CN110964640B - 冻干保护剂、发酵剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种冻干保护剂、发酵剂及其制备方法和应用，涉及微生物发酵技术领域，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和水，由上述原料制得的冻干保护剂能够有效减少冷冻干燥过程中冰晶对发酵菌体的损伤，同时罗望子多糖和聚葡萄糖不会引起血糖的升高，有效缓解了现有菌株保护剂容易引起的血糖升高的问题。进一步的，本申请发酵剂通过冻干保护剂的加入有效缓解现有植物乳杆菌Zhang‑LL在冷冻干燥过程中发酵菌株活力下降的问题，具有较佳的发酵性能，同时也不会引起血糖升高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种冻干保护剂、发酵剂及其制备方法和应用。
背景技术
豆乳营养丰富，富含大豆蛋白、B族维生素、大豆异黄酮等功能性营养成分，但由于其中含有的低聚糖与抗营养因子，不易被人体吸收，饮用后易引起消化不良、胃肠道胀气等问题，豆类特有的豆腥味也有相当一部分人无法接受。但豆乳在经发酵制成发酵豆乳产品后，其豆腥味会大大降低，在保留大豆自身营养物质的同时，还能够增加大豆蛋白的消化吸收率，减少因消化不良引起的胃肠道不适感，此外，在发酵过程中糖苷型的大豆异黄酮也会被转化成苷元型大豆异黄酮，提高豆乳的抗氧化活性。
然而，现有制备发酵豆乳的发酵剂一般均是由冷冻干燥制得的浓缩型发酵剂，在冷冻干燥的过程中会对发酵菌株产生不同程度的损伤，造成发酵菌株活力下降，导致凝乳时间过长。虽然，现有技术中也公开了一些采用麦芽糊精、海藻糖、可溶性淀粉等糖类或淀粉类物质作为菌株保护剂的方案，但由这些糖类和淀粉类物质作为冷冻保护剂效果较差，影响发酵活力。
因此，研究开发出一种冻干保护剂，对发酵菌株的菌体进行保护，减少冷冻干燥过程中冰晶造成的菌体损伤，降低发酵剂的水分活度，延长储存时间，同时有效缓解现有菌株保护剂容易引起的血糖升高的问题，变得十分必要和迫切。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和水，由上述原料制得的冻干保护剂能够有效减少冷冻干燥过程中冰晶对发酵菌体的损伤，同时罗望子多糖和聚葡萄糖不会引起血糖的升高，有效缓解了现有菌株保护剂容易引起的血糖升高的问题。
本发明的第二目的在于提供一种冻干保护剂的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种发酵剂，上述发酵剂主要由上述冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得，该发酵剂通过冻干保护剂的加入有效缓解现有植物乳杆菌Zhang-LL在冷冻干燥过程中发酵菌株活力下降的问题，具有较佳的发酵性能，同时也不会引起血糖升高的问题。
本发明的第四目的在于提供一种发酵剂的制备方法。
本发明的第五目的在于提供一种发酵剂的应用，该发酵剂可以广泛应用于发酵豆乳产品的制备中。
本发明提供的一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和水。
进一步的，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉10～15％、罗望子多糖0.1～0.3％、聚葡萄糖2～5％，余量为水；所述冻干保护剂中各组分的质量百分数之和为100％；
优选地，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉10～12％、罗望子多糖0.1～0.2％、聚葡萄糖2～4％，余量为水；所述冻干保护剂中各组分的质量百分数之和为100％。
本发明提供的一种上述冻干保护剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将各原料混匀，灭菌，得到冻干保护剂；
优选地，所述制备方法具体为以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，灭菌，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
所述步骤(a)和步骤(b)的顺序可调换；
优选地，步骤(a)中灭菌为高压灭菌；
优选地，步骤(b)中灭菌为过滤灭菌。
本发明提供的一种发酵剂，所述发酵剂主要由上述冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2007年1月2日，保藏编号为CGMCC NO.6936。
进一步的，所述发酵剂中植物乳酸杆菌Zhang-LL的活菌数为1.04～1.63×10- 11CFU/g，水分活度为0.024～0.047；
优选地，所述发酵剂中植物乳酸杆菌Zhang-LL的活菌数为1.63×10-11CFU/g，水分活度为0.027。
本发明提供的一种上述发酵剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增，离心浓缩后分离菌泥，随后将菌泥与上述冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到发酵剂。
