CN117431170A - 一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及污水检测的技术领域，具体为一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法。所述氨氧化菌的命名为HZ‑004，保藏编号为CGMCC NO.23464；所述氨氧化菌可以用于降解氨氮。本发明中采用自主筛选的具有氨氧化功能的菌株，且本身对毒性物质敏感，且生长和代谢会随着毒性的强弱而变化，将其用sfGFP标记后，经过蓝光激发后，会发出荧光。当水样中含有有毒物质时，会影响荧光标记菌株的活性，使其荧光强度发生变化，由于荧光强度与菌株数量之间呈现正相关，因此通过荧光强度的换算可以得出荧光标记菌株的菌浓度和毒性强度。

Description

一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法
技术领域
本发明涉及污水检测的技术领域，具体为一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法。
背景技术
绿色荧光蛋白(GFP)是一种理想的荧光标记物，被广泛应用于真核和原核生物基因表达。用于标记的绿色荧光蛋白分为野生型和突变体。其中，野生型由于蛋白合成和折叠都较慢，收到外界因素影响较大，从而限制了其应用；而突变体具有高折叠效率、蛋白合成速度，以及荧光强度都大大地增强了，且可以适应高温、强酸碱等极端环境；因此，突变体是荧光蛋白标记的首选。研究表明，GFP标记后的真核或原核生物的原有性能不会随着GFP的表达而改变，GFP荧光的激发不消耗生物能量，不需要任何底物或者辅助因子，且可通过荧光显微镜、荧光分光光度计等仪器对标记的微生物进行实时、原位的定量计算其荧光强度。
另一方面，工业污水处理过程中，常常存在水中氨氮超标的问题。究其原因，主要是活性污泥中氨氧化微生物失活或者死亡了，而导致氨氧化微生物失效的原因主要是污水中的毒性物质，如常见的皮革废水中的重金属铬、电路板废水中的有机物硫脲等，这些物质不会被实时监测，一旦累积会影响氨氧化微生物的活性，阻断氨氧化过程，进而导致出水中氨氮超标。
现有技术中，针对污水处理过程中常规指标比如氨氮超标的毒性检测还未见有研究，目前的研究主要是针对污水处理后或者是污水中某一类毒性物质的检测。如利用发光细菌检测城市污水中的毒性种类及综合毒性，但是该方法仅用于污水处理后的毒性评价，且对某些水质的检测结果不精确。还有利用小球藻检测污水的生物毒性，但是检测方法较为繁琐，且结果评价标准单一，仅对某一类毒性物质起作用，无法精确的得出毒性的种类及毒性强度。常见的评价污水毒性的指标包括微生物数量，水体溶解氧等指标，但是收集和检测之间有延迟，以及评价标准单一无法直接体现毒性强度和种类。
综上，人们需要一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法来解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨氧化菌及利用氨氧化菌检测废水毒性的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种氨氧化菌，所述氨氧化菌为假单胞菌Pseudomonas，其16SrDNA序列如SeqNO.1所示。
进一步的，所述氨氧化菌的命名为假单胞菌Pseudomonas sp.HZ-004，保藏编号为CGMCC NO.23464，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2021年9月22日；所述氨氧化菌可以用于降解氨氮。
其中，标记所用的绿色荧光蛋白(GFP)为超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP),这种GFP是经过野生型突变而来，荧光强度更高，稳定性好，无毒性，灵敏度也更高。
进一步的，一种氨氧化细菌的筛选方法，包括以下步骤：
步骤1：菌株富集：将市政污水处理厂生化池活性污泥在富集培养基中进行富集培养，得到异样硝化菌的富集液；
