CN117143755A - 一株施氏假单胞菌株及其应用 - Google Patents

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CN117143755A CN202310182986.8A CN202310182986A CN117143755A CN 117143755 A CN117143755 A CN 117143755A CN 202310182986 A CN202310182986 A CN 202310182986A CN 117143755 A CN117143755 A CN 117143755A
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Abstract

本发明具体涉及一株施氏假单胞菌株及其应用。具体技术方案为：一株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YM‑1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62502。本发明提供了一株新的施氏假单胞菌，可在异养条件下快速繁殖、高效降解氨氮、高效去除硝酸盐和亚硝酸盐。所述施氏假单胞菌可制备为微生物菌制剂，用于各类会产生恶臭气体的场所进行除臭，场所例如畜禽养殖场、堆肥厂、污水处理厂等。

Description

一株施氏假单胞菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株施氏假单胞菌株及其应用。
背景技术
恶臭污染是指一切刺激嗅觉感官、引起人们不愉快、损害生活环境的气体物质，其成分复杂,刺激性大，对人类公共健康构成了巨大的威胁。针对种类繁多的恶臭气体，现有的除臭方法主要为：物理法、化学法和生物法或多种方法联用的处理方法。其中，生物法具有投资和运行成本低、处理效率高、生态安全、无二次污染、设备操作方便等优点，逐渐成为主流的恶臭污染物处理方式。
生物法中，微生物是重点和关键。大多数关于生物除臭的研究中，核心微生物菌群均为自养微生物体系，以异养微生物为核心的应用鲜有报道。相较于自养微生物，异养微生物具有生长代谢快、污染物去除效率高等优点。其中，异养硝化-好氧反硝化(HN-AD)细菌具有生长速率快、活性高、增殖底物广泛、能同时进行有机物降解和生物脱氮等优势，可以在好氧条件下在同一反应器中实现同步硝化反硝化作用，脱氮的同时减少了渗滤液二次污染的排放。另外，由于反硝化作用产碱，部分HN-AD细菌可以中和循环液中的酸性液体，维持循环液pH。HN-AD细菌还可以实现循环液中有机物去除，达到脱氮除碳的目的。因此，异养硝化好氧反硝化菌在除臭领域和脱氮领域具有广泛的应用前景。
然而，现有技术中的HN-AD细菌存在脱氮效率不理想，可以降解的氮的种类有限，无法对多种形式的氮都实现高效降解，同时存在多种形式的氮时降解能力有限等缺陷，亟需开发新的可高效脱氮除臭的HN-AD细菌。
发明内容
本发明的目的是提供一株施氏假单胞菌株及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YM-1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62502。
优选的，其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
相应的，所述施氏假单胞菌在除臭中的应用。
相应的，所述施氏假单胞菌在脱氮中的应用。
相应的，利用所述施氏假单胞菌制备的菌剂。
优选的，所述菌剂中还包括脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)。
优选的，所述脱氮副球菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62483。
优选的，所述菌剂中，按活菌比，施氏假单胞菌：脱氮副球菌＝1:2～3。
相应的，一种生物滴滤塔除臭方法，包括如下步骤：
(1)将施氏假单胞菌，或施氏假单胞菌和脱氮副球菌分别培养至活菌量为108～109CFU/mL；所述施氏假单胞菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62502。所述脱氮副球菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62483。
