CN112852658A - 一株假单胞菌dnf-23及提高假单胞菌脱氮效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物脱氮技术领域，提供了一株假单胞菌DNF‑23及提高假单胞菌脱氮效率的方法。本发明首次分离得到一株异养硝化‑好氧反硝化假单胞菌DNF‑23菌株，于2019年7月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No:60713。本发明提供了一种纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF‑23共同用于含氮水体脱氮的方法。当浓度为50mg/L的纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF‑23联用脱氮时，在12h内分别对水体中的氨氮、硝酸盐以及总氮的去除率可达86.9％、85.7％、72.7％，较单菌株分别提升了17.5％、16.2％、25.5％，在短时间内显著提升了假单胞菌的脱氮效率。该方法不仅能够快速高效地对水体进行脱氮处理，而且能够避免二次污染，具有良好的应用前景。

Description

一株假单胞菌DNF-23及提高假单胞菌脱氮效率的方法

技术领域

本发明涉及微生物脱氮技术领域，具体涉及一株假单胞菌DNF-23及提高假单胞菌脱氮效率的方法。

背景技术

随着工农业的快速发展，水体污染问题日益加剧，污染物进入水体后超过了其自净能力，造成了水体污染，其中水体氮素污染现象较为严重，硝酸盐由于其高的水溶性特征，可能是水中主要的氮污染物。高浓度的硝酸盐会引起环境问题，如河流的富营养化和水源的恶化，以及危害人类健康。因此解决环境水体硝酸盐污染问题刻不容缓，目前用于含氮水体处理的方法主要分为物化法和生物脱氮法两种。由于生物脱氮处理成本低，且对环境无二次污染，成为目前最常用的污水脱氮方法之一，但传统的硝化-反硝化生物脱氮方法存在着工艺复杂、运行管理要求高等缺点，大大限制了生物脱氮技术的应用和发展。

与传统硝化、异养反硝化菌相比，异养硝化-好氧反硝化菌能在一个生物反应器中同时进行硝化和反硝化，比传统硝化细菌具有更高的生长率、耐有机负荷能力，具有简化设备、节约成本、反硝化过程无需额外投加碳源等优点。近年来，陆续有学者筛选出一些具有异养硝化-好氧反硝化能力的假单胞菌 (Pseudomonas)，例如：公布号为CN 110669689 A的中国专利公开了一株异样硝化-好氧反硝化菌及应用，该硝化-好氧反硝化施氏假单胞菌GEP-01在24h 对氨氮的去除率为80％；公布号CN111607543A公开的一株具有好氧反硝化功能的施氏假单胞菌，该菌株在24h对硝态氮去除率可达91％以上；公布号为CN 110655197 A公开了一种利用异养硝化-好氧反硝化的假单胞菌菌株处理硝酸盐氮废水的方法，该菌在24h硝酸盐氮去除率可达90％以上。尽管目前已经发现很多具有较高脱氮性能的异养硝化-好氧反硝化菌，但它们去除水中氮素的速度通常较慢，很难在短时间内达到比较高的脱氮效率。如何寻找一种能够提高微生物脱氮效率的方法成为了微生物脱氮领域中越来越受关注的问题。

发明内容

为了丰富本发明异养硝化-好氧反硝化菌株资源库，本发明提供了一株假单胞菌DNF-23。

本发明还提供了假单胞菌DNF-23在制备生物脱氮剂方面的应用。

针对现有假单胞菌脱氮技术中的不足，本发明提供一种提高假单胞菌脱氮效率的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)DNF-23，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2019年7月5日，保藏编号为GDMCC No:60713。本发明假单胞菌DNF-23菌株的16SrDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了假单胞菌DNF-23在水体脱氮方面的应用。

本发明还提供了一种提高假单胞菌脱氮效率的方法，所述方法包括将纳米 Fe₂O₃与所述假单胞菌DNF-23共同用于含氮水体脱氮。

本发明提供了纳米Fe₂O₃与所述假单胞菌DNF-23共同用于脱氮的方法，其中，纳米Fe₂O₃能够更好的被假单胞菌DNF-23利用，有益于增强脱氮酶的活性，使得假单胞菌DNF-23的脱氮时间显著缩短，去除率也有所提升，纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23联用能够达到协同增强脱氮效率的作用。

