CN103981120B - 一株具有同步反硝化脱氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程、环境工程技术领域，涉及一株具有同步反硝化脱氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其应用。本发明提供的Bacillus Cereus P1K菌株已于2013年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013625。该菌株在缺氧条件下可同步进行反硝化脱氮和除磷，其反硝化能力和过量吸磷能力都较高，可以减少菌体对碳源和氧气的消耗和利用，非常适合应用于有机物含量较低的城市污水处理中，无需投加碳源，工艺简单，成本低廉且相对安全，有较强的实用价值。

Description

一株具有同步反硝化脱氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程、环境工程技术领域，具体涉及一株具有同步反硝化脱氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其应用。

背景技术

水体中适量的氮、磷元素是合成藻类等微生物的基本元素，是形成水生生态环境重要的物质条件，也是水环境良性循环的基础。但目前我国一些水体中氮和磷的含量已超过水体容量，过量的氮磷元素会导致水体藻类等生物异常增殖，引起水体富营养化现象和水质恶化。从水体生态系统全面健康发展的角度来看，当前我国环境问题的主要矛盾已经开始由COD逐渐转向氮、磷等营养物质的去除上来；同时，受纳水体的严重污染也已危及到人体的健康。因此，如何控制水体中氮磷元素的污染及对含氮磷废水的治理，已成为目前我国水污染防治中的重大问题。目前，我国已开始执行《城市污水处理厂污水综合排放标准》（GB18918-2002）一级A标准（氨氮＜5mg/L，总氮＜15mg/L，总磷＜1mg/L），城市污水处理的重点目标已经转向氮磷等营养物质的去除。同时，根据最新修改的《城镇污水处理厂污染物排放标准》规定：排入重点流域的城镇污水处理厂出水水质的执行标准由原有的一级B标准提升到一级A标准，这对我国新建和已建的污水处理厂都提出了对污水进行深度脱氮除磷技术的需求。因此，研究开发高效经济的脱氮除磷的方法和技术已成为当前水污染控制领域的热点之一。

相比于传统的化学脱氮除磷技术，生物脱氮除磷技术由于其具有运行成本小、无二次污染和处理效果好等优势，已成为脱氮除磷技术发展的主要趋势。传统生物脱氮除磷是将生物脱氮和生物除磷分为2个独立的步骤进行，其工艺和技术存在着一些弊端，如反硝化菌和除磷菌对碳源的竞争、污泥产量高、能耗高等。同步反硝化除磷理论和技术的出现给我们提供了全新的思路和视角。与传统专性好氧菌的除磷工艺相比，同步反硝化除磷技术能节省50%的COD和30%的耗氧量，相应减少剩余污泥量50%。因此，同步反硝化除磷技术被视为可持续的处理工艺。

同步反硝化脱氮除磷技术利用反硝化除磷菌在缺氧条件下，以硝酸盐为电子受体，同步完成反硝化（脱氮）和过量摄磷（除磷）过程，从而将反硝化脱氮和生物除磷这两个原本认为彼此独立的过程合二为一，使氧的消耗和对碳源的需求均得到相应节省。因此，同步反硝化除磷菌在水体脱氮除磷领域具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的发明目的在于提供一株具有同步反硝化脱氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其应用。本发明筛选得到的反硝化除磷菌，其在兼性环境下可以同时实现对硝酸盐或亚硝酸盐的还原和对磷的吸收，能有效去除废水中的氮和磷，有较强的应用价值。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一株具有同步反硝化脱氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌，该菌株命名为Bacillus Cereus P1K，已于2013年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），保藏单位地址：中国武汉 武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO：M2013625。