(2)将微生物培养基加入装有填料的生物滴滤塔中，再加入所述施氏假单胞菌的菌液，或按活菌量为1:2～3混合的所述施氏假单胞菌和所述脱氮副球菌的混合菌液；
(3)设置通入生物滴滤塔的空气流速为20～40L/min、待处理气体进气量气体浓度100～200mg/m3；
(4)挂膜驯化完成后向生物滴滤塔中通入待处理气体进行除臭。
优选的，步骤(3)所述驯化的条件为：环境温度30～35℃、pH为7.0～7.5、湿度38％～45％。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一株新的施氏假单胞菌，可在异养条件下快速繁殖、高效降解氨氮、高效去除硝酸盐和亚硝酸盐。所述施氏假单胞菌可制备为微生物菌制剂，用于各类会产生恶臭气体的场所进行除臭，场所例如畜禽养殖场、堆肥厂、污水处理厂等。与特定的脱氮副球菌组成菌制剂时，即使在厌氧且同时存在多种形态的氮的环境中，也能够实现良好的氮降解和除臭效果。
附图说明
图1为施氏假单胞菌YM-1摇瓶培养情况示意图；
图2为施氏假单胞菌YM-1在不同温度下的生长曲线示意图；
图3为脱氮副球菌HY-1平板生长示意图；
图4为施氏假单胞菌YM-1对初始浓度约为100mg/L的氨氮去除速率示意图；
图5为施氏假单胞菌YM-1对初始浓度约为100mg/L的亚硝酸盐去除速率示意图；
图6为施氏假单胞菌YM-1对初始浓度约为100mg/L的硝酸盐去除速率示意图；
图7为施氏假单胞菌YM-1以氨氮为底物在不同转速下培养结果示意图；
图8为施氏假单胞菌YM-1以氨氮为底物在不同温度下培养结果示意图；
图9为施氏假单胞菌YM-1以硝酸盐为底物在不同碳氮比下培养结果示意图；
图10为施氏假单胞菌YM-1以硝酸盐为底物在不同pH下培养的结果示意图；
图11为施氏假单胞菌YM-1以硝酸盐为底物在不同转速下培养的结果示意图；
图12为施氏假单胞菌YM-1以硝酸盐为底物利用不同碳源的结果示意图。
具体实施方式
本发明提供了一株新的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YM-1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62502。其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
所述施氏假单胞菌为兼性营养型微生物，可在异养条件下快速繁殖、高效降解氨氮、高效去除硝酸盐和亚硝酸盐，具有良好的除臭性能。
所述施氏假单胞菌可制备为微生物菌制剂，用于各类除臭领域，例如畜禽养殖场、堆肥厂、污水处理厂等领域除臭。
优选的方案为：将所述施氏假单胞菌与脱氮副球菌联合制备为微生物菌制剂后再用于除臭。所述脱氮副球菌优选为脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)HY-1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62483。其16S rDNA序列如SEQ ID No.2所示。
优选的方案为：按活菌量，所述施氏假单胞菌与所述脱氮副球菌的比例关系为：1:2～3。
本发明还基于所述施氏假单胞菌提供了一种在生物滴滤塔中除臭的方法，具体包括如下步骤：
(1)将所述施氏假单胞菌，或所述施氏假单胞菌和所述脱氮副球菌分别培养至活菌量为108～109CFU/mL。
(2)将微生物培养基加入装有填料的生物滴滤塔中，再加入施氏假单胞菌菌液，或按活菌量为1:2～3混合的施氏假单胞菌和脱氮副球菌混合菌液。
(3)设置通入生物滴滤塔的空气流速为20～40L/min、氨气进气量气体浓度100～200mg/m3，在环境温度30～35℃、pH为7.0～7.5、湿度38％～45％的条件下，挂膜驯化6～8天。
(4)挂膜驯化完成后向生物滴滤塔中通入待处理气体，按生物滴滤塔常规处理方法处理即可。
需要说明的是，上述方法是示例性的，并非限定本发明提供的微生物和微生物菌制剂只能通过生物滴滤塔进行除臭，也并非限定只能用于气体除臭。本领域技术人员可以采用常规技术手段进行其他除臭，例如直接将微生物或微生物菌制剂接种到待除臭的液体或固体中混匀，也可以达到除臭的目的。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