步骤2：菌株分离和纯化：采用稀释涂布平板法将富集液涂布于固体分离培养基上，分离纯化，得到的氨氧化菌。
进一步的，氨氧化细菌的筛选方法的详细过程为：
S1：菌株富集：取污水区的活性污泥在富集培养基中进行振荡培养，定时检测氨氮浓度，当氨氮浓度减少至80％以上，以1％的接种量在富集营养基中继续富集，循环3～4个周期，得到异样硝化菌的富集液；其中，振荡培养过程中，活性污泥与富集培养基基的比例为20g：200mL，温度为30℃，振荡速度为160r/min，定时检测的时间为24小时。
S2：菌株分离和纯化：采用稀释涂布平板法将富集液涂布于固体分离培养基上，每个平板取100μL富集液涂布，30℃恒温培养至菌落出现，于固体分离培养基上划线分离，重复2-3次划线分离，直至平板上形成均匀的菌落，得到的氨氧化菌；
S3：菌株鉴定：将氨氧化菌进行16S rDNA鉴定，序列如Seq.No1所示；并将其与Genbank数据库中已知序列进行相似度对比，鉴定为假单胞菌Pseudomonas，命名为HZ-004。
其中，seq.No1：
进一步的，步骤S1中，富集营养基的配方包括以下成分：0.4～0.6g(NH4)2SO4，2.1～2.3gC4H4Na2O4，0.4～0.6gMgSO4·7H2O，0.35～0.45gK2HPO4，0.1～0.2gKH2PO4，1.5～2.5mL微量元素溶液，补充蒸馏水至1L，pH＝7.0-7.2；微量元素溶液包括以下成分：48.0～52.0gEDTA，2～2.4gZnSO4，5.3～5.7gCaCl2·2H2O，5.0～5.1gMnCl2·4H2O，4.8～5.1gFeSO4·7H2O，1.0～1.2g(NH4)6Mo7O2·4H2O，1.52～1.60gCuSO4·5H2O，1.60～1.62gCoCl2·6H2O，补蒸馏水至1L，pH＝6.0-7.2。
进一步的，步骤S2中，固体分离培养基制备方法为：在分离液体培养基的基础上，加入1.5％-2％的琼脂，得到固体分离培养基；分离液体培养基的配方包括以下成分：0.48～0.52g(NH4)2SO4，5.0～5.12gC4H4Na2O4，48～52mL维氏盐溶液，补充蒸馏水至1L，pH＝7.0-7.2；维氏盐溶液包括以下成分：4.8～5.2gK2HPO4，2.3～2.6gMgSO4·7H2O，2.3～2.7gNaCl，0.04～0.06gFeSO4·7H2O，0.04～0.06gMnSO4·4H2O，加蒸馏水溶解并定容至1L。
进一步的，使用绿色荧光蛋白标记氨氧化菌。
进一步的，一种荧光标记氨氧化菌的构建方法，具体构建过程为：
(1)表达质粒的构建：PCR扩增sfGFP片段，将扩增后的sfGFP基因片段与载体pLEM415重组，得到重组质粒；将其经过热激法转化进入E.coil TOP10感受态细胞中，培养，得到pLEM415-sfGFP表达质粒；
具体过程为：所用载体质粒为pLEM415,根据质粒载体的序列设计了一对特异性的引物sfGFP-NdeI和sfGFP-SalI,这对引物可以扩增sfGFP基因全片段(片段共1006bp)以及启动子和终止子，同时在5’和3’端分别加入了NdeI和SalI作为限制性内切酶位点(横线即为酶切位点)。
sfGFP-NdeI 5’CAGAGTCATATGGGAGCACATGCA 3’(NdeⅠ)；
sfGFP-SalI 5’CCTGGTCGACTGTAGAGTCTAATCC 3’(SalⅠ)；
(2)氨氧化菌感受态细胞的制备：采用冰浴法制备氨氧化菌HZ-004的感受态细胞，得到假单胞菌HZ-004；
(3)表达质粒的转化：采用电击转化法将表达质粒pLEM415-sfGFP转化进入假单胞菌HZ-004中，得到sfGFP标记的假单胞菌HZ-004。
进一步的，荧光标记氨氧化菌的构建方法的详细过程为：
(1)表达质粒的构建：
所用载体质粒为pLEM415,根据质粒载体的序列设计了一对特异性的引物sfGFP-NdeI(5‘’)和sfGFP-SalI,这对引物可以扩增sfGFP基因全片段以及启动子和终止子，同时在5’和3’端分别加入了NdeI和SalI作为限制性内切酶位点；