上述菌株Bacillus Cereus P1K属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.），宽度为1.0~1.2μm，长度为3.0~5.0μm。其生理生化鉴定结果：革兰氏染色阳性，异染颗粒染色阳性，PHB颗粒染色阳性，淀粉水解阳性，葡萄糖氧化发酵阳性，产吲哚阳性，明胶液化阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，M.R.阴性，V.P.阳性，柠檬酸盐利用阳性，硝酸盐还原阳性；菌体杆状，内生孢子，鞭毛侧生，运动；在空气中的固体培养基表面上生长良好；最适生长温度约为30℃，在10℃以下和45℃以上不生长；菌株Bacillus Cereus P1K在培养基上生长菌落形态为：白色，圆形，表面光滑，边缘整齐，菌落较分散。

上述菌株Bacillus Cereus P1K的16S rRNA基因序列特征为：16S rRNA基因序列长度为1519bp，通过程序进行同源性比较，表明与蜡样芽孢杆菌（Bacillus sp.）的亲缘关系最接近，具有99%的相似性，属于芽孢杆菌属。同时对菌株Bacillus Cereus P1K进行反硝化功能基因（亚硝酸盐还原酶基因nirS）的PCR扩增，扩增结果呈阳性，从分子生物学角度确认菌株Bacillus Cereus P1K具有反硝化功能。

本发明菌株Bacillus Cereus P1K在厌氧160min/好氧180min的SBR反应条件下进行试验，结果表明：厌氧结束时释磷量为13mg/L左右，好氧结束时对磷酸盐去除率可达93.8%。菌株Bacillus Cereus P1K在厌氧160min/缺氧180min的SBR反应条件下进行试验，结果表明：厌氧结束时释磷量为13mg/L左右，缺氧结束时对磷酸盐去除率可达70%，硝酸盐去除率达90.5%。因此证明该菌株Bacillus Cereus P1K能在好氧条件下以氧为电子受体进行过量吸磷，在缺氧条件下以硝酸盐氮为电子受体进行过量吸磷。表明本发明菌株Bacillus Cereus P1K为具有同步反硝化脱氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌，且反硝化能力和过量吸磷能力都较高。因此，本发明菌株Bacillus Cereus P1K可应用于污水生物脱氮除磷工艺，将其应用于污水处理，可以实现同步反硝化脱氮和脱磷的目标。

菌株Bacillus Cereus P1K是从实验室稳定运行的厌氧/好氧/缺氧SBR反应器中的活性污泥中分离筛选得到，具体的筛选方法为：

（1）首先，取10mL活性污泥至装有90mL无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠，将三角瓶放入摇床中充分振荡，使细菌呈单细胞状态分散于水中；然后，从三角瓶内的污泥菌悬液中取1mL悬液接入装有9mL无菌水的试管内，得到10^-1梯度的菌悬液，继续此步骤，依次得到10^-2、10^-3、10^-4……10^-7梯度的菌悬液，各取1mL水样放入培养皿种，待富磷培养基快凝却时倒入培养皿中，混匀，待培养基凝固后倒置培养皿于30℃恒温培养箱中培养2～3天后，挑选一个合适梯度的培养皿，然后分别选取不同形态、菌落清晰的典型菌落，标记并挑取单个菌落在平板培养基上进行三区划线分离，重复3～4次至菌落特征一致的单菌落，最后挑取单一菌落，转接到准备好的试管斜面上。

（2） 将步骤（1）己分离出来的菌株先在缺磷培养基中进行厌氧富集培养24h，以尽量耗尽菌体内的PHB颗粒，然后将富集培养好的菌液离心，用无菌蒸馏水洗涤，再离心，取菌沉淀投入到富磷培养基中进行吸磷试验，期间定时取培养液，检测培养液中PO₄ ^3--P浓度的变化，初步筛选出吸磷效果好的菌株；然后将其接种到硝酸盐还原培养基，进行硝酸盐还原产气试验的复筛，以考察其是否具有反硝化功能，取除磷效率高且具有硝酸盐还原产气能力的菌株，筛选得到本发明所述的反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K。