本发明实施例涉及的培养基和溶液如下：
1、活性污泥驯化培养基(g/L)：KH2PO41.0g、K2HPO4 4.0g、MgCl20.5g、FeSO4 0.01g、葡萄糖5.0g、硫酸铵添加量如表1所示、丁二酸钠5.0g；其中氨氮的添加量见下表：
表1活性污泥驯化培养基中硫酸铵添加量(单位：g/L)
\ Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
(NH4)2SO4 0.46 0.98 1.42 1.96 2.0
2、LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、NaCl 10.0g、pH＝7.0。所述LB培养基主要用于扩大培养。
3、异养硝化培养基(g/L)：(NH4)2SO4 0.47g、丁二酸钠5.62g、维斯盐溶液50mL，C/N＝10，pH＝7。
4、亚硝酸盐培养基(g/L)：NaNO2 0.49g、丁二酸钠5.62g、维斯盐溶液50mL，C/N＝10，pH＝7。
5、硝酸盐培养基(g/L)：KNO3 0.72g、丁二酸钠5.62g、维斯盐溶液50mL，C/N＝10，pH＝7。
后文未专门写明需调节配方时，硝酸盐培养基为上述配方。如果需要调整硝酸盐培养基中的碳源，则使用其他碳源替代丁二酸钠，并相应调节碳源和KNO3的用量使C/N＝10即可。例如：以蔗糖为碳源，则添加KNO3 1.5g、蔗糖4.94g。如果需要调节硝酸盐浓度，则相应调整KNO3用量即可。上述调节均属于本领域公知常识，后文不再赘述。
6、组合氮源培养基(g/L)：(NH4)2SO4 1.41g、NaNO2 1.47g、KNO3 2.16g、丁二酸钠16.86g、维斯盐溶液50mL，C/N＝10，pH＝7。
7、厌氧反硝化培养基(DM)(g/L)：丁二酸钠21.48g、硝酸钾3g、磷酸二氢钾1.5g、七水合磷酸氢二钠5.0g、微量元素溶液2mL，七水合硫酸镁0.1g，去离子水1000mL，调节pH＝7.0。
8、厌氧组合氮源培养基(DM1)(g/L)：丁二酸钠21.48g、硝酸钾3g、硫酸铵1.0g、磷酸二氢钾1.5g、七水合磷酸氢二钠5.0g。
9、厌氧组合氮源培养基(DM2)(g/L)：丁二酸钠21.48g、硝酸钾3g、亚硝酸钠1.0g、磷酸二氢钾1.5g、七水合磷酸氢二钠5.0g。
10、厌氧组合氮源培养基(DM3)(g/L)：丁二酸钠21.48g、硝酸钾3g、硫酸铵1.0g、亚硝酸钠1.0g、磷酸二氢钾1.5g、七水合磷酸氢二钠5.0g。
11、微量元素溶液：EDTA 100mg，ZnSO4 4.4mg，CaC12 11mg，MnC12·4H2O 10.2mg，FeSO4·7H2O 10mg，(NH4)6MoO24·4H2O 2.2mg，CuSO4·5H2O 3.2mg，CoC12·6H2O 3.2mg，去离子水1000mL。
12、维斯盐溶液(g/L)：磷酸氢二钾5.0g、七水合硫酸镁2.5g、氯化钠2.5g、七水合硫酸亚铁0.05g、硫酸锰0.05g、去离子水1000mL。
13、循环培养基(g/L)：葡萄糖6g、丁二酸钠5.62g、KH2PO4 1.0g、K2HPO4 1.0g、MgCl20.4g、NaHCO3 0.4g。
上述培养基意为展示对应培养基中组成，如果需要调整培养基中某组分或N的浓度，则调整相应组分用量即可，为本领域常规技术后文不再赘述。
实施例一：施氏假单胞菌的筛选和鉴定
1、驯化与筛选。采集四川双流航空港污水处理厂二沉池活性污泥，取回后使用活性污泥驯化培养基进行多碳源曝气驯化培养，根据活性污泥驯化培养基中硫酸铵浓度由低至高逐渐更换培养基进行培养，每个浓度驯化6天，共计驯化30天。
驯化完成后，取上清液体，先后接种于异养硝化培养基和好氧反硝化培养基(硝酸盐培养基)中分别富集4次，每次3天。随后进行梯度稀释，分别从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度下吸取0.1mL于LB培养基中进行涂布，30℃恒温培养。培养获得多个菌落，挑取生长情况好的单菌落于LB培养基中逐一培养，重复5次以上获得纯菌。对获得的菌株进行初步效果实验，部分微生物的实验结果如表2所示。
表2菌株初筛效果实验