首先PCR扩增sfGFP片段，扩增运行程序为：3min 94℃预变性；35个循环，循环过程为：94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸45s；72℃延伸5min；将扩增后的sfGFP基因片段与载体pLEM415用限制性内切酶NdeI和SalI分别双酶切，然后将酶切后目的基因片段与载体连接；新构建的pLEM415-sfGFP表达载体经过热激法转化进入E.coil TOP10感受态细胞中，将转化后的E.coil TOP10涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃恒温培养12h；挑取单克隆于2.5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒并酶切和测序进行验证；验证正确的质粒即为pLEM415-sfGFP表达质粒；
(2)氨氧化菌感受态细胞的制备：
挑取一个新鲜的HZ-004单菌落接种至2.5mL分离液体培养基中活化，30℃摇床培养过夜；将活化液按照2％的比例接种于50mL分离液体培养基中，30℃摇床160r/min培养至OD600约为0.5；将培养液冰浴10min，使菌株停止生长；于4℃，7000r/min离心10min，无菌条件下弃上清，收集细胞；用等体积冰预冷的双蒸水洗涤2次，再用1/10体积冰预冷的10％甘油重悬；于4℃，7000r/min离心15min，无菌条件下弃上清，收集细胞，最后用1/100体积预冷的10％甘油重悬，以每管50μl分装，得到假单胞菌HZ-004；
(3)表达质粒的转化：
采用电击转化法将表达质粒pLEM415-sfGFP转化进入假单胞菌HZ-004；将50μl假单胞菌HZ-004感受态细胞与0.5-1μg在冰浴条件下混匀，加至冰预冷的0.1cm电转杯中，冰上放置10min后，使用电转仪(Bio-Rad)在1.2kV，600Ω，25μF条件下电击，电转后迅速加入500μl分离培养基，转入1.5mL离心管总，30℃孵育2h，然后加入到30mL分离液体培养基中，30℃摇床培养；将长势良好的菌株多次转接培养后，取一定量的菌液涂布于固体分离培养基平板上，30℃培养48h可见到菌落；挑取较大的转化子于固体分离培养基平板上进行扩增，将转化子扩增培养后，采用溶菌液30℃处理2h；将该处理液进行PCR扩增，以1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果；电泳结果显示出现符合设计预期大小的条带，说明质粒成功且正确的表达，得到sfGFP标记的假单胞菌HZ-004；
(4)sfGFP的表达和荧光稳定性检测
将sfGFP标记的假单胞菌HZ-004在液体分离培养基中培养后，放置于蓝光透照台上观察，同时未标记的假单胞菌HZ-004作为阴性对照，确认sfGFP是否表达。
进一步的，荧光标记氨氧化菌在废水毒性检测中的应用。
进一步的，废水毒性检测中，包括以下步骤：
步骤1：以检测污水中毒性水样菌、重金属镉、有机物硫脲的毒性物为前提，将1％的菌株活化液接种在不同样品中，将样品通过荧光传感检测装置测得荧光强度；
步骤2：将荧光强度通过公式1：抑制生长率＝(logC对照-logC样品)/logC对照×100％；公式2：相对发光率＝样品荧光强度/对照荧光强度×100％，换算得到抑制生长率、相对发光率中一组或两组数据，用于判断是否存在毒性和毒性程度。
其中，以检测污水中毒性水样菌时，具体为以下步骤：
1.将100mL菌株活化液离心去除培养基，用1mL新培养基重悬菌体；平板法测定这1mL菌体的浓度后，将其梯度稀释成不同浓度(cfu/mL)的菌悬液，即为不同浓度的标准液；
2.将不同浓度的标准液通过荧光传感检测装置测得荧光强度，并绘制出荧光强度-荧光标记氨氧化菌浓度回归曲线，拟合得到标准回归线曲线，检出荧光标记氨氧化菌的范围；
3.将1％的菌株活化液接种于不同污水中，进行混合孵化，得到待测样品；将1％的菌株活化液接种于培养基中，作为对照样品；将待测样品、对照样品通过平板菌落计数法、荧光强度检测得到水样菌浓度；
