CN107164265A - 一种微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

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杨远澄
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Abstract

本发明涉及微生态制剂制备技术领域，尤其涉及一种微生态制剂及其制备方法，原料为枯草芽孢杆菌，约氏不动杆菌，乳酸杆菌，酵母菌。通过如下方法制备：冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、酵母菌分别在斜面中活化，之后纯化得各斜面菌种，备用；利用各斜面菌种制备相应的原菌液；将各原菌液按固定菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，得复合微生态菌剂的一级种子；将一级种子接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中培养得复合微生态菌剂的二级种子；最后将二级种子接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ培养以获得复合微生态菌剂的成品，该复合微生态制剂能够有效地降低污水中的氮磷，减少污水的富营养化程度。

Description

一种微生态制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种复合微生态制剂领域，尤其是一种污水脱氮除磷微生态制剂及其制备方法。
背景技术
目前，我国水环境污染相当严重，全国七大江河水系中，40％左右水质劣于五类标准；全国75％的湖泊出现不同程度的富营养化；城市河段污染突出；沿海河口地区和城市附近海域污染污染严重，赤潮发生频次增加，面积扩大。水环境的污染已直接威胁着城市饮用水的安全和人民的健康。所以，对受污染的江河湖泊水体进行修复，已是社会经济发展及生态环境建设的迫切需要。
水体富营养化(eutrophication)指的是水体中N、P等营养盐含量过多而引起的水质污染现象。其实质是由于营养盐的输入输出失去平衡性，从而导致水生态系统物种分布失衡，单一物种疯长，破坏了系统的物质与能量的流动，使整个水生态系统逐渐走向灭亡。
氮和磷是生物的重要营养源，目前化肥、洗涤剂和农药使用普遍，天然水体中氮、磷含量急剧增加，导致水体富营养化，水体中蓝藻、绿藻大量繁殖，水体缺氧并产生毒素，使水质恶化，对水生生物和人体健康产生很大的危害。
使用微生物进行水体净化是目前应用较多的水质净化方法，常用于江河湖泊水体净化、污水治理及修复的生物产品，由多种微生物菌群组成，采用生物工程手段对自然微生物进行改性、强化、驯化培养而成的高效专用微生物应用于水体净化方面。
国内目前使用微生物净水方面的应用日益被接受和重视，但研究仅于起步阶段。在应用方面，国内独立开发的主要是一些单一菌株，如光合细菌、芽孢杆菌、蛭弧菌等；复合制剂主要是仿制或引进国外的商品，且多数是对生长速率、饵料转化率、存活率等方面的数据，还没有用更科学的研究手段和内容评价作用机理和使用效果。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种用于净化富营养化水体的复合微生态制剂，具体是通过以下技术方案得以实现的：
以枯草芽孢杆菌及约氏不动杆菌为主要菌群，以乳酸杆菌、酵母菌为辅助菌群配置微生态制剂；其中枯草芽孢杆菌40-60％，约氏不动杆菌20-40％，乳酸杆菌10-20％，酵母菌10-20％。
具体制备方法：
(1)原菌种斜面培养：将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得枯草芽孢杆菌斜面菌种、约氏不动杆菌斜面菌种、乳酸杆菌斜面菌种、及酵母菌斜面菌种，备用；
(2)原菌种液体培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅰ中，之后于28℃-30℃厌氧钨丝灯光照培养5-7天得枯草芽孢杆菌原菌液；将约氏不动杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅱ中，接着于25℃-28℃下好氧培养3-5天得约氏不动杆菌原菌液；将乳酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅲ中，接着于37℃下厌氧培养1-2天得乳酸杆菌原菌液；将酵母菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅳ中，之后于28℃-30℃下好氧培养3天得酵母菌原菌液；
(3)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌原菌液、约氏不动杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液、及酵母菌原菌液按枯草芽孢杆菌40-60％，约氏不动杆菌20-40％，乳酸杆菌10-20％，酵母菌10-20％的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，具体地：先接种约氏不动杆菌原菌液、酵母菌原菌液并于28℃-30℃下好氧培养3天，然后再接种枯草芽孢杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液37℃厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
(4)二级种子培养：将所得的一级种子按5％的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中，并于28℃-30℃下先好氧培养3-5天再厌氧培养3-5天，得复合微生态制剂的二级种子；
(5)成品培养：将所得的二级种子按5％的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ中，并于28℃-30℃下先好氧培养3-5天再厌氧培养3-5天，获得所述复合微生态制剂的成品；
其中，步骤(2)中所用液体培养基I-IV分别为：
液体培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH7.0-7.2；
液体培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、水1000ml、PH自然；
液体培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、水1000ml、PH6.5；
液体培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然；
步骤(3)中所用发酵培养基Ⅰ的组分：桔水5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(4)中所用发酵培养基Ⅱ的组分：桔水5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(5)中所用发酵培养基Ⅲ的组分：桔水5％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水。
优选的步骤(1)中所述的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌在斜面中活化的具体操作分别为：
步骤(1)中枯草芽孢杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将枯草芽孢杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅰ上，之后于28℃-30℃厌氧钨丝灯光照培养5-7天；所述斜面培养基Ⅰ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为15min；且该斜面培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH 7.0-7.2。