2、鉴定
(1)菌株YM-1的生理生化特征如表3所示。表3中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
表3施氏假单胞菌YM-1的生理生化性质
检测项目 检测结果 检测项目 检测结果
革兰氏染色 - V.P -
菌体形状 球形 接触酶 +
氧化酶 - M.R -
淀粉水解 + 明胶 -
硝酸盐还原试验 + 好/厌氧性 好氧/厌氧
葡萄糖 + 麦芽糖 -
L-阿拉伯糖 - 乳糖 -
木糖 - 油脂 +
将分离纯化的YM-1菌株按照1％(v/v)的接种量分别接种于异养硝化培养基、亚硝酸盐培养基和硝酸盐培养基HN-DA培养基中，置于不同温度的摇床中(5℃、10℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、40℃、45℃、50℃)分别培养12h，通过测定OD600确定YM-1菌株生长温度为10～50℃，最适生长温度为35℃。采取不同初始pH(3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0)分别在30℃下培养24h，测定OD600确定该菌生长pH为6～10.0，最适生长pH为7～8。采取不同C/N(1、5、10、15、20、25、30)分别在pH为6.5、温度为35℃的条件下测量OD600确定该菌株的耐受范围是C/N为1～25，最适C/N为5。
将分离纯化的YM-1菌株在摇瓶中培养时，培养过程中菌体会聚集形成不规则小块沉淀，结果如图1所示。
采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用细菌16SrDNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，测序分析。测序结果经NCBI数据库中的BLAST比对，鉴定该菌株为施氏假单胞菌，命名为Pseudomonas stutzeri YM-1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62502。
对施氏假单胞菌YM-1进行不同温度的生长曲线研究，选用LB培养基进行培养，结果如图2所示。结果显示：施氏假单胞菌YM-1可以在温度范围为20～40℃的有机碳源异养培养基中快速生长，在35℃下培养24h，菌液OD600为0.589，培养过程中菌体会聚集成不规则的小块沉淀，导致OD值偏低。在工程应用中，特别是膜生物反应器中，该菌株可快速附着在细胞膜上，异养条件下生长快速，缩短了生物膜反应器启动时间，具有较大的工业推广应用潜力。
(2)菌株HY-1在LB平板的菌落生长形态如图3所示，其菌落为圆形，乳白色，表面光滑且不透明。革兰氏染色为红色，表明其为革兰氏阴性细菌。菌株的SEM图显示菌株HY-1为短杆状细菌，单个菌体大小为约为0.5μm×(0.9～1.2)μm。通过16S rDNA测序并在NCBI中进行对比发现，该菌隶属于Paracoccus属，与菌株Paracoccusdenitrificans NBRC-102528相似性高达96％。鉴定为脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)HY-1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62483。
根据Bioscreen C仪器测得的数据绘制菌株HY-1的生长曲线，结果表明，0～24h为菌株HY-1的对数生长期，24～40h期间为菌株生长的稳定期，40h后菌株OD600值迅速下降，进入衰亡期。
实施例二：施氏假单胞菌在除臭中的效果展示
1、脱氮效果展示。
将100mL脱氮培养基(异养硝化培养基、硝酸盐培养基、亚硝酸盐培养基，统称为脱氮培养基)在115℃下灭菌30min，然后按照1％(v/v)接种量接入培养24h的施氏假单胞菌菌液(OD600＝1.4)，用好氧试管塞塞住瓶口，置于摇床中震荡培养(35℃、180r/min)。
同时设置空白对照组。空白对照组使用等量无菌水替代施氏假单胞菌菌液，其余条件相同。培养的氮源分别为氨氮(使用异养硝化培养基)、亚硝酸盐(使用亚硝酸盐培养基)和硝酸盐(使用硝酸盐培养基)，初始浓度均约为100mg/L。每个实验组设置三个重复，每隔2h分别测定各组培养基中氨氮、硝氮、亚硝氮浓度，结果取平均值，结果如图4～6所示。
