脱氮活性的细菌。如潘玉瑾等在SBR好氧反硝化反应器的活性污泥中分离出一株P.chengduensis ZPQ2菌株，能去除水中的氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮(潘玉瑾，刘芳，孟爽，等.好氧反硝化菌P.chengduensis ZPQ2的筛选及其反硝化条件优化.环境工程,2016,41-45)。然而该菌株ZPQ2利用亚硝酸盐氮进行好氧反硝化的能力较差(48h去除率仅28.64％)；对氨氮的脱氮效果亦有限(24h去除率42.08％)，且并未记载当水中含有多种不同氮源时，该菌株是否能够同时进行脱除。

因此，有必要寻求一种新的细菌株系，拓展该菌种在处理含氮废水中的实际应用与有效提高脱氮的效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一株能高效降解含有NO₂-N、NO₃-N、NH₄-N不同形态氮水体的异养硝化好氧反硝化细菌。

本发明的首要目的是提供一株成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)BF6菌株。

本发明另一目的是提供成都假单胞菌BF6菌株在制备脱氮剂中的应用。

本发明另一目的是提供一种含有成都假单胞菌BF6菌株和/或其菌悬液的脱氮剂。

本发明另一目的是提供上述成都假单胞菌BF6菌株在水体中脱氮的应用。

本发明另一目的是提供一种改善养殖水体环境的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一株成都假单胞菌BF6，于2021年5月26日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61684。

本发明的成都假单胞菌BF6分离自澳洲青龙虾循环水养殖车间的生物滤池中多孔环形生物填料，经分离纯化得到的成都假单胞菌BF6，革兰氏染色显示呈阴性，该菌株在20℃～40℃、转速100～300rpm，pH6～9、盐度0～50‰条件下均可以正常生长，更优选的生长条件为，温度为25～35℃，转速为250rpm，盐度为20‰，pH为7。

本发明的成都假单胞菌BF6是一株高效异养硝化-好氧反硝化细菌。在氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮同时存在的情况下，在氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮分别作为氮源的情况下，在水体中均具有很好的脱氮活性。

因此该菌株在氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮个别作为单一氮源，以及三者同时存在的情况下，在水体中进行脱氮的应用，均在本发明的保护范围之内。

基于上述应用，一种含有上述成都假单胞菌BF6菌株和/或其菌悬液的脱氮剂也在本发明的保护范围之内。

本发明的成都假单胞菌BF6经实验发现对水产品无害，因此其在水产养殖水体中进行脱氮的应用，也在本发明的保护范围之内。

另外，一种应用成都假单胞菌BF6改善养殖水体的方法，也在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

1.本发明的成都假单胞菌BF6是一株高效异养硝化-好氧反硝化细菌：在氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮同时存在的情况下，12h氨氮去除达到94.1％，硝酸盐氮去除率达到100％，亚硝酸盐去除率达到99.7％，总氮去除率达到85.4％；

在氨氮作为唯一氮源的情况下，12h氨氮去除达到98.2％，硝酸盐氮去除率达到100％，总氮去除率达到89.2％；

在硝酸盐作为单一氮源的情况下，24h硝酸盐氮去除率达到99.9％，总氮去除率达到57.9％；

在亚硝酸盐作为单一氮源的情况下，24h硝酸盐氮去除率达到100％，亚硝酸盐氮去除率达到81.1％，总氮去除率达到76.2％。

2.本发明的成都假单胞菌BF6对水产品安全无毒，因此适合使用在水产养殖水体中脱氮。

附图说明

图1为本发明的成都假单胞菌BF6在LB固体培养基上的菌落形态；

图2为本发明的成都假单胞菌BF6的革兰氏染色(×100)；

图3为本发明的成都假单胞菌BF6的进化树；

图4为本发明的成都假单胞菌BF6在不同温度(A)、转速(B)、盐度(C)和pH(D)条件下的生长曲线图；

图5为本发明的成都假单胞菌BF6的异养硝化好氧反硝化性能曲线；

图6为本发明的成都假单胞菌BF6的硝化性能曲线；

图7为本发明的成都假单胞菌BF6的反硝化性能曲线(以硝酸盐为唯一氮源)；

图8为本发明的成都假单胞菌BF6的反硝化性能曲线(以亚硝酸盐为唯一氮源)；

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1菌株BF6的分离纯化与鉴定

1.菌株BF6的分离纯化

S1、取样

在北京锦成达养殖有限公司的澳洲青龙虾循环水养殖车间，取生物滤池中多孔环形生物填料置于4℃冰箱保存，备用于富集分离；

S2、初筛

取5g多孔环形生物填料用PBS冲洗一遍，再将生物填料表面的生物膜用灭菌解剖刀刮入到加入含有30mL纯水的50mL的离心管中，震荡约30s后，倒入含有120mL富集分离培养基的锥形瓶中，置于30℃，200r/min的摇床中恒温培养7d。取15mL培养液，加入到含有135mL富集分离培养基的锥形瓶中，在30℃，200r/min的条件下培养7d。重复以上操作两次，取第四次富集的培养液进行梯度稀释将其稀释至10^-3、10^-4、10^-5，取稀释液各150μL，涂布至富集分离固体培养基，每个稀释浓度各做3个重复，置于30℃恒温培养箱中培养3d。选取固体培养基上的单菌落，接种至富集分离固体培养基平板上进行纯化培养，经过多次分离纯化培养后获得纯种菌株；