步骤(1)中约氏不动杆菌在斜面中活化的具体操作为：制备斜面培养基Ⅱ，并将斜面培养基Ⅱ置于121℃下灭菌20min，之后用接种环将约氏不动杆菌接种于斜面培养基Ⅱ上，然后于25℃-28℃下好氧培养3-5天；所述斜面培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、琼脂50克、水1000ml、PH自然。
步骤(1)中乳酸杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将乳酸杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅲ上，之后于37℃下厌氧培养1-2天；所述斜面培养基Ⅲ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为20min；且该斜面培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、琼脂15克、水1000ml、PH6.5。
步骤(1)中酵母菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将酵母菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅳ上，之后于28-30℃下好氧培养3天；所述斜面培养基Ⅳ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为30min；且该斜面培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂15-20克、水1000ml、PH自然。
进一步优选方案选用纳米多孔材料作为基质将本微生态制剂制成固体制剂，优选二氧化硅。二氧化硅粒径小，比表面积大，表面吸附力强，表面能大，分散性能好，能使活菌寄居多孔结构内，减少环境对活菌的影响，并在水体中缓慢释放菌体，延长微生态制剂在水中起效的时间。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
采用所述复合微生态制剂对富营养化的水体进行净化，通过枯草芽孢杆菌的氨化、硝化、反硝化作用及约氏不动杆菌的聚磷作用，可以有效降低水体中的氨氮和亚硝酸盐浓度、磷酸盐浓度，从而降低水体中的N、P两种元素的含量，大幅减少水体的富营养化程度，达到对富营养化水体全面净化的效果。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
一种微生态制剂，通过如下步骤制备：
(1)原菌种斜面培养：将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得枯草芽孢杆菌斜面菌种、约氏不动杆菌斜面菌种、乳酸杆菌斜面菌种、及酵母菌斜面菌种，备用；
(2)原菌种液体培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅰ中，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天得枯草芽孢杆菌原菌液；将约氏不动杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅱ中，接着于27℃下好氧培养4天得约氏不动杆菌原菌液；将乳酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅲ中，接着于37℃下厌氧培养2天得乳酸杆菌原菌液；将酵母菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅳ中，之后于29℃下好氧培养3天得酵母菌原菌液；
(3)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌原菌液、约氏不动杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液、及酵母菌原菌液按枯草芽孢杆菌50％，约氏不动杆菌30％，乳酸杆菌10％，酵母菌10％的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，具体地：先接种约氏不动杆菌原菌液、酵母菌原菌液并于29℃下好氧培养3天，然后再接种枯草芽孢杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液37℃厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
(4)二级种子培养：将所得的一级种子按5％的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中，并于29℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，得复合微生态制剂的二级种子；
(5)成品培养：将所得的二级种子按5％的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ中，并于28℃-30℃下先好氧培养4天再厌氧培养3-5天，获得所述复合微生态制剂的成品；
其中：步骤(1)中枯草芽孢杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将枯草芽孢杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅰ上，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天；所述斜面培养基Ⅰ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为15min；且该斜面培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH 7.0-7.2；
步骤(1)中约氏不动杆菌在斜面中活化的具体操作为：制备斜面培养基Ⅱ，并将斜面培养基Ⅱ置于121℃下灭菌20min，之后用接种环将约氏不动杆菌接种于斜面培养基Ⅱ上，然后于27℃下好氧培养4天；所述斜面培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、琼脂50克、水1000ml、PH自然；
步骤(1)中乳酸杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将乳酸杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅲ上，之后于37℃下厌氧培养2天；所述斜面培养基Ⅲ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为20min；且该斜面培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、琼脂15克、水1000ml、PH6.5；
步骤(1)中酵母菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将酵母菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅳ上，之后于29℃下好氧培养3天；所述斜面培养基Ⅳ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为30min；且该斜面培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂18克、水1000ml、PH自然；
步骤(2)中液体培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2；
液体培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、水1000ml、PH自然；
液体培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、水1000ml、PH6.5；
液体培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然；