图4为菌株YM-1对初始浓度约为100mg/L的氨氮的去除速率示意图。培养基中初始氨氮浓度为100.13mg/L。需要说明的是：100mg/L为设计浓度，100.13mg/L为实测浓度，两者存在试验上可接受的误差；后续涉及初始浓度差异时也是同样，不再赘述。培养6h时，培养基中浓度降低为74.53mg/L，此时YM-1对氨氮的去除率为25.57％。培养到12h时，培养基中的氨氮浓度仅为17.78mg/L，此时对氨氮的去除效率高达82.24％。证明YM-1菌株具有较强的氨氮降解能力。
图5为菌株YM-1对初始浓度约为100mg/L的亚硝酸盐的去除速率示意图。培养基中初始亚硝酸盐浓度为113.13mg/L。反应进行到6h时，培养基中剩余55.84mg/L的亚硝酸盐，去除率为50.64％。反应到8h时，培养基中亚硝酸盐的浓度为0mg/L，对亚硝酸盐的去除效率高达100％。证明菌株YM-1具有较强的亚硝酸降解能力。
图6为菌株YM-1对初始浓度约为100mg/L的硝酸盐的去除速率示意图，培养基中初始硝酸盐浓度为100.34mg/L。反应进行到6h时，培养基中剩余5.89mg/L的硝酸盐，去除率为94.13％。当反应到12h时，培养基中硝酸盐的浓度为4.86mg/L，去除效率高达95.16％。证明菌株YM-1具有较强的硝酸盐降解能力。
同时，菌株YM-1在脱氮过程中，pH均为弱碱性，在除臭中具有pH自调节功能，无需额外添加碱性试剂。在以氨氮为培养基的pH范围为7.31～8.11，以亚硝酸盐为培养基的pH范围为8.46～9.15，以硝酸盐为培养基的pH范围为8.17～9.34。
2、菌株YM-1降解氨氮的条件筛选。
设置多个实验组，各组分别将100mL异养硝化培养基溶液在115℃下灭菌30min，然后按照1％(v/v)接种量接入培养24h的施氏假单胞菌菌液，用好氧试管塞塞住瓶口，置于摇床中震荡培养，测定菌株在不同条件下的去除速率，优化条件。同时针对每个实验组设置空白对照组，各空白对照组均分别使用等量无菌水替代施氏假单胞菌菌液，其余条件相同。每组设置三个重复，分别在不同转速(80、120、160、200、240r/min)，不同温度(20、25、30、35、40℃)的条件下培养24h后取样，测各组培养基中的氨氮浓度。结果如图7、8所示。
图7为菌株YM-1以氨氮为底物在不同转速下培养的结果示意图。以初始培养基为200mg/L的氨氮在不同转速的条件下去除效率差别显著(前述实验中发现菌株降解氨氮效率较高，故将氨氮初始浓度提升至200mg/L以考察微生物降解潜力)。在80、120、160、200、240r/min转速下，24h的去除速率分别为43.36％、73.63％、79.95％、90.314％、91.99％。实验结果表明，转速是影响菌株YM-1降解氨氮的重要因素，在高转速下(≥160r/min)条件下，菌株YM-1可快速的降解200mg/L的氨氮。
图8为菌株YM-1以氨氮为底物在不同温度下培养的结果示意图。以初始培养基为200mg/L的氨氮在不同温度的条件下去除效率差别显著。在20、25、30、35、40℃下，24h的去除速率分别为28.39％、74.69％、91.10％、93.25％、70.88％。
3、菌株YM-1降解硝酸盐的条件筛选。
将100mL硝酸盐培养基溶液在灭菌锅中115℃条件先灭菌30min，然后按照1％(v/v)接种量接入培养24h的施氏假单胞菌菌液，用好氧试管塞塞住瓶口，置于摇床中震荡培养。测定菌株在不同条件下的好氧反硝化速率，优化培养条件。同时针对每个实验组设置空白对照组，各空白对照组均分别使用等量无菌水替代施氏假单胞菌菌液，其余条件相同。每组设置三个重复，分别在不同碳氮比(5、10、15、20、25)、不同pH(5、6、7、8、9)、不同转速(80、120、160、200、240r/min)、不同碳源(乙酸钠、柠檬酸钠、丁二酸钠、葡萄糖、蔗糖)条件下12h取样，测硝酸盐的浓度，分析菌株YM-1在不同条件下的反硝化效率，得到优化条件。结果如图9～12所示。
图9为菌株YM-1以200mg/L硝酸盐为底物在不同碳氮比下培养的结果示意图。结果表明，在不同碳氮比下12h的去除速率分别为97.15％、95.42％、94.12％、92.23％、90.77％。实验结果表明，碳氮比在5～25范围内，菌株YM-1的好氧反硝化速率均保持在90％以上，证明菌株YM-1可以在低碳氮比条件下快速的降解硝酸盐。菌株YM-1在低碳氮比条件下仍然具有较好的去除速率，降低了除臭的成本，应用前景广阔。