上述缺磷培养基为：CH₃COONa·3H₂O，3.23g/L；Na₂HPO₄·2H₂O，23mg/L；NH₄Cl，152.8mg/L；MgSO₄·7H₂O，81.12mg/L；K₂SO₄，17.83 mg/L；CaCl₂·2H₂O，11mg/L；HEPES buffer，7g/L；微量元素液，2mL/L；pH，7.2。

上述富磷培养基为：CH₃COONa·3H₂O，3.23g/L；KH₂PO₄，35mg/L；NH₄Cl，305.52mg/L；MgSO₄·7H₂O，91.26mg/L；CaCl₂·2H₂O，25.68mg/L；PIPES buffer，8.5g/L；微量元素液，2mL/L； pH，7.2。

其中微量元素液：EDTA，50g/L、FeSO₄·7H₂O，5g/L、CuSO₄·5H₂O，1.6g/L、MnCl₂·4H₂O，5g/L、(NH₄)₆Mo₇SO₂₄·4H₂O，1.1g/L、H₃BO₃，50mg/L、KI，10mg/L、CoCl₂·6H₂O，50mg/L。

上述硝酸盐还原培养基：牛肉膏，3g/L；蛋白胨，5g/L；KNO₃，1g/L；pH，7.4。

本发明筛选得到的反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K在好氧或缺氧条件下对磷酸盐具有降解能力，且在缺氧条件下可同步进行反硝化脱氮和除磷，与传统反硝化菌和除磷菌相比，减少了对碳源和氧气的消耗和利用。因此，该菌株非常适合应用于有机物含量较低的城市污水处理中，无需投加碳源，工艺简单，成本低廉且相对安全，有较强的实用价值。

附图说明

图1是本发明反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K的透射电镜照片。

图2是本发明反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K的16S rRNA系统发育树。

图3是本发明反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K在培养过程中的生长变化曲线。

图4是本发明反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K在厌氧/好氧SBR反应器中磷变化曲线。

图5是本发明反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K在厌氧/缺氧SBR反应器中氮磷变化曲线。

具体实施方式

实施例 1：菌株的分离、筛选和鉴定

（1）菌株的分离、纯化

取10mL实验室稳定运行的厌氧/好氧/缺氧SBR反应器中的活性污泥，将活性污泥放入装有90mL无菌水的三角瓶中，加入无菌玻璃珠，将三角瓶放入摇床中充分振荡，使细菌呈单细胞状态分散于水中；然后，从三角瓶内的污泥菌悬液中取1mL悬液接入装有9mL无菌水的试管内，得到10^-1梯度的菌悬液，继续此步骤，依次得到10^-2、10^-3、10^-4……10^-7梯度的菌悬液，各取1mL水样放入培养皿种，待富磷琼脂培养基快凝却时倒入培养皿中，混匀，待培养基凝固后倒置培养皿于30℃恒温培养箱中培养2～3天后，挑选一个合适梯度的培养皿；分别选取不同形态、菌落清晰的典型菌落，标记并挑取单个菌落在平板培养基上进行三区划线分离，重复3～4次至菌落特征一致的单菌落，最后挑取单一菌落，转接到准备好的试管斜面上以备用，所有操作均在无菌条件下进行。

（2）菌株的筛选

将步骤（1）己分离出来的各菌株进行富集培养：将菌株在缺磷培养基中30℃厌氧（充氮气）培养24h，摇床转速为140rpm，以尽量耗尽菌体内的PHB颗粒，然后将该菌液离心（8,000rpm，8min），无菌蒸馏水洗涤，再离心（8,000rpm，8min），留取菌沉淀，整个过程均需在无菌条件下进行；

将菌沉淀投入到富磷培养基中进行吸磷试验，摇床转速140rpm，温度30℃，期间定时取培养液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，检测滤液中PO₄ ^3--P浓度的变化，初步筛选出培养时间短，除磷效率高的菌株；