步骤(3)中发酵培养基Ⅰ的组分：桔水5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(4)中发酵培养基Ⅱ的组分：桔水5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(5)中发酵培养基Ⅲ的组分：桔水5％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
所述各培养基的百分比均为质量百分比。
实施例2
一种微生态制剂，通过如下步骤制备：
(1)原菌种斜面培养：将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得枯草芽孢杆菌斜面菌种、约氏不动杆菌斜面菌种、乳酸杆菌斜面菌种、及酵母菌斜面菌种，备用；
(2)原菌种液体培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅰ中，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天得枯草芽孢杆菌原菌液；将约氏不动杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅱ中，接着于27℃下好氧培养4天得约氏不动杆菌原菌液；将乳酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅲ中，接着于37℃下厌氧培养2天得乳酸杆菌原菌液；将酵母菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅳ中，之后于29℃下好氧培养3天得酵母菌原菌液；
(3)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌原菌液、约氏不动杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液、及酵母菌原菌液按枯草芽孢杆菌40％，约氏不动杆菌40％，乳酸杆菌10％，酵母菌10％的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，具体地：先接种约氏不动杆菌原菌液、酵母菌原菌液并于29℃下好氧培养3天，然后再接种枯草芽孢杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液37℃厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
(4)二级种子培养：将所得的一级种子按5％的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中，并于29℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，得复合微生态制剂的二级种子；
(5)成品培养：将所得的二级种子按5％的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ中，并于29℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，获得所述复合微生态制剂的成品；
其中：步骤(1)中枯草芽孢杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将枯草芽孢杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅰ上，之后于28℃-30℃厌氧钨丝灯光照培养6天；所述斜面培养基Ⅰ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为15min；且该斜面培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH 7.0-7.2；
步骤(1)中约氏不动杆菌在斜面中活化的具体操作为：制备斜面培养基Ⅱ，并将斜面培养基Ⅱ置于121℃下灭菌20min，之后用接种环将约氏不动杆菌接种于斜面培养基Ⅱ上，然后于27℃下好氧培养4天；所述斜面培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、琼脂50克、水1000ml、PH自然；
步骤(1)中乳酸杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将乳酸杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅲ上，之后于37℃下厌氧培养2天；所述斜面培养基Ⅲ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为20min；且该斜面培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、琼脂15克、水1000ml、PH6.5；
步骤(1)中酵母菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将酵母菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅳ上，之后于28-30℃下好氧培养3天；所述斜面培养基Ⅳ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为30min；且该斜面培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂18克、水1000ml、PH自然；
步骤(2)中液体培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2；
液体培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、水1000ml、PH自然；
液体培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、水1000ml、PH6.5；
液体培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然；
步骤(3)中发酵培养基Ⅰ的组分：桔水5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(4)中发酵培养基Ⅱ的组分：桔水5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(5)中发酵培养基Ⅲ的组分：桔水5％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
所述各培养基的百分比均为质量百分比。
实施例3
一种微生态制剂，通过如下步骤制备：
(1)原菌种斜面培养：将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得枯草芽孢杆菌斜面菌种、约氏不动杆菌斜面菌种、乳酸杆菌斜面菌种、及酵母菌斜面菌种，备用；
(2)原菌种液体培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅰ中，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天得枯草芽孢杆菌原菌液；将约氏不动杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅱ中，接着于27℃下好氧培养4天得约氏不动杆菌原菌液；将乳酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅲ中，接着于37℃下厌氧培养2天得乳酸杆菌原菌液；将酵母菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅳ中，之后于29℃下好氧培养3天得酵母菌原菌液；
(3)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌原菌液、约氏不动杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液、及酵母菌原菌液按枯草芽孢杆菌60％，约氏不动杆菌20％，乳酸杆菌10％，酵母菌10％的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，具体地：先接种约氏不动杆菌原菌液、酵母菌原菌液并于29℃下好氧培养3天，然后再接种枯草芽孢杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液37℃厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