S3、复筛

将上述获得纯种待测菌株分别接种于同步硝化反硝化培养基、异养硝化培养基、反硝化培养基(分别以硝酸盐、亚硝酸盐作为唯一氮源)中，置于30℃，200r/min的恒温摇床中培养24h，每隔4h检测培养液中NH₄-N，NO₃-N，NO₂-N，TN，选择TN含量最低的一株菌，记为菌株BF6。

其中，NO₂-N含量采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定；NO₃-N含量测定采用酚二磺酸法测定；NH₄-N含量采用纳氏试剂法测定；TN的含量采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定。

上述富集分离固体培养基包括如下含量的组分：0.7g/L的KNO₃、2.75g/L的葡萄糖、1.24g/L的KH₂PO₄·2H₂O、3.046g/L的K₂HPO₄·3H₂O、4g/L的NaCl，3mL的微量元素溶液以及15g/L的琼脂，该富集分离固体培养基的pH为7.5；其中的微量元素溶液包括如下含量的组分：3g/L的MgSO₄·7H₂O、1.12g/L的H₃BO₃、3g/L的MnSO₄、0.3g/L的FeSO₄·7H₂O、3g/L的ZnSO₄·7H₂O、0.6g/L的CaCl₂。

2.菌株BF6的鉴定

(1)菌株BF6菌落形态

经分离纯化得到的高效脱氮异养菌株BF6，在LB固体培养基上的菌落形态如图1所示，成椭圆形，边缘整齐、米黄色、直径约3mm的菌落；革兰氏染色显示呈阴性(图2)；

(2)菌株BF6的生理生化特征如表1：

表1菌株BF6主要的生理生化特征

(3)菌株BF6的16S rRNA基因测序与鉴定

用细菌DNA提取试剂盒提取待测菌株的细菌基因组DNA，具体操作步骤参照说明书。以提取的细菌基因组DNA作为模板，对细菌进行扩增，扩增16S rRNA的引物：

27F：5′–GTTTGATCCTGGCTCAG–3′；

1492R：5′–TACGGCTACCTTGTTACGACTT–3′。

反应体系(50μL)为：模板DNA1μL，正反向引物各1μL，Mix 25μL，灭菌蒸馏水22μL，PCR扩增的反应条件：95℃4min；95℃30s，53℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。PCR产物送至广州天一辉远基因科技有限公司进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。

将所得上述序列SEQ ID NO.1经NCBI网站的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行在线比对分析，构建进化树(图3)。

结合上述菌株的菌落形态、生理生化特征以及分子鉴定，鉴定菌株BF6属于成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)，命名为成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)BF6。

该菌株已于2021年5月26日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，菌种名称：成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)BF6，保藏编号为GDMCC NO.61684。

实施例2菌株BF6的生物安全性

通过浸泡法来检测菌株BF6对罗非鱼的安全性。7d的浸泡实验结果表明，BF6水体浓度在1.0×10⁶CFU/mL，1.0×10⁷CFU/mL及1.0×10⁸CFU/mL的条件下，体长24.31±6.95mm，体重0.57±0.19g的罗非鱼并没有出现死亡及其他异常现象。以上结果表明BF6是一株生物安全性能好的菌株。

实施例3菌株BF6生长条件

经过大量的培养实验得出，菌株BF6在20℃～40℃、转速100～300rpm，pH6～9、盐度0～50‰条件下均可以正常生长。其最佳生长条件：温度为25～35℃，转速为250rpm，盐度为20‰，pH为7(图4)。

实施例4菌株BF6脱氮活性(以氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐作为氮源)

1、实验方法

按照2％(V/V)的接种量，将3×10⁹CFU/mL的BF6菌液加入150mL下列同步硝化反硝化培养基中：柠檬酸三钠5.0g/L，KNO₂ 0.025g/L，NaNO₃ 0.132g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.05g/L，NaCl0.01g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄ 0.01g/L，微量元素1ml/L，该同步硝化反硝化培养基的pH为7.2。设置3个平行，在200rmp(DO＝6.26mg/L)、35℃条件下培养24h。每隔4h取样，测定OD₆₀₀及NO₂ ^--N、NO₃ ^--N、NH₄ ⁺-N、TN浓度。