4.对比平板菌落计数法、荧光强度检测得到水样菌浓度是否相近，保证数据可信度；并通过公式1：抑制生长率＝(logC对照-logC样品)/logC对照×100％，计算得到抑制生长率判断毒性程度。
其中，检测污水中重金属镉时，具体为以下步骤：称取于120℃干燥2h后的0.2829g重铬酸钾，用水溶解后，在1L容量瓶中定容，摇匀，得到镉标准液；将其稀释成不同溶度梯度，分别加入至分离培养基中，再加入1％的菌株活化液，设置一组不加铬的对照组，25～35℃培养24小时，通过荧光传感检测装置测得荧光强度；
其中，检测污水中有机物硫脲时，具体为以下步骤：称取于120℃干燥2h后的1.00g硫脲，用水溶解后，在1L容量瓶中定容，摇匀，得到硫脲标准液；将其稀释成不同浓度梯度，分别加入至分离培养基中，在加入1％的菌株活化液，设置一组不加硫脲的对照组25～35℃培养24小时，通过荧光传感检测装置测得荧光强度；
进一步的，废水毒性检测前对荧光标记氨氧化菌进行活化，活化过程为：挑取荧光标记氨氧化菌的单菌落到分离培养基中，摇床培养，将获得的培养液全部转接到分离培养基中，摇床培养；得到菌株活化液。
进一步的，废水毒性检测时使用荧光传感检测装置，所述荧光传感检测装置包括外壳、激光光源(3)、第一滤光片(1)、第二滤光片(2)、光强检测器(4)、光强显示器(5)；第一滤光片(1)、第二滤光片(2)设置有比色皿，用于装载检测样品；
激光光源(3)发出激发光束，激光光源(3)、第一滤光片(1)在一条直线上，形成激发光路，第二滤光片(2)与荧光处理模块(4)在一条直线上，形成接收光路，激发光路和接收光路以比色皿为转折点，呈直角设置；光强检测器(4)接收光源，光强显示器显示器(5)显示荧光强度。
进一步的，所述激光光源(3)的光源波长为475～485nm；所述第一滤光片(1)为480nm滤光片、所述第二滤光片(2)为570nm滤光片。
技术方案产生的有益效果：
(1)基于绿色荧光蛋白标记和表达技术，实现被标记氨氧化菌浓度以及污水毒性强度的定量和定性检测，且被标记的微生物具备检测氨氧化生物毒性强弱的能力，进而实现准确的对污水中影响氨氧化过程的毒性物质进行判断和检测。
(2)相较于现有的污水毒性生物检测系统，本发明中采用自主筛选的具有氨氧化功能的菌株，且本身对毒性物质敏感，且生长和代谢会随着毒性的强弱而变化，将其用sfGFP标记后，经过蓝光激发后，会发出荧光。当水样中含有有毒物质时，会影响荧光标记菌株的活性，使其荧光强度发生变化，由于荧光强度与菌株数量之间呈现正相关，因此通过荧光强度的换算可以得出荧光标记菌株的菌浓度和毒性强度。该方法无需使用平板技术法计算微生物的数量，使结果可实时得出。现有污水毒性检测系统检测指标较为单一，如仅能单一的检测光强，或者菌株浓度。本发明中通过荧光光强的换算，可同时得到菌株浓度以及毒性强度，节省了大量的实验时间和过程，可进行多指标的判断，而且由于采用了sfGFP标记，使的荧光强度更高，稳定性好，无毒性，灵敏度也更高，避免了由于荧光强度不够而无法检测荧光造成的缺陷，得到的结果也更可靠。
本发明中毒性检测结果可通过荧光标记菌株抑制生长率、相对发光率2个指标进行综合判断，检测结果更准确。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是荧光生物传感装置示意图；
图2是HZ-004基于16S rDNA的系统发育树；
图3是氨氧化菌降解污水中氨氮效果图；
图4是不同苯酚浓度对菌株生长的影响图；
图5是不同硫脲浓度对菌株氨氮降解的影响图；
图6是荧光标记的菌株与为标记的菌株荧光发光效果对比图；
图7是荧光标记氨氧化菌的荧光强度-菌株浓度标准回归曲线；
图8是HZ-004的电镜扫描图；
图示：第一滤光片1、第二滤光片2、激光光源3、荧光处理模块4、光强显示器5。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
第一步：氨氧化细菌的制备方法：
(1)菌株富集：
取某市政污泥处理厂活性污泥20g加入到装有200mL富集培养基的锥形瓶内，在30℃、160r/min的条件下摇床振荡培养，每隔24h检测培养基内氨氮的浓度，若氨氮浓度减少至80％以上，以1％的接种量转接入新鲜富集培养基中继续富集，循环3-4个周期后，得到异养硝化菌的富集液。