硝酸盐还原产气试验：取上述初筛的菌株，接种在带杜氏小管的硝酸盐还原培养基中，每个菌株作2个平行试验，同时另外留2管不接种作为对照，30℃恒温培养，分别在1天、3天、5天后检测结果：检查杜氏小管内是否产气，如有气泡表明有氮气产生；在比色瓷盘中加入少量培养液，滴入1～2滴格里斯试剂A液（对氨基苯磺酸，0.5g；体积浓度为10%左右的稀醋酸，150mL）和B液（α-苯胺，0.1g；体积浓度为10%左右的稀醋酸，150mL；H₂O，20mL），在对照管中同样加入A液和B液各1～2滴，判断结果：若溶液变为红色，橙色，或棕色等，表示有亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性；如无红色、橙色，或棕色等出现则可加入1～2滴二苯胺试剂（0.5g二苯胺溶于100mL浓H₂SO₄，并加20mL蒸馏水稀释，存于棕色瓶中），如不呈蓝色反应，则仍为阳性反应；若呈蓝色反应，则为阴性反应，表明其对应的菌株具有硝酸盐还原产气能力。取除磷效率高且具有硝酸盐还原产气能力的菌株即为筛选得到的反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K。

在菌株的分离和筛选过程中所用到的培养基有：

缺磷培养基：CH₃COONa·3H₂O，3.23g/L；Na₂HPO₄·2H₂O，23mg/L；NH₄Cl，152.8mg/L；MgSO₄·7H₂O，81.12mg/L；K₂SO₄，17.83 mg/L；CaCl₂·2H₂O，11mg/L；HEPES buffer，7g/L；微量元素液，2mL/L；pH，7.2。

富磷培养基：CH₃COONa·3H₂O，3.23g/L；KH₂PO₄，35mg/L；NH₄Cl，305.52mg/L；MgSO₄·7H₂O，91.26mg/L；CaCl₂·2H₂O，25.68mg/L；PIPES buffer，8.5g/L；微量元素液，2mL/L； pH，7.2。

微量元素液：EDTA，50g/L、FeSO₄·7H₂O，5g/L、CuSO₄·5H₂O，1.6g/L、MnCl₂·4H₂O，5g/L、(NH₄)₆Mo₇SO₂₄·4H₂O，1.1g/L、H₃BO₃，50mg/L、KI，10mg/L、CoCl₂·6H₂O，50mg/L。

硝酸盐还原培养基：牛肉膏，3g/L；蛋白胨，5g/L；KNO₃，1g/L；pH，7.4。

上述培养基如制成琼脂培养基，则添加琼脂1.5%（w/v），使用前均在121℃下灭菌20 min。

（3）菌种的生理生化特征

筛选得到的反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K属于芽孢杆菌属（Bacillus sp.），其透射电镜照片见图1，菌体宽度为1.0~1.2μm，长度为3.0~5.0μm。参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对反硝化除磷菌进行生理生化鉴定：革兰氏染色阳性，异染颗粒染色阳性，PHB颗粒染色阳性，淀粉水解阳性，葡萄糖氧化发酵阳性，产吲哚阳性，明胶液化阳性，接触酶阳性，氧化酶阴性，M.R.阴性，V.P.阳性，柠檬酸盐利用阳性，硝酸盐还原阳性；菌体杆状，内生孢子，鞭毛侧生，运动；在空气中的固体培养基表面上生长良好；最适生长温度约为30℃，在10℃以下和45℃以上不生长；反硝化除磷菌在培养基上生长菌落为白色，圆形，表面光滑，边缘整齐，菌落较分散。

（4）菌株的16S rRNA序列测定及发育分析

将菌株Bacillus Cereus P1K接种到LB液体培养基中培养12h（140rpm，30℃）以获得足够的菌量，采用细菌基因组DNA（小量）抽提试剂盒提取细菌基因组总DNA，以细菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增反应。