(4)二级种子培养：将所得的一级种子按5％的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中，并于29℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，得复合微生态制剂的二级种子；
(5)成品培养：将所得的二级种子按5％的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ中，并于28℃-30℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，获得所述复合微生态制剂的成品；
其中：步骤(1)中枯草芽孢杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将枯草芽孢杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅰ上，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天；所述斜面培养基Ⅰ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为15min；且该斜面培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH 7.0-7.2；
步骤(1)中约氏不动杆菌在斜面中活化的具体操作为：制备斜面培养基Ⅱ，并将斜面培养基Ⅱ置于121℃下灭菌20min，之后用接种环将约氏不动杆菌接种于斜面培养基Ⅱ上，然后于27℃下好氧培养4天；所述斜面培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、琼脂50克、水1000ml、PH自然；
步骤(1)中乳酸杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将乳酸杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅲ上，之后于37℃下厌氧培养2天；所述斜面培养基Ⅲ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为20min；且该斜面培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、琼脂15克、水1000ml、PH6.5；
步骤(1)中酵母菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将酵母菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅳ上，之后于29℃下好氧培养3天；所述斜面培养基Ⅳ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为30min；且该斜面培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂18克、水1000ml、PH自然；
步骤(2)中液体培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2；
液体培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、水1000ml、PH自然；
液体培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、水1000ml、PH6.5；
液体培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然；
步骤(3)中发酵培养基Ⅰ的组分：桔水5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(4)中发酵培养基Ⅱ的组分：桔水5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(5)中发酵培养基Ⅲ的组分：桔水5％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
所述各培养基的百分比均为质量百分比。
实施例4
一种微生态制剂，通过如下步骤制备：
(1)原菌种斜面培养：将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得枯草芽孢杆菌斜面菌种、约氏不动杆菌斜面菌种、乳酸杆菌斜面菌种、及酵母菌斜面菌种，备用；
(2)原菌种液体培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅰ中，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天得枯草芽孢杆菌原菌液；将约氏不动杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅱ中，接着于27℃下好氧培养4天得约氏不动杆菌原菌液；将乳酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅲ中，接着于37℃下厌氧培养2天得乳酸杆菌原菌液；将酵母菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅳ中，之后于29℃下好氧培养3天得酵母菌原菌液；
(3)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌原菌液、约氏不动杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液、及酵母菌原菌液按枯草芽孢杆菌40％，约氏不动杆菌20％，乳酸杆菌20％，酵母菌20％的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，具体地：先接种约氏不动杆菌原菌液、酵母菌原菌液并于29℃下好氧培养3天，然后再接种枯草芽孢杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液37℃厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
(4)二级种子培养：将所得的一级种子按5％的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中，并于29℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，得复合微生态制剂的二级种子；
(5)成品培养：将所得的二级种子按5％的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ中，并于28℃-30℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，获得所述复合微生态制剂的成品；
其中：步骤(1)中枯草芽孢杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将枯草芽孢杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅰ上，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天；所述斜面培养基Ⅰ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为15min；且该斜面培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH 7.0-7.2；