富集培养基配方：0.5g(NH4)2SO4，2.17g C4H4Na2O4(丁二酸钠)，0.5gMgSO4·7H2O，0.40g K2HPO4，0.15g KH2PO4，微量元素溶液2mL，补充蒸馏水至1L，pH＝7.0。微量元素溶液：50.0gEDTA，2.2gZnSO4，5.5gCaCl2·2H2O，5.06gMnCl2·4H2O，5.0gFeSO4·7H2O，1.1g(NH4)6Mo7O2·4H2O，1.57gCuSO4·5H2O，1.61gCoCl2·6H2O，补蒸馏水至1L，pH＝6.0。
(2)菌株分离和纯化：
采用稀释涂布平板的方法将富集液涂布于固体分离培养基上，每个平板取100μL富集液涂布，30℃恒温培养至菌落出现，于固体分离培养基上划线分离，之后再重复2-3次划线分离的操作，用以纯化菌种，得到的菌种斜面保存备用。
分离液体培养基：0.5g(NH4)2SO4，5.1gC4H4Na2O4，维氏盐溶50mL，补充蒸馏水至1L，pH7.0。维氏盐溶液：5.0gK2HPO4，2.5gMgSO4·7H2O，2.5gNaCl，0.05gFeSO4·7H2O，0.05gMnSO4·4H2O，溶解后加水定容至1L。固体分离培养基：在液体培养基的基础上，加入1.5％-2％的琼脂。
(3)菌株鉴定：
对菌株HZ-004进行16S rDNA鉴定，所得序列如seq.No1所示。
seq.No1：
将16S rDNA的测序结果与Genbank数据库中已知序列进行相似度对比，如图2所示，发现菌株HZ-004与假单胞菌(Pseudomonas)序列同源性最高，鉴定为假单胞菌Pseudomonas。
(4)菌株降氨氮性能：
将菌株活化后按照1％接种到含有氨氮污水中，30℃摇床160r/min处理24h，检测氨氮降解性能。
菌株活化方法：挑取单菌落到2.5mL分离培养基中，30℃摇床160r/min培养48h，将获得的培养液全部转接到100mL分离培养基中，30℃摇床160r/min培养24h，即得到菌株活化液。
检测试验：(1)将菌株活化后接种按照1％的比例在污水中，检测氨氮降解率；(2)将菌株活化后按照1％的比例分别接种于两组装有100mL分离培养基的锥形瓶中，同时向其中加入不同浓度的苯酚(氨氧化抑制剂)，另外设置一组不加硫脲的作为对照，分别检测菌浓度和氨氮变化。
结论：所得数据如图3～图5所示：
图3中的数据表明：污水中氨氮在16h时已经从108.7mg/L降至4.5mg/L。在24h时降至1.12mg/L，氨氮降解率达到了99.0％，氨氮降解效率(AOR)为4.48mg/L·h，氨氮降解性能优异。此外，为了进一步说明菌株HZ-004仅能利用氨氮作为唯一的氮源，将菌株活化后按照1％分别接种到以硝氮、亚硝氮为唯一氮源的分离培养基上，结果发现菌株无法生长，培养基中硝氮和亚硝氮浓度未发生变化
图4和图5的数据表明：看出当加入不同浓度的氨氮抑制剂后，菌株HZ-004生长和代谢受到不同程度的抑制，且随着氨氮抑制剂浓度的增强，抑制程度也变强，说明该菌株可用于检测具有氨氧化生物毒性强弱的功能。表明：菌株具有高效降解氨氮的功能，且仅能以氨氮为唯一氮源，一旦菌株活性收到抑制，则无法利用氨氮生长和代谢，可用于检测氨氧化生物毒性水样中毒性强度。
第二步：绿色荧光蛋白(sfGFP)标记菌株HZ-004和表达的步骤如下：
(1)sfGFP表达质粒的构建：
所用载体质粒为pLEM415,根据质粒载体的序列设计了一对特异性的引物sfGFP-NdeI(5‘’)和sfGFP-SalI,这对引物可以扩增sfGFP基因全片段以及启动子和终止子，同时在5’和3’端分别加入了NdeI和SalI作为限制性内切酶位点。