优选地，所述假单胞菌DNF-23在含氮水体的接种量为1％～5％。

优选地，所述假单胞菌DNF-23在含氮水体的接种量为2％。

优选地，所述纳米Fe₂O₃的浓度为1～150mg/L。

更优选地，所述纳米Fe₂O₃的浓度为40～100mg/L。

优选地，所述纳米Fe₂O₃的粒径为1～100nm。

更优选地，所述纳米Fe₂O₃的粒径为50～100nm。

优选地，所述含氮水体中包含硝态氮和/或氨氮。

优选地，所述含氮水体的硝态氮浓度为10～600mg/L。

更优选地，所述含氮水体的硝态氮浓度为100～300mg/L。

优选地，所述含氮水体的氨氮浓度为10～600mg/L。

更优选地，所述含氮水体的氨氮浓度为100～300mg/L。

优选地，所述含氮水体的pH为7～9。

优选地，所述含氮水体的温度为25～30℃。

优选地，所述脱氮的时间为12～24h。

优选地，所述含氮水体的COD/TN为7～9。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)DNF-23及提高假单胞菌脱氮效率的方法，通过将假单胞菌DNF-23与纳米Fe₂O₃共同用于脱氮，较假单胞菌 DNF-23单独使用耗时短，脱氮率高，纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23起到了协同增强脱氮的作用。当浓度为50mg/L的纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23共同加入含氮水体进行脱氮时，在12h内对水体中的氨氮、硝酸盐以及总氮的去除率分别为86.9％、85.7％、72.7％，较单菌株分别提升17.5％、16.2％、25.5％。本发明提供的纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23联用的新型生物脱氮方法，不仅能够快速高效地对水体进行脱氮处理，而且能够避免二次污染，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明菌株16S rDNA的系统发育树。

图2为DNF-02菌株的扫描电镜图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例中用到的培养基配方如下：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

异养硝化培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.95g/L，柠檬酸钠2.50g/L，维氏盐5.0％。

好氧反硝化培养基：KNO₃ 1.45g/L，柠檬酸钠2.50g/L，维氏盐5.0％。

维氏盐：K₂HPO₄ 5.00g/L，NaCl 2.50g/L，MgSO₄·7H₂O 2.50g/L，FeSO₄·7H₂O0.05g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05g/L。

以上所有培养基pH均应调节至7.4～7.6，固体培养基需另加2％的琼脂。培养基在使用前需在0.11MPa、120℃下灭菌30min，冷却后备用。

实施例1异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选

1.驯化和富集：污泥取自广州猎德污水处理厂，将取来的活性污泥分成四份，分别置于4个好氧SBR反应器中，其中两个为硝化反应器，两个为好氧反硝化反应器。反应器进水运行方式包括进水→曝气→沉淀→出水，每24h为一个运行周期，对污泥进行驯化与富集。

2.分离纯化：分别从4个反应器中取泥水混合液1mL，通过倍比稀释将样品稀释至10^-1、10^-3、10^-5、10^-7，4个不同的稀释度，用无菌移液枪将稀释后的样品移入到平板培养基上进行涂布，硝化反应器中的稀释液涂布在硝化固体培养基，反硝化反应器中的稀释液涂布在反硝化固体培养基中，并将涂布后的固体平板倒置于30℃的恒温培养箱中，培养48h。从中选出颜色形态各异的单菌落，用平板划线法分别接种于硝化培养基和反硝化培养基中，在同一条件下培养48h，继续挑选单菌落进行重复划线培养，直至平板上的单菌落颜色和形态一致，整个实验过程均在无菌条件下操作。

3.菌株筛选：将分离出来的单菌株接种至含有LB液体培养基的摇瓶中，瓶口包9层纱布，将摇瓶放置于30℃，120r/min的恒温振荡箱中培养12h，将培养液于4000r/min条件下离心3min，收集菌体，并用无菌水重悬菌体定容稀释至1.00g/L。然后按照2％的接种量将菌液接种于含有异养硝化和好氧反硝化液体培养基的摇瓶中，置于30℃，120r/min的恒温振荡箱中培养48h，设计3个平行和未接种菌的对照实验，每12h测定一次培养液中NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N的浓度，挑选出对NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N去除效率高的菌株，整个实验过程均在无菌条件下进行。