步骤(1)中约氏不动杆菌在斜面中活化的具体操作为：制备斜面培养基Ⅱ，并将斜面培养基Ⅱ置于121℃下灭菌20min，之后用接种环将约氏不动杆菌接种于斜面培养基Ⅱ上，然后于27℃下好氧培养4天；所述斜面培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、琼脂50克、水1000ml、PH自然；
步骤(1)中乳酸杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将乳酸杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅲ上，之后于37℃下厌氧培养2天；所述斜面培养基Ⅲ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为20min；且该斜面培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、琼脂15克、水1000ml、PH6.5；
步骤(1)中酵母菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将酵母菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅳ上，之后于29℃下好氧培养3天；所述斜面培养基Ⅳ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为30min；且该斜面培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂18克、水1000ml、PH自然；
步骤(2)中液体培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2；
液体培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、水1000ml、PH自然；
液体培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、水1000ml、PH6.5；
液体培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然；
步骤(3)中发酵培养基Ⅰ的组分：桔水5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(4)中发酵培养基Ⅱ的组分：桔水5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(5)中发酵培养基Ⅲ的组分：桔水5％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
所述各培养基的百分比均为质量百分比。
实施例5
一种微生态制剂，通过如下步骤制备：
(1)原菌种斜面培养：将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得枯草芽孢杆菌斜面菌种、约氏不动杆菌斜面菌种、乳酸杆菌斜面菌种、及酵母菌斜面菌种，备用；
(2)原菌种液体培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅰ中，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天得枯草芽孢杆菌原菌液；将约氏不动杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅱ中，接着于27℃下好氧培养4天得约氏不动杆菌原菌液；将乳酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅲ中，接着于37℃下厌氧培养2天得乳酸杆菌原菌液；将酵母菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅳ中，之后于28℃-30℃下好氧培养3天得酵母菌原菌液；
(3)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌原菌液、约氏不动杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液、及酵母菌原菌液按枯草芽孢杆菌50％，约氏不动杆菌30％，乳酸杆菌10％，酵母菌10％的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，具体地：先接种约氏不动杆菌原菌液、酵母菌原菌液并于29℃下好氧培养3天，然后再接种枯草芽孢杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液37℃厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
(4)二级种子培养：将所得的一级种子按5％的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中，并于28℃-30℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，得复合微生态制剂的二级种子；
(5)成品培养：将所得的二级种子按5％的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ中，并于28℃-30℃下先好氧培养4天再厌氧培养4天，获得所述复合微生态制剂的成品；
其中：步骤(1)中枯草芽孢杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将枯草芽孢杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅰ上，之后于29℃厌氧钨丝灯光照培养6天；所述斜面培养基Ⅰ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为15min；且该斜面培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH 7.0-7.2；
步骤(1)中约氏不动杆菌在斜面中活化的具体操作为：制备斜面培养基Ⅱ，并将斜面培养基Ⅱ置于121℃下灭菌20min，之后用接种环将约氏不动杆菌接种于斜面培养基Ⅱ上，然后于25℃-28℃下好氧培养4天；所述斜面培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、琼脂50克、水1000ml、PH自然；
步骤(1)中乳酸杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将乳酸杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅲ上，之后于37℃下厌氧培养2天；所述斜面培养基Ⅲ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为20min；且该斜面培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、琼脂15克、水1000ml、PH6.5；
步骤(1)中酵母菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将酵母菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅳ上，之后于29℃下好氧培养3天；所述斜面培养基Ⅳ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为30min；且该斜面培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂18克、水1000ml、PH自然；
步骤(2)中液体培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、水1000ml、PH7.0-7.2；
液体培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、水1000ml、PH自然；
液体培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、水1000ml、PH6.5；