首先PCR扩增sfGFP片段，扩增运行程序为：3min 94℃预变性，35个循环(94℃变性30s；55℃复性30s；72℃延伸45s)72℃延伸5min。将扩增后的sfGFP基因片段与载体pLEM415用限制性内切酶NdeI和SalI分别双酶切，然后将酶切后目的基因片段与载体连接。新构建的pLEM415-sfGFP表达载体经过热激法转化进入E.coil TOP10感受态细胞中，将转化后的E.coil TOP10涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃恒温培养12h。挑取单克隆于2.5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，提取质粒并酶切和测序进行验证。验证正确的质粒即为pLEM415-sfGFP表达质粒。
(2)假单胞菌HZ-004感受态细胞的制备：
挑取一个新鲜的HZ-004单菌落接种至2.5mL分离液体培养基中活化，30℃摇床培养过夜。将活化液按照2％的比例接种于50mL分离液体培养基中，30℃摇床160r/min培养至OD600约为0.5。将培养液冰浴10min，使菌株停止生长。于4℃，7000r/min离心10min，无菌条件下弃上清，收集细胞。用等体积冰预冷的双蒸水洗涤2次，再用1/10体积冰预冷的10％甘油重悬。于4℃，7000r/min离心15min，无菌条件下弃上清，收集细胞，最后用1/100体积预冷的10％甘油重悬，以每管50μl分装。
(3)假单胞菌HZ-004中表达质粒的转化
采用电击转化法将表达质粒pLEM415-sfGFP转化进入假单胞菌HZ-004。将50μl假单胞菌HZ-004感受态细胞与0.5-1μg(＜5μl)在冰浴条件下混匀，加至冰预冷的0.1cm电转杯中，冰上放置10min后，使用电转仪(Bio-Rad)在1.2kV，600Ω，25μF条件下电击，电转后迅速加入500μl分离培养基，转入1.5mL离心管总，30℃孵育2h，然后加入到30mL分离液体培养基中，30℃摇床培养。将长势良好的菌株多次转接培养后，取一定量的菌液涂布于固体分离培养基平板上，30℃培养48h可见到菌落。挑取较大的单克隆(转化子)于固体分离培养基平板上进行扩增，将转化子扩增培养后，采用溶菌液30℃处理2h。将该处理液进行PCR扩增，以1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。电泳结果显示出现符合设计预期大小的条带，说明质粒成功且正确的表达。
(4)sfGFP的表达和荧光稳定性检测
将sfGFP标记的假单胞菌HZ-004在液体分离培养基中培养后，放置于蓝光透照台上观察，同时未标记的假单胞菌HZ-004作为阴性对照，确认sfGFP是否表达。
结果如图6所示。将sfGFP标记的假单胞菌HZ-004接种于液体分离培养基中，连续传代10次后，观察荧光的变化。同时对sfGFP标记的假单胞菌HZ-004的降解氨氮性能进行检测。结果发现其性能与未标记sfGFP的假单胞菌HZ-004相似，降解氨氮性能未变。
第三步：利用氨氧化菌检测废水毒性：
实施例1：荧光标记氨氧化菌细胞浓度的检测：
将sfGFP标记的假单胞菌HZ-004经过活化后，取100mL菌液，离心去除培养基。用1mL新培养基重悬菌体。平板法测定这1mL菌体的浓度后，将其梯度稀释成不同浓度(cfu/mL)的菌悬液。将这些不同浓度梯度的菌悬液用上述荧光生物传感检测装置检测荧光强度，绘制检测的荧光强度-荧光标记菌株浓度标准回归曲线。如图7所示。检测的荧光强度与荧光标记菌株浓度呈一定线性关系，将其进行线性拟合，得到的标准回归曲线拟合方程为y＝88.85x-0.6944，拟合系数平方为0.9954。检出荧光标记菌株浓度范围为10cfu/mL～109cfu/mL。
对皮革污水的铬鞣水、电路板废水、市政污水分别取样，分别通过平板菌落计数法和本发明检测系统检测不同毒性的水样对荧光标记菌株浓度的影响。
实验方法：取一定量的皮革污水处理过程中的铬鞣水(氨氮100-250mg/L，COD4000-6000mg/L，铬：1-8mg/L，pH＝3-12)、电路板废水(氨氮25-35mg/L，总氮(TN)40-70mg/L，COD200-350mg/L，硫脲5-50mg/L，pH＝7-8)、市政污水(氨氮30-50mg/L，COD200-400mg/L，pH＝7-8.)，加入1％活化好的荧光标记菌株，25-35℃振荡培养24h，同时设置1组阴性对照(培养基：0.5g(NH4)2SO4，5.1gC4H4Na2O4，维氏盐溶50mL，补充蒸馏水至1L，pH7.0；维氏盐溶液：5.0gK2HPO4，2.5gMgSO4·7H2O，2.5gNaCl，0.05gFeSO4·7H2O，0.05gMnSO4·4H2O，溶解后加水定容至1L。+1％标记菌株)，取样检测各混合水样中荧光强度和平板菌落计数。平板菌落计数法中仅计算能发出荧光的菌落数。所得数据如表1所示：
