KR100555840B1

KR100555840B1 - 암모니아 산화 저해제 검출용 바이오센서

Info

Publication number: KR100555840B1
Application number: KR1020040039246A
Authority: KR
Inventors: 장덕진; 춰이롱
Original assignee: 장덕진
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2004-05-31
Publication date: 2006-03-03
Also published as: KR20050114049A

Abstract

본 발명은 암모니아 산화 저해제를 검출하기 위한 미생물 바이오센서에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 순수 배양된 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea)의 세포를 MWCO 12,000~16,000 Da의 투석막에 진공 여과시키는 방법에 의하여 막에 고정하고, 상기 세포가 고정된 막을 DO 프로브(DO probe)에 부착한 다음, 고정된 미생물 세포의 산소 섭취율(oxygen uptake rate)을 측정함으로써 암모니아 산화 저해제를 검출하는 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명에 의한 바이오센서를 이용하여 암모니아 산화 저해제를 분석할 경우, CBOD 물질에 의한 분석 에러가 발생하지 않으므로 매우 특이성과 민감성이 높은 분석 결과를 제공하며, 온라인 모니터링이 가능하여 암모니아 산화에 대한 실시간 정보를 제공하므로 매우 신속하고 간편한 분석 결과를 제공한다.

바이오센서, 니트로소모나스 유로파에아, 투석막, 순수 배양, 암모니아, 질산화

Description

암모니아 산화 저해제 검출용 바이오센서 {A biosensor for detecting inhibitors of ammonia oxidation}

도1a는 PVA 막에 포획된 니트로소모나스 유로파에아 세포를 SEM으로 확인한 결과이다.

도1b는 투석막에 흡착된 니트로소모나스 유로파에아 세포를 SEM으로 확인한 결과이다.

도2a는 페놀(1.0mg/L) 첨가시 DO 프로파일을 나타낸 것이다.

도2b는 여러 가지 페놀 농도에서 암모니아 산화 저해율을 나타낸 것이다.

도 3은 암모니아 농도에 따른 산소 섭취율(OUR)을 나타낸 것이다.

도 4는 산소 소모에 있어서 CBOD 물질(글루코오스 500mg/L)의 영향을 나타낸 것이다.

도 5는 TU(thiourea)를 함유한 합성 폐수의 온라인 모니터링 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 ATU 존재 하에 시간에 따른 니트로소모나스 유로파에아에 의한 아질산 형성을 나타낸 것이다.

도 7은 아질산 분석방법과 본 발명 바이오센서 분석방법에 의한 저해제(페 놀)의 K_I 및 EC50 측정 결과를 비교하여 나타낸 것이다.

바이오센서라 함은, 효소·항체 등 생물체의 기능물질 또는 미생물 등 생물체가 특정 물질과 예민하게 반응하는 생물 감지(感知) 기능을 이용하여, 시료에 함유되어 있는 화학물질(특히 복잡한 유기화합물)을 선택적으로 검출·계측하는 데 사용하는 화학센서를 말한다.

바이오센서는 감지 기능을 하는 검지소자의 종류에 따라 효소센서, 미생물센서, 면역센서 등으로 분류되며, 이 중 살아 있는 미생물을 검지소자로서 막 등에 고정·장치하여 사용하는 미생물센서는, 알코올발효·글루탐산발효 등 발효공업의 공정 관리, 수질 오염의 지표인 BOD(생물학적 산소요구량)의 측정 등에 이용되고 있다. 미생물의 대사 작용에 의해 측정 대상 물질이 전극 활성 물질로 변환되는 경 우 미생물막과 전극을 조합함으로써 대상 물질을 측정할 수 있는데, 이와 같이 대사 산물을 지표로 하는 형식의 미생물센서를 전극 활성물질 측정형 미생물센서라고 하며, 미생물 고정화막과 산소 전극을 이용하여 미생물의 호흡활성을 지표로 하는 형식의 미생물센서를 호흡측정형 미생물센서라 한다. 호흡측정형 미생물센서를 이용하면 미생물의 호흡활성에 영향을 미치는 물질의 측정이 가능하다.