4.同步硝化反硝化能力的测定：将分别具有异养硝化和好氧反硝化功能的菌株接种至灭菌后的LB培养基中，在30℃、120r/min条件下摇床培养24h后，于4000r/min离心2min收集菌体，用无菌水重悬菌体并定容至1g/L，按2％的接种量分别接种至装有适量好氧反硝化和异养硝化培养液的锥形瓶中，置于30℃、 120r/min下摇床培养，实验设3个平行，每隔12h取上清液测NO₃ ^--N和NH₄ ⁺-N 的含量。

经过上述筛选分离后得到NO₃ ^--N和NH₄ ⁺-N去除效果最好的单一异养硝化- 好氧反硝化菌株DNF-23。SEM扫描发现，DNF02菌体为细杆状(见图1)。将测序结果与GenBank中已有细菌的序列进行比对，经Blast比对分析，比对结果表明该菌与Pseudomonas mendocinaGD30的16S rDNA相似度最高(见图2)，故该菌株命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)DNF-23，所述菌株已于2019年7月 5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:60713；分类命名号为Pseudomonas sp.DNF-23，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。

实施例2假单胞菌DNF-23异养硝化能力

将DNF-23菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体(定容至1g/L)，然后按2％的接种量接种于含100mL上述异养硝化培养基的三角瓶中，充分摇匀，30℃、120r/min摇床培养48h，设计3个平行和未接种菌的对照实验，每12h测一次上清液中NH₄ ⁺-N的浓度变化。

假单胞菌DNF-23去除水的NH₄ ⁺-N效果如表1所示。表中可见，12h时 NH₄ ⁺-N的去除率仅为69.4％。

表1假单胞菌DNF-23对NH₄ ⁺-N进行异养硝化的性能测定结果

实施例3假单胞菌DNF-23好氧反硝化能力

将DNF-23菌株扩大培养后，用无菌水重悬菌体(定容至1g/L)，然后按2％的接种量接种于含100mL上述好氧反硝化培养基的三角瓶中，充分摇匀，30℃、 120r/min摇床培养48h，设计3个平行和未接种菌的对照实验，每12h测一次上清液中硝态氮(NO₃ ^--N)和总氮(TN)的浓度变化。

假单胞菌DNF-23去除水的NO₃ ^--N和TN效果如表2所示。从表2的结果可知，12h时NO₃ ^--N和TN的去除率分别为69.5％、47.2％。

表2假单胞菌DNF-23对NO₃ ^--N和TN进行好氧反硝化的性能测定结果

实施例4纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23的异养硝化能力

取2％经活化稀释定容至1g/L的假单胞菌DNF-23菌液接种于100mL含有粒径为30nm纳米Fe₂O₃的硝化培养液中，纳米Fe₂O₃浓度为50mg/L，调节C/N 为7-9，pH为7.0～8.0，置于30℃，120r/min恒温振荡器中振荡培养，设计3 个平行实验，每12h测一次上清液中氨氮(NH₄ ⁺-N)的浓度。

纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23去除水中NH₄ ⁺-N效果如表3所示。从表3 的结果可知，当水中纳米Fe₂O₃为50mg/L时，12h内菌株DNF-23对NH₄ ⁺-N的去除率为86.9％，与实施例2的结果相比，在短时间(12h)内脱氮效率提升了 17.5％，即节约了脱氮时间。可见，纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23联用能够显著强化其去除NH₄ ⁺-N的效率。

表3纳米Fe₂O₃(50mg/L)强化假单胞菌DNF-23对NH₄ ⁺-N的异养硝化性能

实施例5纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23的好氧反硝化能力

取2％经活化稀释定容至1g/L的假单胞菌DNF-23菌液接种于100mL含有粒径为30nm纳米Fe₂O₃的好氧反硝化培养液中，纳米Fe₂O₃浓度为50mg/L，调节C/N为7-9，pH为7.0～8.0，置于30℃，120r/min恒温振荡器中振荡培养，设计3个平行实验，每12h测一次上清液中NO₃ ^--N和TN的浓度。

纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23去除水中NO₃ ^--N、TN效果如表4所示。从表4的结果可知，当水中纳米Fe₂O₃为50mg/L时，12h内菌株DNF-23对NO₃ ^--N 和TN的去除率分别为85.7％、72.7％，与实施例3的结果相比，短时间(12h) 内脱氮效率分别提升了16.2％、25.5％，达到同等脱氮效率的时间大大缩短。可见，纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23联用能够显著强化其去除NO₃ ^--N和TN的效率。