表1平板菌落计数法和荧光生物检测传感系统对不同毒性水样菌浓度检测结果
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结论：从表1中可以看出：平板菌落计数法与本发明中荧光生物传感检测系统的检测结果基本一致，说明采用本发明中方法检测细菌数的结果可信。
实施例2：重金属铬的毒性检测：
首先配置铬标准液，称取于120℃干燥2h的重铬酸钾(K2Cr2O7)0.2829g，用水溶解后，在1L容量瓶中定容，摇匀。将此含六价铬的标准液稀释成不同浓度梯度(μg/ml)。取一定量的分离培养基，加入不同浓度梯度的含六价铬的标准液，再加入1％的比例加入活化好的荧光标记菌株，同时设置一组不加铬的对照组，25-35℃振荡培养24h后，检测荧光强度。根据公式计算相对发光率，同时计算荧光强度计算抑制生长率。公式1：抑制生长率＝(logC对照-logC样品)/logC阴性对照×100％。公式2：相对发光率＝样品荧光强度/对照荧光强度×100％。所得结果如表2所示：
表2铬毒性判定标准
相对发光率(％) 抑制生长率(％) 等量的六价铬浓度(mg/L) 毒性级别
＞90 ＜15 0-0.2 无毒
75-90 15-30 0.2-0.5 微毒
50-75 30-50 0.5-1 中毒
30-75 50-75 1-2 重毒
30-75 ＜75 2-6 高毒
＜30 ＜75 8-10 剧毒
结论：由表2中可知：污水毒性强弱可用相对抑制生长率来表示，抑制生长率越高则毒性越强；当毒性在重毒和高毒的时候，需要结合相对发光率和抑制生长率两者进行判定，因此这两组数据缺一不可。
实施例3：有机物硫脲的毒性检测：
配置硫脲标准液称取于120℃干燥2h的硫脲(CH4N2S)1.00g，用水溶解后，在1L容量瓶中定容，摇匀，即为硫脲标准液。将硫脲标准液稀释成不同浓度梯度(μg/ml)。取一定量的分离培养基，加入不同浓度梯度的硫脲标准液，再加入1％的比例加入活化好的荧光标记菌株，同时设置一组不加硫脲的对照组，25-35℃振荡培养24h后，检测荧光强度。根据公式计算相对发光率，同时计算荧光强度计算抑制生长率。公式1：抑制生长率＝(logC对照-logC样品)/logC阴性对照×100％。公式2：相对发光率＝样品荧光强度/对照荧光强度×100％。所得结果如表3所示：
表3硫脲毒性判定标准
相对发光率(％) 抑制生长率(％) 等量的硫脲浓度(mg/L) 毒性级别
＞85 ＜10 0-0.1 无毒
70-85 10-20 0.1-0.5 微毒
50-70 20-50 0.5-1 中毒
30-50 50-75 1-1.5 重毒
＜30 50-75 1.5-2 高毒
＜30 75-100 ＞2 剧毒
结论：由表2中可知：硫脲中高毒与剧毒的毒性判定需要结合相对发光率和抑制生长率。采用本发明中的荧光生物传感检测装置可以精确的对污水毒性进行判断。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (10)

1.一种氨氧化菌，其特征在于：所述氨氧化菌为假单胞菌Pseudomonas，其16SrDNA序列如Seq NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种氨氧化菌，其特征在于：所述氨氧化菌的命名为HZ-004，保藏编号为CGMCC NO.23464；所述氨氧化菌可以用于降解氨氮。
3.一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：菌株富集：将市政污水处理厂生化池活性污泥在富集培养基中进行富集培养，得到异样硝化菌的富集液；