图10为菌株YM-1以200mg/L硝酸盐为底物在不同pH下培养的结果示意图，结果表明，在不同pH(5～9)的条件下去除效率差别显著，不同pH下，在12h的去除速率分别为8.52％、12.77％、94.07％、93.13％、93.33％。
图11为菌株YM-1以200mg/L硝酸盐为底物在不同转速下培养的结果示意图。结果表明，不同转速下在12h的去除速率分别为91.56％、92.34％、92.45％、92.89％、92.36％。结果表明，菌株YM-1在转速为80～240r/min的条件下均具有较好的去除效率，去除率大于90％以上。好氧条件下，转速一定程度上代表了培养基中溶解氧的浓度，结果显示，即使在低溶解氧浓度条件下，菌株YM-1依然能发挥较好的反硝化作用。
图12为菌株YM-1以200mg/L硝酸盐为底物利用不同碳源的结果示意图。结果表明，不同碳源(乙酸钠、柠檬酸钠、丁二酸钠、葡萄糖、蔗糖)对去除效率影响显著，不同碳源下，硝酸盐在12h的去除速率分别为37.94％、84.57％、93.62％、15.55％、6.01％。结果表明，菌株YM-1可利用多种碳源，其中效果最好的碳源为柠檬酸钠和丁二酸钠，其次为乙酸钠，在以葡萄糖为碳源时，其反硝化速率依然有15.55％。
4、菌株YM-1在生物滴滤塔中的除臭应用。
将施氏假单胞菌YM-1在LB培养基中培养24h得到YM-1菌液，培养条件为35℃、pH＝7.0，培养基中C/N为15。将培养后的YM-1菌液加入装有填料的生物滴滤塔内，并向生物滴滤塔中通入200ppm、20L/min的氨气，保持35℃、pH＝7.0，挂膜驯化一定时间，使YM-1稳定附着到填料上。然后向生物滴滤塔中通入氨气进行去除氨气的验证试验。实验过程中向生物滴滤塔内加入循环培养基，为YM-1提供生长所需营养，同时持续通入200ppm、20L/min的氨气。生物滴滤塔中循环培养基加入方式为：首次加入15L循环培养基，每周更换1/3体积(即排出1/3旧的循环培养基，再补入等量新的循环培养基)。
生物滴滤塔设置两组实验组，各组设置条件如表4所示。同时各组设置空白对照组，空白对照组不进行菌种挂膜，并以自来水代替循环培养基，其余条件与各自对应的实验组相同。分别记录各塔入口及出口处的气体浓度，循环培养基中离子浓度等，从而观察施氏假单胞菌YM-1对气体污染物的去除和降解能力。分别处理25天后，结果如表4所示。
表4各组生物滴滤塔设置条件及除臭结果
5、菌株YM-1在堆肥气体除臭中的应用。
将施氏假单胞菌YM-1在LB培养基中培养24h，得到施氏假单胞菌YM-1菌液，培养条件为35℃、pH＝7，培养基中C/N为10。
向装有竹炭填料(3～5cm)的生物滴滤塔(105L)中加入循环培养基，然后将2L施氏假单胞菌YM-1菌液用蠕动泵循环注入装有填料的生物滴滤塔。同时将堆肥厂堆肥过程中产生的臭气(主要为氨气)以30L/min的空气流速、气体浓度为500ppm通入生物滴滤反应器，保持环境温度30℃、pH为7.5、湿度45％，挂膜驯化5天，使该菌能够稳定的附着在填料上。挂膜驯化完成后，继续向生物滴滤塔中以30L/min的空气流速、气体浓度为500ppm通入堆肥厂堆肥过程中产生的臭气，同时向生物滴滤塔内加入循环培养基，循环培养基为施氏假单胞菌YM-1提供生长所需营养。循环培养基添加和更换方式同本实施例步骤4。
对照组加入空白填料，不进行菌种挂膜实验；以自来水代替循环培养基，其余条件相同。分别记录两组反应器入口及出口处的气体浓度及循环液的离子浓度，从而观察施氏假单胞菌YM-1对堆肥厂产生臭气的去除和降解能力。其结果如表5所示。
表5施氏假单胞菌YM-1除臭效果展示
项目指标 对照组 实验组
氨气去除率(％) 79.65 99.87
氨氮浓度(mg/L) 108.32 4.87
亚硝酸盐浓度(mg/L) 17.25 0.4
硝酸盐浓度(mg/L) 546.32 45.89
COD浓度(mg/L) 8754.36 684.24
综上，施氏假单胞菌YM-1对臭气中氨气的去除率接近100％，除臭效果好，同时极大程度上降低了循环液中的离子浓度，减轻了二次污染。
实施例三：施氏假单胞菌和脱氮副球菌联合除臭效果展示