表2菌株BF6的异养硝化好氧反硝化初始条件

2、实验结果

在氨氮、硝酸盐和亚硝酸盐同时存在的情况下，菌株BF6具有良好的脱氮能力，12h氨氮去除达到94.1％，硝酸盐氮去除率达到100％，亚硝酸盐去除率达到99.7％，总氮去除率达到85.4％(表3、图5)：

表3菌株BF6的异养硝化好氧反硝化脱氮能力

实施例5菌株BF6脱氮活性(以氨氮作为氮源)

1、实验方法

按照2％(V/V)的接种量，将3×10⁹CFU/mL的BF6菌液加入150mL下列异养硝化培养基：柠檬酸三钠5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，NaCl 0.01g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.05g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄ 0.01g/L，pH 7.0～7.2，微量元素1ml/L。设置3个平行，在200rmp(DO＝6.26mg/L)、35℃条件下培养24h。每隔4h取样，测定OD₆₀₀及NO₂ ^--N、NO₃ ^--N、NH₄ ⁺-N、TN浓度。

表4菌株BF6的异养硝化反应初始条件

2、实验结果

在氨氮作为唯一氮源的情况下，菌株BF6具有良好的脱氮能力，12h氨氮去除达到98.2％，硝酸盐氮去除率达到100％，总氮去除率达到89.2％(表5、图6)：

表5菌株BF6的硝化脱氮能力

实施例6菌株BF6脱氮活性(以硝酸盐氮作为氮源)

1、实验方法

按照2％(V/V)的接种量，将3×10⁹CFU/mL的BF6菌液加入150mL下列反硝化培养基(硝酸盐为唯一氮源)：柠檬酸三钠5.0g/L，NaNO₃ 1.056g/L，NaCl0.01g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄0.01g/L，pH 7.2，微量元素1ml/L。设置3个平行，在200rmp(DO＝6.26mg/L)、35℃条件下培养24h。每隔4h取样，测定OD₆₀₀及NO₂ ^--N、NO₃ ^--N、NH₄ ⁺-N、TN浓度。

表6菌株BF6的异养硝化反应初始条件(以硝酸盐为唯一氮源)

2、实验结果

在硝酸盐作为唯一氮源的情况下，菌株BF6具有良好的脱氮能力，24h硝酸盐氮去除率达到99.9％，总氮去除率达到57.9％(表7、图7)：

表7菌株BF6的反硝化脱氮能力(以硝酸盐为唯一氮源)

实施例7菌株BF6脱氮活性(以亚硝酸盐氮作为氮源)

1、实验方法

按照2％(V/V)的接种量，将3×10⁹CFU/mL的BF6菌液加入150mL下列反硝化培养基(亚硝酸盐为唯一氮源)：柠檬酸三钠5.0g/L，KNO₂ 0.5g/L，NaCl0.01g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.05g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄0.01g/L，pH 7.2，微量元素1ml/L。

表8菌株BF6的异养硝化反应初始条件(以亚硝酸盐为唯一氮源)

2、实验结果

在亚硝酸盐作为唯一氮源的情况下，菌株BF6具有良好的脱氮能力，24h硝酸盐氮去除率达到100％，亚硝酸盐氮去除率达到81.1％，总氮去除率达到76.2％(表9、图8)：

表9菌株BF6的反硝化脱氮能力(以亚硝酸盐为唯一氮源)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 一种成都假单胞菌BF6及其脱氮应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1370

<212> DNA

<213> 成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis BF6)

<400> 1

tgatttagcg gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg cctggtagtg ggggataacg 60

ttccgaaagg aacgctaata ccgcatacgt cctacgggag aaagcagggg accttcgggc 120

cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa 180

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atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc 1020

ttgtccttag ttaccagcac gtaatggtgg gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc 1080

ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg 1140

ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcc cataaaaccg 1200

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tgaatcagaa tgtcacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1320

tgggagtggg ttgctccaga agtagctagt ctaaccttcg gggggacggt 1370

Claims (10)

1.一株成都假单胞菌(Pseudomonas chengduensis)BF6，其特征是：于2021年5月26日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO.61684。

2.权利要求1所述成都假单胞菌BF6菌株在制备脱氮剂中的应用。

3.一种脱氮剂，其特征在于，含有权利要求1所述成都假单胞菌BF6菌株和/或其菌悬液。

4.权利要求1所述成都假单胞菌BF6菌株在水体中脱氮的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述水体中以氨氮为唯一氮源。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述水体中以硝酸盐氮为唯一氮源。

7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述水体中以亚硝酸盐氮为唯一氮源。

8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述水体中同时存在氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮作为氮源。

9.根据权利要求4-8任一所述应用，其特征在于，所述水体为水产养殖水体。

10.一种改善养殖水体环境的方法，其特征在于，将权利要求1所述的成都假单胞菌BF6菌株接种于所述养殖水体中。

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