미생물을 이용한 바이오센서(미생물센서)에 관한 선행특허로는, 한국등록특허 제0303611호 "미생물의 전기화학적 농화배양 방법 및 유기물질 및 BOD 분석용 바이오센서"에서 혐기적 조건에서 매개체 없는 생물연료 전지를 사용하여 전기화학적인 방법으로 시료 속의 유기물 농도 또는 BOD를 측정할 수 있는 바이오센서에 대해 개시한 바 있고, 등록특허 제0325424호 "생물화학적 산소요구량 측정용 바이오센서"에서는 슈도모나스 속 미생물이 고정화된 바이오센서를 이용하여 용존산소의 변화량을 계측하여 BOD를 측정하는 방법에 대해 개시한 바 있다.

한편, 세계적으로 폐수로부터 질소를 제거하기 위해 생물학적 공정이 이용되고 있는데, 이러한 공정에서, 산화 탱크에서 유입되는 암모니아는 아질산(nitrite)을 경유하여 질산(nitrate)으로 산화되며(nitrification), 질산(nitrate)는 질소 가스(nitrogen gas)로 환원된다(denitrification).

암모니아 산화 세균(Ammonia-oxidizing bacteria, AOB)은 화학합성 박테리아이며, 에너지와 카본을 각각 암모니아에서 아질산으로의 산화, CO₂ 고정을 통해 얻는다. 아질산 산화제 및 다른 종속영양미생물과 비교하여, AOB는 매우 천천히 성장 하며 다양한 종류의 저해제에 극히 영향을 받기 쉬운 것으로 알려져 있다. AOB에 의한 암모니아 산화가 저해되면, 결국 질소를 제거할 수 없게 된다. 존슨 등(Jonsson et al., 2000)은 스웨덴에서 폐수 처리한 식물 75개 중 48개에서 질산화에 문제가 발생하는 것을 보고한 바 있다. 따라서, 질산화 반응이 문제 없이 진행되는 것을 보증하기 위해서는, 폐수에서 암모니아 산화의 저해제를 검출하는 방법을 개발하는 것이 필요하다.

생물학적 암모니아 산화는 일반적으로 다음과 같이 이루어진다.

NH₄ ⁺ + 1.5O₂ -> NO₂ ^- + 2H⁺ +H ₂O

암모니아 산화 활성은 생성물(H⁺ 및 NO₂ ^-) 생성 비율 또는 기질 (암모니아 및 산소) 소모 비율을 측정함으로써 체크할 수 있다. 풍부한 질산화균 배양 또는 AOB 순수배양에 의한 암모니아 소모(Grunditz et al., 1998, Jonsson et al., 2000, Grunditz and Dalhammar, 2001) 또는 아질산 형성 비율(Jonsson et al., 2001)의 배치 모니터링(Batch monitoring)이, 암모니아 산화 저해를 측정하기 위해 가장 널리 이용되는 방법들이다. 그러나 일반적인 샘플링과 샘플의 화학적 분석은 고비용과 시간이 소모된다. Gernaey 등(1998 b)은 활성화된 슬러지의 질산화 반응속도를특징짓기 위해 산 생성 비율을 측정하였으나, 이 시스템은 복잡하다. Blum and Speece에 의해 암모니아 선택 전극에 의한 암모니아 소모 비율의 측정이 제안된 바 있으나, 이는 질소가 풍부한 유기 화합물의 가수분해로 인해 암모니아 측정이 방해 를 받는 문제점이 발생한다. DO 전극 사용은 산소 소모 측정에 의해 신속한 암모니아 산화 분석이 가능하나, 이러한 방법으로 질산화 활성을 평가하기 위해서는 많은 수고를 필요로 한다. 암모니아 산화는 많은 산소 소모를 수반하므로(ammoniacal nitrogen 1mg 당 O₂ 4.57mg가 소모됨), 낮은 질산화 비율이라도 산소 소모를 측정할 수 있으나, 특히 혼합된 활성 슬러지 또는 풍부한 질산화 생물공동체가 사용될 경우에는 종속영양 기질 산화 및 내생호흡을 위한 산소 소모를 암모니아 산화를 위한 산소 소모와 구별할 필요가 있다. 또한, 배치 호흡 분석(batch respirometric assay)에 따르면 암모니아 산화 저해에 대해 빠른 시간에 정확한 평가를 내릴 수 있으나, 과정이 여전히 복잡하며 온라인 모니터링에는 맞지 않다.