PCR扩增所用引物为：BSF08（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和BSR1541（5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）；PCR反应体系（25μL）：2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTPs（浓度为2.5mmol/L），2种引物各0.5μL，0.5μL DNA模板，0.5μL rTaq DNA聚合酶（5U/μL），无菌去离子水18.5μL；PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，58℃复性30s，72℃延伸3min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，经PCR扩增后目的DNA与pMD 18-T载体进行连接，并转化克隆，选取阳性克隆进行16S rRNA序列的测序。

本发明反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K的16S rRNA序列长度为1519bp，与Bacillus sp.的亲缘关系最接近，具有99%以上的相似性，采用MEGA程序对该菌进行了系统发育进化分析，并绘制系统发育树，如图2所示。

该菌株已于2013年12月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学保藏中心），地址：中国武汉 武汉大学，分类命名为Bacillus Cereus P1K，保藏编号为：CCTCC NO: M2013625。

（5）菌株的反硝化功能基因nirS序列测定及发育分析

反硝化功能基因nirS基因PCR扩增：以细菌基因组总DNA为模板，所使用PCR引物为：cd3aF（GT(C/G)AACGT(C/G)AAG GA(A/G)AC(C/G)GG）和

R3cd（GA(C/G)TTCGG(A/G)TG(C/G)GTCTTGA）。PCR扩增程序：95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸40s，共30个循环；最后72℃延伸14min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。经PCR扩增后目的DNA与pMD 18-T载体进行连接，并转化克隆，选取阳性克隆进行nirS序列的测序。

对测得的nirS功能基因序列利用MEGA程序将其与已报道的nirS基因片段进行了系统发育进化分析，结果证明菌株Bacillus Cereus P1K中的确存在着亚硝酸盐还原酶基因（即反硝化功能基因nirS基因），它催化了反硝化反应的进行，这进一步从分子生物学角度确认菌株Bacillus Cereus P1K具有反硝化功能。

菌株Bacillus Cereus P1K的nirS基因序列如序列表SEQ ID No:1所示。

实施例 2

测定菌株Bacillus Cereus P1K的生长曲线：将菌株Bacillus Cereus P1K在缺磷培养基中厌氧（充氮气）培养24h（摇床140rpm，30℃）；将富集的菌液离心（8,000rpm，8min），无菌蒸馏水洗涤，再离心（8,000rpm，8min），取菌沉淀投入到富磷培养基中（整个过程均在无菌条件下进行）测定其生长曲线。培养期间每隔2h取培养液，采用光电比浊法测定菌液的OD₆₀₀，然后经0.22μm微孔滤膜过滤后测滤液中PO₄ ^3--P含量。菌株Bacillus Cereus P1K的生长曲线如图3所示。从图中可以看出，该菌的生长曲线较典型，潜伏期较短，为2h左右，菌株的对数生长期约为14～16h，18h以后开始进入稳定期和衰亡期，吸磷主要发生在对数生长期，吸磷量随着对数期菌株的生长而增多，吸磷率在对数生长期末达到最大。

实施例 3

通过试验考察反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K在厌氧/好氧条件下进行除磷的性能研究：首先，菌株Bacillus Cereus P1K在富磷培养基中好氧培养24h，离心（8,000rpm，8min），无菌蒸馏水洗涤，再离心（8,000rpm，8min）。取菌沉淀再次投入到富磷培养基中，模拟厌氧/好氧SBR反应器进行试验。其中，厌氧（密闭容器，充氮气）培养160min（140rpm，30℃），结束后向其中充氧气，好氧培养180min（140rpm，30℃）。期间每隔30min取培养液，经0.22μm微孔滤膜过滤后测定滤液中PO₄ ^3--P含量。结果如图4所示，从图4中可知，在160min厌氧条件下，培养液中磷浓度由初始的8mg/L增加到21mg/L左右，说明在厌氧阶段菌株Bacillus Cereus P1K发生了明显的释磷现象，且释磷较充分；好氧结束时磷浓度降至0.5mg/L左右，磷的去除率为93.8%。说明菌株Bacillus Cereus P1K在好氧条件下能利用氧作为电子受体进行吸磷，且好氧条件下的吸磷能力较强。