将异养硝化培养基在115℃下灭菌30min，分成2组，分别按1％(v/v)接种施氏假单胞菌YM-1和脱氮副球菌HY-1，分别用好氧试管塞塞住瓶口，分别置于摇床中震荡培养(35℃、180r/min)24h左右，培养至各自的OD600＝1.4，获得YM-1菌液和HY-1菌液。同时使用其他来源的施氏假单胞菌和脱氮副球菌，按相同方法培养至OD600＝1.4。将不同来源的施氏假单胞菌菌液和脱氮副球菌菌液分别按表6的不同体积比分别混匀，获得11组复合菌制剂。表6中，“\”表示未使用对应微生物。需要说明的是，发明人课题组并非只进行了表6展示的组合试验，只是出于篇幅考虑，只体现了部分有代表性的组合方式。
表6各组复合菌制剂配方
将表6各组复合菌剂分别按体积比1％(v/v)接种到氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐共存的培养基中(使用组合氮源培养基，氨氮、亚硝氮和硝氮初始设计浓度均为300mg/L)，同时针对每个组别设置空白组，空白组中使用等量无菌水替代复合菌剂，其余条件相同。各组分别在35℃、200r/min、通入空气(有氧)条件下培养12h，或隔绝空气(厌氧)条件下培养24h，每个处理重复3次，测试各组中氨氮、硝氮、亚硝氮浓度，结果取平均值。结果如表7所示，单位为mg/L。
表7各组复合菌脱氮效果展示
结果显示：HY-1:YM-1＝3:1(组5)时效果最佳。该组有氧条件下延长处理时间到22h时，该组氨氮浓度降低为0，亚硝氮浓度降低为15.2mg/L(并在24h时降低为0)，硝氮浓度降低为37.35mg/L；厌氧条件下延长时间到36h时，该组氨氮浓度降低到101.22mg/L，亚硝氮浓度降低为32.51mg/L，硝氮浓度降低为121.24mg/L。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一株施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)YM-1，于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62502。
2.根据权利要求1所述施氏假单胞菌，其特征在于：其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1或2所述施氏假单胞菌在除臭中的应用。
4.权利要求1或2所述施氏假单胞菌在脱氮中的应用。
5.利用权利要求1或2所述施氏假单胞菌制备的菌剂。
6.根据权利要求5所述菌剂，其特征在于：所述菌剂中还包括脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)。
7.根据权利要求6所述菌剂，其特征在于：所述脱氮副球菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62483。
8.根据权利要求6或7所述菌剂，其特征在于：所述菌剂中，按活菌比，施氏假单胞菌：脱氮副球菌＝1:2～3。
9.一种生物滴滤塔除臭方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将施氏假单胞菌，或施氏假单胞菌和脱氮副球菌分别培养至活菌量为108～109CFU/mL；所述施氏假单胞菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62502；所述脱氮副球菌于2022年12月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO：62483；
(2)将微生物培养基加入装有填料的生物滴滤塔中，再加入所述施氏假单胞菌的菌液，或按活菌量为1:2～3混合的所述施氏假单胞菌和所述脱氮副球菌的混合菌液；
(3)设置通入生物滴滤塔的空气流速为20～40L/min、待处理气体进气量气体浓度100～200mg/m3，挂膜驯化；
(4)挂膜驯化完成后向生物滴滤塔中通入待处理气体进行除臭。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于：步骤(3)所述驯化的条件为：环境温度30～35℃、pH为7.0～7.5、湿度38％～45％。
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