최근에는, 특정 미생물 세포를 바이오센서의 구성요소로서 이용하는 미생물 바이오센서를 이용하여 질산화 저해제를 탐지하는 기술이 연구되고 있다. 미생물 바이오센서는 실시간 분석, 조작의 간편성, 휴대가능성, 민감성 및 특이성이 뛰어나므로 널리 관심의 대상이 되고 있다. 보통 흡착(adsorption), 포획(entrapment), 공유결합(covalent binding), 가교결합(cross-linking) 또는 상기 방법의 조합이 생체물질의 고정에 이용되는데, 살아있는 세포가 사용될 때는 포획 및 흡착 방법을 이용하는 것이 특히 유용하다.

이와 관련된 선행기술로는, Konig 등(1997)이 폐수에서 질산화 저해제를 탐지하기 위한 바이오센서를 제시한 바 있다. 구체적으로는, 풍부한 질산화균(enriched nitrifiers)을 폴리카바모일술포네이트(PCS) 막에 고정하고, 이 막을 클락 타입 DO 탐침(clark-type DO probe) 끝에 부착한 다음, 고정된 미생물 세포의 산소 섭취율(oxygen uptake rate, OUR)을 측정함으로써 질산화 저해도를 평가하였다. 여기서 풍부한 질산화균 공동체가 사용되었으므로, 암모니아 산화를 아질산 산화와 구별하는 것이 불가능하며, 탄소질 BOD(carbonaceous BOD)의 저해제가 질산화 저해 분석을 방해한다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 인식하고, 바이오센서 분석을 간편화함과 동시에 암모니아 산화 저해에 대한 민감하고 정확한 측정치를 얻을 수 있는 방법에 대하여 연구를 계속한 결과, 혼합된 활성 슬러지 또는 풍부한 질산화균 대신에 순수배양(pure culture) AOB를 사용하는 것에 착안하였으며, 잘 알려진 AOB 균주이며 다른 AOB 균주보다 배양이 용이한 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea)의 세포 고정화 막을 이용함으로써, 빠르고 간편한 바이오센서를 개발하는데 성공하였다.

본 발명의 목적은 빠르고 정확한 암모니아 산화 저해제 검출용 바이오센서를 개발하는 것이며, 상기와 같은 본 발명의 기술적 과제는, 순수 배양된 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea)의 세포 고정화 막을 이용하여 바이오센서를 제조하고, 상기 바이오센서를 이용하여 암모니아 산화 저해제를 분석하고, 상기 바이오센서를 이용하여 온라인 모니터링 방법으로 암모니아 산화 저해제를 분석하고, 상기 분석 결과를 공지의 다른 분석방법에 의한 결과와 비교하여 본 발명 바이 오센서의 효과를 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 미생물 세포로서 순수 배양된 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea)를 사용하며, MWCO 12,000~16,000 Da의 투석막에 진공 여과시키는 방법에 의하여 미생물 세포를 고정하며, 측정 시료의 암모니아 농도는 50mg N L^-1로 하는 점에 특징이 있다.

암모니아 산화는 산소 소모를 수반하므로, DO 프로브(DO probe)를 사용하여 산소 소모율을 측정하면, 암모니아 산화 및 그 저해정도를 평가할 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 원리를 이용한 호흡측정형 미생물 바이오센서에 관한 것으로, 순수 배양된 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea)의 세포 고정화 막을 이용하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 니트로소모나스 유로파에아( N.europaea )의 배양

니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea) ATCC 19178의 배양을 위해 P-배지(P-medium)를 사용하였고(Iizumi et al., 1998) 발효기(KF-5L, Korea Fermentor Co., Ltd, Korea)를 연속 모드로 하여 배양하였다. 신선한 P-배지를 카세트 튜브 펌프(SMP-23, EYEL4, Tokyo Rikikai Co., Ltd, Japan)를 이용하여 0.004-0.008 hr^-1의 희석율로 계속적으로 발효기에 공급하였다. 발효기의 작동 조건은, air flow 1.51 min^-1 (0.5 vol/vol/min), agitation 150rpm. 온도 30℃, pH 7.8 (1N NaOH 첨가로 조절) 이다.