实施例 4

通过试验考察反硝化除磷菌Bacillus Cereus P1K在厌氧/缺氧条件下进行同步反硝化脱氮除磷的性能研究：首先，菌株Bacillus Cereus P1K在富磷培养基中好氧培养24h，离心（8,000rpm，8min），无菌蒸馏水洗涤，再离心（8,000rpm，8min）。取菌沉淀再次投入到富磷培养基中，模拟厌氧/缺氧SBR反应器进行试验。其中，厌氧（密闭容器，充氮气）培养160min（140rpm，30℃），结束后向其中投加KNO₃溶液，使培养液中KNO₃含量为30mg/L，再次充氮气，缺氧（溶液中有NO₃-N，无溶解态氧）培养180min（140rpm，30℃）。期间每隔30min取培养液，经0.22μm微孔滤膜过滤后测定滤液中PO₄ ^3--P和NO₃ ^--N含量。结果如图5所示，从图5中可知，在160min厌氧条件下，培养液中磷浓度由初始的8mg/L增加到21mg/L左右，说明在厌氧阶段菌株Bacillus Cereus P1K发生了明显的释磷现象，且释磷较充分；在缺氧开始时向培养基中投加KNO₃使其浓度为30mg/L，缺氧结束时NO₃ ^--N浓度降至2.8mg/L左右，磷浓度降至2.4mg/L左右，氮的去除率为90.5%，磷的去除率为70%。这说明菌株Bacillus Cereus P1K在缺氧时能利用NO₃ ^--N作为电子受体进行同步反硝化吸磷。

结合实施例3、4可知，菌株Bacillus Cereus P1K能在厌氧条件下释磷，在好氧条件下以氧为电子受体进行吸磷，在缺氧条件下能以硝酸盐氮为电子受体进行吸磷。由此可确认菌株Bacillus Cereus P1K为具有同步反硝化脱氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌，且反硝化能力和过量吸磷能力都较高，可以应用于污水处理的生物脱氮除磷工艺，特别适合应用于有机物含量较低的城市污水处理中，无需投加碳源，工艺简单，成本低廉且相对安全，有较强的实用价值。

序列表

<110>武汉理工大学

<120>一株具有同步反硝化脱氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其应用

<160>1

<210> 1

<211> 416 bp

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌（Bacillus Cereus）

＜400＞ 1

attgtgaacg tgaaggagac gggcaaggtc ctgctggtca actacaagga tatcgacaac 60

ctcaccgtca ccagcatcgg tgcggcgccg ttcctccacg acggcggctg ggacagcagc 120

caccgctact tcatgaccgc cgccaacaac tccaacaagg ttgccgtgat cgactccaag 180

gaccgtcgcc tgtcggccct ggtcgacgtc ggcaagaccc cgcacccggg gcgtggcgcc 240

aacttcgtgc atcccaagta cggcccggtg tggagcacca gccacctggg cgacggcagc 300

atctcgctga tcggcaccga tccgaagaac catccgcagt acgcctggaa gaaagtcgcc 360

gaactacagg gccagggcgg cggctcgctg ttcatcaaga cccatccgaa ctcaat 416

Claims (4)

1.一株具有同步反硝化脱氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌，其特征在于，该菌株命名为Bacillus Cereus P1K，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2013625。

2.权利要求1所述的兼性反硝化除磷菌在污水处理中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用所述兼性反硝化除磷菌对污水进行处理，实现同步反硝化脱氮和脱磷的目标。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述兼性反硝化除磷菌在有机物含量较低的城市污水处理中的应用。