步骤2：菌株分离和纯化：采用稀释涂布平板法将富集液涂布于固体分离培养基上，分离纯化，得到的氨氧化菌。
4.根据权利要求3所述的一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：步骤S1中，富集营养基的配方包括以下成分：0.4～0.6g(NH4)2SO4，2.1～2.3gC4H4Na2O4，
0.4～0.6gMgSO4·7H2O，0.35～0.45gK2HPO4，0.1～0.2gKH2PO4，1.5～2.5mL微量元素溶液，补充蒸馏水至1L，pH＝7.0-7.2；微量元素溶液包括以下成分：48.0～52.0gEDTA，
2～2.4gZnSO4，5.3～5.7gCaCl2·2H2O，5.0～5.1gMnCl2·4H2O，4.8～5.1gFeSO4·7H2O，1.0～1.2g(NH4)6Mo7O2·4H2O，1.52～1.60gCuSO4·5H2O，1.60～1.62gCoCl2·6H2O，补蒸馏水至1L，pH＝6.0-7.2。
5.根据权利要求3所述的一种氨氧化细菌的筛选方法，其特征在于：步骤S2中，固体分离培养基制备方法为：在分离液体培养基的基础上，加入1.5％-2％的琼脂，得到固体分离培养基；分离液体培养基的配方包括以下成分：0.48～0.52g(NH4)2SO4，
5.0～5.12gC4H4Na2O4，48～52mL维氏盐溶液，补充蒸馏水至1L，pH＝7.0-7.2；维氏盐溶液包括以下成分：4.8～5.2gK2HPO4，2.3～2.6gMgSO4·7H2O，2.3～2.7gNaCl，
0.04～0.06gFeSO4·7H2O，0.04～0.06gMnSO4·4H2O，加蒸馏水溶解并定容至1L。
6.一种荧光标记氨氧化菌，其特征在于：使用绿色荧光蛋白标记权利要求1～5任一项所述的氨氧化菌。
7.一种根据权利要求6所述一种荧光标记氨氧化菌的构建方法，其特征在于：具体构建过程为：
(1)表达质粒的构建：以pLEM415为载体质粒，将特异性引物sfGFP-NdeI和sfGFP-SalI，扩增sfGFP基因全片段，以及启动子和终止子，同时在5’和3’端分别加入了NdeI和SalI作为限制性内切酶位点，得到重组质粒；将其经过热激法转化进入E.coil TOP10感受态细胞中，培养，得到pLEM415-sfGFP表达质粒；
其中，sfGFP-NdeI：5’CAGAGTCATATGGGAGCACATGCA 3’(NdeⅠ)
sfGFP-SalI：5’CCTGGTCGACTGTAGAGTCTAATCC 3’(SalⅠ)；
(2)氨氧化菌感受态细胞的制备：采用冰浴法制备氨氧化菌HZ-004的感受态细胞，得到假单胞菌HZ-004；
(3)表达质粒的转化：采用电击转化法将表达质粒pLEM415-sfGFP转化进入假单胞菌HZ-004中，得到sfGFP标记的假单胞菌HZ-004。
8.一种根据权利要求6所述的荧光标记氨氧化菌在废水毒性检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的荧光标记氨氧化菌在废水毒性检测中的应用，其特征在于：废水毒性检测前对荧光标记氨氧化菌进行活化，活化过程为：挑取荧光标记氨氧化菌的单菌落到分离培养基中，摇床培养，将获得的培养液全部转接到分离培养基中，摇床培养；得到菌株活化液。
10.根据权利要求8所述的荧光标记氨氧化菌在废水毒性检测中的应用，其特征在于：废水毒性检测时使用荧光传感检测装置，所述荧光传感检测装置包括外壳、激光光源(3)、第一滤光片(1)、第二滤光片(2)、光强检测器(4)、光强显示器(5)；第一滤光片(1)、第二滤光片(2)设置有比色皿，用于装载检测样品；
激光光源(3)发出激发光束，激光光源(3)、第一滤光片(1)在一条直线上，形成激发光路，第二滤光片(2)与荧光处理模块(4)在一条直线上，形成接收光路，激发光路和接收光路以比色皿为转折点，呈直角设置；光强检测器(4)接收光源，光强显示器显示器(5)显示荧光强度。
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