表4纳米Fe₂O₃(50mg/L)强化假单胞菌DNF-23对NO₃ ^--N和TN的好氧反硝化性能

实施例6纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23的异养硝化能力

仅将实施例4中的纳米Fe₂O₃浓度替换为100mg/L，用于纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23的异养硝化能力评估。结果如表5所示，12h内菌株DNF-23对 NH₄ ⁺-N的去除率为84.1％，与实施例2的结果相比，短时间(12h)内脱氮效率提升了14.7％，即缩短了脱氮时间。可见，纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23联用能够显著强化其去除NH₄ ⁺-N的效率。

表5纳米Fe₂O₃(100mg/L)强化假单胞菌DNF-23对NH₄ ⁺-N的异养硝化性能

实施例7纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23的好氧反硝化能力

仅将实施例5中的纳米Fe₂O₃浓度替换为100mg/L，用于纳米Fe₂O₃强化假单胞菌DNF-23的异养硝化能力评估。结果如表6所示，12h内菌株DNF-23对 NO₃ ^--N和TN的去除率分别为82.5％、68.9％，与实施例3的结果相比，12h内脱氮效率分别提升了13％、21.7％，即缩短了脱氮时间。可见，纳米Fe₂O₃与假单胞菌DNF-23联用能够显著强化其去除NO₃ ^--N和TN的效率。

表6纳米Fe₂O₃(100mg/L)强化假单胞菌DNF-23对NO₃ ^--N和TN的好氧反硝化性能

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一株假单胞菌DNF-23及提高假单胞菌脱氮效率的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1498

<212> DNA

<213> 假单胞菌DNF-23(Pseudomonas sp.DNF-23)

<400> 1

agtttgatcc tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagtgg 60

atgaggggag cttgctccct gatttagcgg cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc 120

ctggtagtgg gggataacgt tccgaaagga acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga 180

aagcagggga ccttcgggcc ttgcgctatc agatgagcct aggtcggatt agctagttgg 240

tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgatcc gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca 300

ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attggacaat 360

gggcgaaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa ggtcttcgga ttgtaaagca 420

ctttaagttg ggaggaaggg cattaaccta atacgttagt gttttgacgt taccaacaga 480

ataagcaccg gctaacttcg tgccagcagc cgcggtaata cgaagggtgc aagcgttaat 540

cggaattact gggcgtaaag cgcgcgtagg tggttcgtta agttggatgt gaaagccccg 600

ggctcaacct gggaactgca tccaaaactg gcgagctaga gtacggtaga gggtgggtgg 660

aaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagg tggcgaaagc 720

gaccacctgg actgatactg acactgaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacgatgt caactagccg ttggaatcct tgagatttta 840

gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc 900

aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 960

gaagaacctt acctggcctt gacatgctga gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg 1020

ggaactcaga cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc acctcgggtg ggcactctaa 1140

ggagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catggccctt 1200

acggccaggg ctacacacgt gctataatgg tcggtacaaa gggttgccaa gccgcgaggt 1260

ggagctaatc ccataaaacc gatcgtagtc cggatcgcag tctgcaactc gactgcgtga 1320

agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc ccgggccttg 1380

tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgctccag aagtagctag tctaaccttc 1440

ggggggacgg ttaccacgga gtgattcatg actggggtga agtcgtaaca aggtagcc 1498

Claims (10)

1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)DNF-23，其特征在于，所述假单胞菌DNF-23保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏时间为2019年7月5日，保藏编号为GDMCC No:60713。

2.权利要求1所述假单胞菌DNF-23在水体脱氮方面的应用。

3.一种提高假单胞菌脱氮效率的方法，其特征在于，将纳米Fe₂O₃与权利要求1所述假单胞菌DNF-23共同用于含氮水体脱氮。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述假单胞菌DNF-23在含氮水体的接种量为1％～5％。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纳米Fe₂O₃在含氮水体的浓度为1～150mg/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述纳米Fe₂O₃在含氮水体的粒径为1～100nm。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含氮水体中包含硝态氮和/或氨氮。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含氮水体的硝态氮浓度为10～600mg/L。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含氮水体的氨氮浓度为10～600mg/L。

10.根据权利要求3～9所述的方法，其特征在于，所述脱氮的时间为12～24h。

Images