실시예 2 : 니트로소모나스 유로파에아의 막 고정 및 바이오센서 조립

(폴리비닐 알콜(PVA) 막에 N.europaea를 포획)

니트로소모나스 유로파에아는 발효기에서 7,000rpm으로 4℃, 10분간 배양한 세포 배양액 900mL를 원심분리하여 수득하고, 전 P-배지(pre-P-medium)(Na₂HPO₄: 13.5 gl^-1, KH₂PO₄: 0.7 gl^-1) 3mL에 현탁시켰다. PVA 4.8g 및 알긴산나트륨 0.36g을 3차 증류수 30mL에 교반하여 용해시키고 핫플레이트(hotplate)에서 열을 가하였다. 혼합물을 실온에서 냉각시키고, PVA 혼합물 1mL를 농축된 세포 현탁액 1mL와 혼합하였다. 상기 PVA 용액을 함유한 세포를 페트리 디쉬에 붓고, 1시간 건조시키고, 이 막(membrane)을 응고제(50% w/v NaNO₃ 및 2% w/v CaCl₂)에 1시간 동안 담그어 응고시켰다. 상기 세포 고정 막을 3차 증류수에 2회 담그었다.

(투석막에 N.europaea를 흡착)

상기와 같이 세포를 PVA 막에 포획하여 고정시키는 것과 별개의 방법으로서, 세포를 투석막에 흡착하는 방법에 의하여 세포를 고정해 보았다.

즉, 상기에서 얻어진 세포 현탁액을 Spectra/Pro^® 2 투석막(MWCO: 12,000-14,000 Da, Spectrum Laboratories, Inc., USA)에 진공 여과시킴으로써, 니트로소모나스 유로파에아 세포를 투석막에 고정하였다.

(세포 고정 막의 스캐닝 전자현미경 관찰)

상기와 같이 실시한 PVA 및 투석막에의 세포 고정(cell immobilization)은, PVA 및 투석막을 스캐닝 전자현미경(SEM)으로 관찰함으로써 확인하였다. PVA 및 투석막에 고정된 세포들은 4% 글루타랄데히드(glutaraldehyde)로 2시간 동안 실온에서 고착(fix)시키고, 10분 동안 30%(v/v), 50%, 70%, 95% 에틸 알콜에서 각각 탈수시켰다. 그런 다음 세포 고정 막을 알루미늄 스터드 위에 고정시키고 SEM(Hitachi, S-3500N, Japan)으로 관찰하였다.

도 1(a)와 같이 세포는 PVA에 포획되었으나, PVA 막에 고정된 니트로소모나스 유로파에아에서는 생물활성이 거의 관찰되지 않았다. 반면 도 1(b)와 같이 니트로소모나스 유로파에아 세포를 투석막에 진공 필터를 이용하여 흡착시켜 고정하였을 때는, 이상적인 활성(bioactivity)이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 바이오센서는, 투석막에 진공 여과시키는 방법에 의해 세포를 고정할 때 가장 효과적임을 확인할 수 있었다. 이 때 가장 바람직한 투석막의 MWCO는 12,000~16,000 Da 이다.

(바이오센서 조립)

세포가 없는 Spectra/Pro^® 2 투석막(dialysis membrane)을 밑에 놓고, 세포 고정 막을 그 위에 두었다. 그런 다음 테프론 막(YSI standard membrane kit, YSI, USA)를 맨 위에 두었다. 상기 세 층의 막을 고무 O-ring으로 죄어 YSI 5719 DO probe(YSI, USA) 끝에 고정시켰다(참조: Konig A. et al., 1997, Dubey and Upadhyay, 2001, Rastogi et al., 2003).

실시예 3 : 바이오센서를 이용한 암모니아 산화 저해제의 분석

(분석 방법)

40mL 챔버(chamber)를 25±1℃ 온도를 유지하는 항온에 두었다. 공기로 포화된 전-P-배지(pre-P-medium) 39.9mL를 챔버에 넣고, 마그네틱바(magnetic bar)로 350rpm으로 휘저었다. N.europaea 세포 고정 바이오센서를 용액에 담그고 DO를 측 정하였다. DO가 정상 상태(steady state)에 도달하면, 100g/L (NH₄)₂SO₄ 용액 100㎕를 첨가하고 또다시 정상 상태에 도달할 때까지 방치하였다(50-300초). 그런 다음 각 저해제 용액 40-200㎕를 용액에 첨가하고 안정될 때까지 DO를 측정하였다. 측정된 DO 값은 RS232 시리얼 케이블을 통해 YSI 5000(YSI, USA)에서 컴퓨터로 옮기고 Symantec Procomm plus 소프트웨어를 써서 각 초마다 저장하였다.