液体培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然；
步骤(3)中发酵培养基Ⅰ的组分：桔水5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(4)中发酵培养基Ⅱ的组分：桔水5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(5)中发酵培养基Ⅲ的组分：桔水5％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
所述各培养基的百分比均为质量百分比；
将步骤(5)中制得的复合微生态制剂成品烘干研磨过100目筛后与二氧化硅混合，制成固体微生态制剂。
将实施例5与实施例1进行对比，实施例5将复合微生态制剂成品烘干研磨过100目筛后与二氧化硅混合，制成固体微生态制剂，持续时间更久，抗环境干扰能力更强，但是起效速度降低，净化效率也有少许降低。
将各个实施例所得微生态制剂各取400ml分散于需要净化的水10L，通气培养14小时，分散于1000立方米水中，充分反应后取样。
将实施例1-4进行对比：
对比可知，枯草芽孢杆菌脱氮作用明显，约氏不动杆菌除磷效果明显，乳酸杆菌与酵母菌联用则对水体透明度有较好效果。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种微生态制剂，其特征在于，活菌原料以质量百分比计为：枯草芽孢杆菌40-60％，约氏不动杆菌20-40％，乳酸杆菌10-20％，酵母菌10-20％。
2.如权利要求1所述的微生态制剂的制备方法，包含如下步骤：
(1)原菌种斜面培养：将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌、约氏不动杆菌、乳酸杆菌、及酵母菌分别在斜面中活化，之后分别置于90mm培养皿中进行纯化，得枯草芽孢杆菌斜面菌种、约氏不动杆菌斜面菌种、乳酸杆菌斜面菌种、及酵母菌斜面菌种，备用；
(2)原菌种液体培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅰ中，之后于28℃-30℃厌氧钨丝灯光照培养5-7天得枯草芽孢杆菌原菌液；将约氏不动杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅱ中，接着于25℃-28℃下好氧培养3-5天得约氏不动杆菌原菌液；将乳酸杆菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅲ中，接着于37℃下厌氧培养1-2天得乳酸杆菌原菌液；将酵母菌斜面菌种接种于已灭菌的液体培养基Ⅳ中，之后于28℃-30℃下好氧培养3天得酵母菌原菌液；
(3)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌原菌液、约氏不动杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液、及酵母菌原菌液按枯草芽孢杆菌40-60％，约氏不动杆菌20-40％，乳酸杆菌10-20％，酵母菌10-20％的菌量比接种于已灭菌的发酵培养基Ⅰ中进行培养，具体地：先接种约氏不动杆菌原菌液、酵母菌原菌液并于28℃-30℃下好氧培养3天，然后再接种枯草芽孢杆菌原菌液、乳酸杆菌原菌液37℃厌氧培养3天，得复合微生态制剂的一级种子；
(4)二级种子培养：将所得的一级种子按5％的接种量接种于已灭菌的发酵培养基Ⅱ中，并于28℃-30℃下先好氧培养3-5天再厌氧培养3-5天，得复合微生态制剂的二级种子；
(5)成品培养：将所得的二级种子按5％的接种量接种至已灭菌的发酵培养基Ⅲ中，并于28℃-30℃下先好氧培养3-5天再厌氧培养3-5天，获得所述复合微生态制剂的成品；
其中，步骤(2)中所用液体培养基I-IV分别为：
液体培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH7.0-7.2；
液体培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、水1000ml、PH自然；
液体培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、水1000ml、PH6.5；
液体培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、水1000ml、PH自然；
步骤(3)中所用发酵培养基Ⅰ的组分：桔水5％、酵母粉0.5％、蛋白胨1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(4)中所用发酵培养基Ⅱ的组分：桔水5％、酵母粉0.1％、蛋白胨0.1％、氯化铵0.2％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水；
步骤(5)中所用发酵培养基Ⅲ的组分：桔水5％、氯化铵0.2％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸锌0.025％、硫酸亚铁0.025％，余量为水。
3.如权利要求2所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中枯草芽孢杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将枯草芽孢杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅰ上，之后于28℃-30℃厌氧钨丝灯光照培养5-7天；所述斜面培养基Ⅰ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为15min；且该斜面培养基Ⅰ的组分：酵母粉10克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、琼脂20克、水1000ml、PH 7.0-7.2。
4.如权利要求2所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中约氏不动杆菌在斜面中活化的具体操作为：制备斜面培养基Ⅱ，并将斜面培养基Ⅱ置于121℃下灭菌20min，之后用接种环将约氏不动杆菌接种于斜面培养基Ⅱ上，然后于25℃-28℃下好氧培养3-5天；所述斜面培养基Ⅱ的组分：硝酸钠1克、硫酸镁0.03克、硫酸锰0.01克、磷酸氢二钾0.8克、碳酸钠1克、过磷酸钙0.25克、琼脂50克、水1000ml、PH自然。
5.如权利要求2所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中乳酸杆菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将乳酸杆菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅲ上，之后于37℃下厌氧培养1-2天；所述斜面培养基Ⅲ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为20min；且该斜面培养基Ⅲ的组分：蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母粉5克、葡萄糖5克、乙酸钠5克、柠檬酸二胺2克、吐温801ml、磷酸氢二钾2克、硫酸镁0.58克、硫酸锰0.28克、琼脂15克、水1000ml、PH6.5。
6.如权利要求2所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中酵母菌在斜面中活化的具体操作为：用接种环将酵母菌接种于已灭菌的斜面培养基Ⅳ上，之后于28-30℃下好氧培养3天；所述斜面培养基Ⅳ的灭菌温度为121℃、灭菌时间为30min；且该斜面培养基Ⅳ的组分：马铃薯200克、蔗糖20克、琼脂15-20克、水1000ml、PH自然。
7.如权利要求2所述的微生态制剂的制备方法，其特征在于：还包括步骤(6)：将步骤(5)中制得的复合微生态制剂成品烘干，研磨过100目筛后与二氧化硅混合，制成固体微生态制剂。
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