(저해제 및 화학물질의 입수)

모든 시약은 분석용 등급의 것을 사용하였고 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)사로부터 구입하였다. 모든 용액은 수돗물로 제조한 합성 폐수를 제외하고 3차 증류수로 제조하였으며, 합성 폐수의 제조를 위한 화학물질(chemicals)은 쇼와(Showa, Tokyo, Japan)사로부터 구입하였다. 암모니아 산화 저해제의 저장 용액(stock solution)은 저해 분석을 실시하기 전에 제조하여 사용하였다.

(암모니아 산화 저해제 분석)

니트로소모나스 유로파에아 세포에서, 암모니아는 최초로 암모니아 모노옥시게나아제(ammonia monooxygenase, AMO)에 의해 히드록실아민으로 산화된다. AMO는 그 활성 부위에 구리를 함유하므로, 티오우레아, 알릴티오우레아 등과 같은 구리-킬레이트화제가 저농도에서 강하게 AMO를 저해하는 것으로 알려져 있다. AMO는 암모니아 이외에 황, 방향족 화합물, 할로겐 화합물 등 다른 기질을 산화시킬 수 있으며, 이들 화합물은 경쟁적으로 AMO를 저해한다. 암모니아 산화 반응은 산소를 소 모하며 아질산과 수소 이온을 생성한다. 암모니아 산화 저해는 산소 섭취율(oxygen uptake rate, OUR)과 아질산 생성율(nitrite production rate, NPR)의 감소를 일으킨다. 따라서, 암모니아 산화 효율은 저해되는 OUR 및 NPR을, 저해제가 없을 때의 결과와 비교함으로써 평가할 수 있다. 본 발명에서 암모니아 산화 저해의 바이오센서 분석은 OUR의 측정으로 실시하였다.

바이오센서 끝은 세포 고정 막으로 덮여 있으므로, 용해된 산소는 벌크 솔루션(bulk solution)에서 투석막을 통해, 암모니아 산화 과정 중 니트로소모나스 유로파에아의 고정된 세포에 의해 산소 일부가 소비되는 고정된 세포층으로 확산된다. 남은 산소는 테프론 막을 통해 확산되고 산소 전극에 의해 검출된다. 따라서 바이오센서로 검출되는 dDO/dt는, 샌드위치 막을 통한 벌크 솔루션으로부터 전극으로의 산소 이송율(oxygen transfer rate)에서, 고정된 니트로소모나스 유로파에아에 의한 암모니아 산화에 따른 산소 소모율(oxygen consumption rate)을 뺀 것과 같으며, 따라서 다음 식과 같이 나타낼 수 있다.

dDO/dt = K(DO^*-DO) - OUR ......(Eq. 1)

DO^*는 벌크 솔루션의 DO 농도, DO는 센서의 전극 부위의 DO 농도를 나타낸다. K는 총 질량 이송계수(overall mass tranfer coefficient)를 나타낸다.

정상 상태(dDO/dt=0)에서, 산소 확산율(diffusion rate)은 산소 소모율(consumption rate)과 동등하다.

OUR = K (DO^* - DO) ......(Eq. 2)

도 2(a)에서 나타나듯이, 최초 단계의 용액(OUR=0, DO=DO^*)에는 암모니아가 없다. 암모니아의 첨가에 따라, DO는 세포에 의한 산소 소모로 인해 감소한다. 저해제(페놀)가 첨가되면, OUR은 암모니아 산화 저해에 의해 감소하고, 따라서 DO는 새로운 안정 상태에 도달할 때까지 증가한다. 보통, 암모니아 산화율을 측정하는 데는 두가지 방법이 있는데, 안정 상태 방법(steady-state method)과 최초율(initial rate method) 방법이다. 본 발명에서는 안정 상태 방법(steady-state method)을 사용하여 암모니아 산화율(ammonia oxidation efficiency)을 다음과 같이 계산하였다.

암모니아 산화율(%) = OUR_i/OUR_N x 100 = (DO^*-DO_i)/(DO^*-DO_N) x 100 ..(Eq.3)

OUR_N은 저해제 첨가 전 산소 섭취율, OUR_i는 저해제 첨가 후 산소 섭취율이다. DO_N은 저해제 첨가 전의 안정 상태 DO 값이고, DO_i는 저해제 첨가 후의 안정 상태 DO 값이다. 도 2(b)에서 나타나듯이, 페놀 농도 증가에 따라, 암모니아 산화 저해도 증가하며, 암모니아 산화율은 저해제 첨가 전후의 안정 상태 DO 값을 측정함으로써 구할 수 있다.

(암모니아 농도가 분석에 미치는 영향)

암모니아 산화의 기질로서, 암모니아 농도 자체는 Michaelis-Menten kinetics(Nowak and Svardal, 1993)에 따라 OUR에 영향을 줄 수 있다.

OUR = OUR_max x S _NH / (S _NH + K _NH ) ......(Eq. 4)

OUR_max는 최대 산소 섭취율, S_NH는 암모니아 농도, K_NH는 반 포화 계수(half saturation coefficient)이다.

바이오센서를 이용한 저해제 분석시 오차를 제거하기 위해, 암모니아 농도는 반응이 0차 반응속도를 유지하도록 충분히 높아야 한다. 바이오센서 분석을 위한 최적의 암모니아 농도를 결정하기 위해, 암모니아 농도 1mg NH₃-N L^-1 에서 100mg NH₃-N L^-1를 실험하였다. 각 암모니아 농도에서 OUR을 계산하고 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서 나타나듯이, 산소 섭취율은 암모니아 농도가 증가할수록 증가하였다. 암모니아 농도가 50mg N L^-1을 넘을 때, OUR에 다소 변화가 발생했는데, 이는 산소 소모율이 OUR_max에 도달하여 암모니아 농도가 더이상 OUR에 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다. 상기 결과에 따라, 암모니아 농도 50mg N L^-1이 바이오센서 저해제 분석을 실시하는데 가장 적합한 것을 확인하였다.

(CBOD 물질이 분석에 미치는 영향)

바이오센서 제조에 혼합 활성 슬러지(mixed activated sludge) 또는 또는 풍부한 질산화균(enriched nitrifiers)을 사용할 경우 주요 문제점 중 하나는, CBOD를 NBOD(nitrogenous BOD)와 구분하기 힘들다는 점인데, 이러한 문제를 해결하기 위해 본 발명에서는 니트로소모나스 유로파에아 순수 배양을 이용하였다. 독립영양 균의 순수 배양을 이용하였으므로, 도 4에서 나타나듯이 CBOD source(글루코오스, 500mg/L) 공급에 대한 바이오센서의 반응이 없다. 따라서, 본 발명의 바이오센서로부터는 암모니아 산화의 직접적 독점적인 신호(signal)가 얻어지며, 분석을 보다 정교하고 정확하고 민감하게 할 수 있다.

실시예 4 : 바이오센서를 이용한 암모니아 산화 저해제의 온라인 모니터링

(온라인 모니터링 방법)

40mL 바이오센서 챔버를 25±1℃ 온도를 유지하는 항온에 두었다. 합성 폐수(글루코오스 280mg/L, CaCl₂·2H₂O 20mg/L, MgSO₄·7H₂O 40mg/L, NH₄Cl 382mg/L, NaHCO₃ 1510mg/L, KH₂PO₄ 85mg/L)를 암모니아 산화 저해제로 오염시키고 역시 항온에 두었다. 신선한 깨끗한 합성 폐수(fresh clean synthetic wastewater) 40mL를 챔버에 첨가하고 마그네틱바로 350rpm으로 휘저었다. N.europaea 세포 고정 바이오센서를 상기 용액에 담그고 YSI 5000 DO meter로 DO를 측정하였다. DO가 정상 상태에 도달하면, 연동펌프로 신선한 깨끗한 합성 폐수(fresh clean synthetic wastewater)를 0.4 L/hr 속도로 주입하였다. 안정한 DO가 10분간 지속될 때, 저해제로 오염된 합성 폐수를 40분간 챔버에 주입하고, 그런 다음 깨끗한 합성 폐수의 주입을 재개하였다.

(암모니아 산화 저해제의 온라인 모니터링 결과)

본 발명의 바이오센서는 암모니아 산화 저해제의 계속적이며 실시간적인 모니터링을 가능하게 한다. 온라인 모니터링 실험은 0.1 및 1 mg/L의 TU를 함유한 합 성 폐수(COD: 300mg/L, ammoniacal nitrogen: 100mg-N/L)로 실시하였으며, 그 결과는 도 5에 나타내었다. 바이오센서 챔버에서 저해제 농도를 계산하는 데는 CSTR(Continuous Stirred Tank Bioreactor) 모델을 사용하였고, 그 결과는 바이오센서에 의해 결정된 DO profile과 비교하였다. 바이오센서 챔버의 HRT(Hydraulic retention time)은 0.099hr로 설정하였다. 실험 중 소실되는 저해제는 없다고 가정하고(no TU degradation or deactivation), 챔버 중의 저해제 농도가 들어오는 저해제 농도의 99%에 도달하는 데는 27.4분이 걸렸다. 도 5에서 나타나듯이, 바이오센서에 의해 결정된 DO는, 오염된 합성 폐수 주입 5분 후 암모니아 산화 저해에 의해 증가하기 시작하며, 30분 후 DO 피크를 나타내었다. 바이오센서 챔버 중 저해제의 농도 증가 및 DO의 비례적 증가는, 바이오센서가 저해제에 민감하며 실시간 암모니아 산화 저해 정보를 제공한다는 것을 나타낸다. 이러한 사실은 신선한 깨끗한 폐수 주입을 재개하였을 때 DO가 감소하는 것에서도 재확인 할 수 있다. 바이오센서 챔버의 HRT가 0.099hr에 불과하다는 것을 감안하면, 종래의 활성 슬러지 프로세스(6-15hr)(Metcalf&Eddy, 1991)의 산소조(oxic tank)의 HRT보다 훨씬 적다. 따라서 본 발명의 바이오센서를 이용한 온라인 모니터링은 암모니아 산화의 실시간 정보를 제공하며, 암모니아 산화 저해를 산소조에서보다 5-14hr 빨리 감지할 수 있다.

실험예 : 본 발명의 바이오센서의 효과 비교실험

본 발명에 의한 바이오센서의 효과를 확인하기 위해, 풍부한 질산화제 (enriched nitrifiers)를 이용한 바이오센서(Konig et al., 1998) 분석, 니트로소모나스 유로파에아의 세포 현탁액을 이용한 아질산 형성 분석(nitrite formation assay), 재조합 니트로소모나스 유로파에아를 이용한 생물발광 분석(bioluminescence assay, Iizumi et al., 1998) 등 종래의 방법과 비교하는 실험을 실시하였다.

니트로소모나스 유로파에아의 세포 현탁액을 이용한 아질산 분석 방법은 다음과 같다. 공기로 포화된 P-배지(P-medium) 39mL를 100mL 플라스크에 첨가하였다. 그런 다음, 저해제 용액 40-200㎕ 및 인산 완충된(phosphate-buffered) N.europaea 세포 현탁액 1mL를 플라스크에 첨가하였다. 상기 플라스크를 진동 인큐베이터(shaking incubator)에 두고 30℃에서 150rpm으로 배양하였다. 아질산은 colorimetric method(APHA et al., 1998)에 의해 2시간 마다, 12시간 동안 측정하였다. 저해제를 첨가하지 않은 플라스크를 대조군으로 하였다.

저해제로서 ATU를 사용한 아질산 형성 분석의 한 예는 도 6에 나타내었다. NPR 감소는, 암모니아 산화가 ATU 농도 증가에 의해 점차 저해되었음을 가리켰다. 암모니아 산화율(ammonia oxidation efficiency)은 다음 식과 같이 구할 수 있다.

암모니아 산화율(%)=NPR_i/NPR_N x 100 ......(Eq. 5)

NPR_i는 저해제가 있을 때의 아질산 생성율, NPR_N은 저해제가 없을 때의 아질산 생성율을 나타낸다.

각각의 방법에 의한 분석 결과를 평가하기 위한 EC50 결정은 다음과 같다.

우선, 저해제에 의한 암모니아 산화 저해는 다음과 같이 표현된다(Utgikar et al., 2003).

K_c =K₀exp(-K_IC) ......(Eq. 6)

K₀는 저해제 첨가 전 암모니아 산화율, K_c는 저해제 첨가 후 암모니아 산화 율, C는 저해제의 농도, K_I는 저해상수(inhibition constant) 이다. 상기 식을 다시 쓰면,

ln(K_c/K₀) = -K_IC ......(Eq. 7)

K_c/K₀는 상기의 식(Eq.) 3 또는 5에 의해 결정되는 암모니아 산화율이다. ln(K_c/K₀) 대 저해제 농도 C를 plotting 함으로써, 특정 저해제의 저해 상수(K_I) 및 EC50을 그래프상에서 얻을 수 있다(도 7 참조). EC50은 암모니아 산화 활성을 50% 감소시키는 독성 화합물의 농도로 정의된다.

상기 각 분석 방법에 의한 각 화학물질의 EC50은 하기 표 1에 나타내었다.

각 저해제의 EC50 값 (단위: mg/L)

저해제	본 발명의 바이오센서 분석 결과	풍부한 질산화제를 이용한 바이오센서 분석 결과	세포 현탁액을 이용한 아질산 분석 결과	생물발광 분석 결과
알릴티오우레아(Allylthiourea)	0.018	1.2	0.025	0.063
티오우레아(Thiourea)	0.01	0.8	NA	NA
티오아세타마이드(Thioacetamide)	0.027	NA	0.020	0.031
페놀(Phenol)	1.10	8.4	0.92	1.98
주) NA: data not available

도 7 및 표 1에서 나타나듯이, 니트로소모나스 유로파에아 고정 세포의 산소 소모율에 근거한 바이오센서 분석은, 아질산 형성 분석과 매우 유사한 결과를 나타내는데, 이러한 사실은 본 발명의 바이오센서에 의해 정확하고 민감한 암모니아 산화 측정이 가능하다는 것을 확인해준다. 본 발명의 바이오센서 분석의 정확성은, 히드록실아민 옥시도리덕타아제(hydroxylamine oxidoreductase) 프로모터의 조절 하에 luxAB를 함유한 재조합 니트로소모나스 유로파에아를 이용하는 생물발광 분석(bioluminescence assay, Iizumi et al., 1998) 방법과의 비교에 의해서도 확인할 수 있다. 표 1에서 나타나듯이, 실험된 저해제의 EC50은, 본 발명의 방법과 상기 생물발광 분석 방법을 비교했을 때 거의 동일했다. 니트로소모나스 유로파에아의 순수 배양을 이용한 바이오센서 및 생물발광 분석에 의해 결정된 EC50은, 풍부한 질산화제를 이용한 바이오센서(Konig et al., 1998)에 의해 결정된 EC50보다 훨씬 낮았다. 따라서 풍부한 질산화제를 이용한 바이오센서보다 본 발명의 바이오센서를 이용하는 것이 특이성이나 민감성에 있어서 우수한 것을 알 수 있다.

본 발명에 의한 바이오센서를 이용하여 암모니아 산화 저해제를 분석할 경우, CBOD 물질에 의한 분석 에러가 발생하지 않으므로 매우 특이성과 민감성이 높은 분석 결과를 제공하며, 온라인 모니터링이 가능하여 암모니아 산화에 대한 실시간 정보를 제공하므로 매우 신속하고 간편한 분석 결과를 제공한다. 본 발명에 의한 바이오센서를 이용할 경우 종래의 분석방법을 이용하는 경우보다 현저히 뛰어난 결과를 나타내므로, 이는 환경 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

MWCO 12,000~16,000 Da의 투석막에 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea) 세포 배양액을 전 P-배지(pre P-medium)에 현탁시킨 세포 현탁액을 진공여과시켜 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea) 세포를 막에 고정하고, 세포가 고정된 막을 DO 프로브(DO probe)에 부착한 다음, 고정된 니트로소모나스 유로파에아(Nitrosomonas europaea) 세포의 산소 섭취율(oxygen uptake rate)을 측정함으로 암모니아 산화 저해능을 평가하는 암모니아 산화 저해제 검출용 바이오센서.
삭제
제1항의 바이오센서를 이용한 암모니아 산화 저해제의 분석에 있어서, 측정 시료 중 암모니아 농도는 50mg N L^-1로 하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.