进一步的，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：
胰蛋白胨8～12g、牛肉膏8～12g、酵母浸粉4～6g、柠檬酸三铵1～2.5g、葡萄糖15～25g、七水合磷酸氢二钾1～2g、无水乙酸钠2～7g、七水合硫酸镁0.2～0.7g、一水合硫酸锰0.1～0.5g、吐温80 0.5～1ml和水1000ml，pH值为6.2～6.5；
优选地，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：
胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水合磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.2～6.5。
进一步的，所述菌泥与冻干保护剂的混合体积比为1:5～10；
优选地，所述菌泥与冻干保护剂的混合体积比为1:6.63。
本发明提供的一种上述发酵剂在制备发酵豆乳产品中的应用。
进一步的，所述应用为在豆乳中加入上述发酵剂制备发酵豆乳产品；
优选地，所述发酵剂在豆乳中的加入量为1.0～1.5g/500ml；
更优选地，所述发酵剂在豆乳中的加入量为1.5g/500ml。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的冻干保护剂，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和水，其中，脱脂乳粉的作用在于可以在细胞壁表面起到保护层作用，包裹菌体，减少胞内冰晶生成；罗望子多糖的作用在于它可以增加溶液粘性，减慢水的结晶过程，弱化水的冻结作用，减少物理损伤；罗望子多糖的作用在于它可以增大液体粘度，并创造一个疏松多孔的环境，有利于再水合；水的作用是溶解保护剂，混合保护剂与菌泥。由上述原料制得的冻干保护剂能够有效减少冷冻干燥过程中冰晶对发酵菌体的损伤，真空冷冻干燥过程中，冰晶对菌体的损伤是造成菌体死亡的主要原因之一。冷冻造成细胞内水分冻结形成冰晶，冰晶会对细胞膜造成机械损伤，导致细胞膜功能丧失、胞内物质溶出。本冻干保护剂的主要作用就是保护菌体细胞膜的完整性，稳定细胞成分，减少冷冻过程中对菌体造成的损伤，同时罗望子多糖和聚葡萄糖具有调节脂类代谢、减少糖类吸收、降低胆固醇的功效，相较于现有的淀粉和糖类物质不会引起血糖的升高，有效缓解了现有菌株保护剂容易引起的血糖升高的问题。
本发明提供的冻干保护剂的制备方法，该制备方法为将各原料混匀，灭菌，得到冻干保护剂。上述制备方法具有制备工艺简单的优势。
本发明提供的发酵剂，所述发酵剂主要由上述冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2007年1月2日，保藏编号为CGMCC NO.6936。上述植物乳杆菌Zhang-LL虽然具有优良的发酵性能与降血糖降胆固醇的功能，但其抗冻性较差，直接冻干后存活率仅为2％左右。本申请发酵剂通过冻干保护剂的加入有效缓解现有植物乳杆菌Zhang-LL在冷冻干燥过程中发酵菌株活力下降的问题，具有较佳的发酵性能，同时也不会引起血糖升高的问题。
本发明提供的发酵剂的制备方法，该制备方法为将植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增并分离菌泥，随后将菌泥与上述冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到发酵剂。该制备方法具有工艺流程简单的优势。
本申请提供的发酵剂可以广泛应用于发酵豆乳产品的制备中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明效果例1提供的利用本申请实施例5制备得到的发酵剂在各类发酵豆乳发酵过程中的pH值变化图；
图2为本发明效果例2提供的利用本申请实施例5发酵剂与市售发酵剂在豆乳发酵过程中的pH值变化图；
图3为本发明效果例2提供的利用本申请实施例5发酵剂与市售发酵剂制得的发酵豆乳的感官评价图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种冻干保护剂，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和水。
本发明提供的冻干保护剂，所述冻干保护剂包括脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和水，其中，脱脂乳粉的作用在于可以在细胞壁表面起到保护层作用，包裹菌体，减少胞内冰晶生成；罗望子多糖的作用在于它可以增加溶液粘性，减慢水的结晶过程，弱化水的冻结作用，减少物理损伤；罗望子多糖的作用在于它可以增大液体粘度，并创造一个疏松多孔的环境，有利于再水合；水的作用是溶解保护剂，混合保护剂与菌泥。由上述原料制得的冻干保护剂能够有效减少冷冻干燥过程中冰晶对发酵菌体的损伤，真空冷冻干燥过程中，冰晶对菌体的损伤是造成菌体死亡的主要原因之一。冷冻造成细胞内水分冻结形成冰晶，冰晶会对细胞膜造成机械损伤，导致细胞膜功能丧失、胞内物质溶出。本冻干保护剂的主要作用就是保护菌体细胞膜的完整性，稳定细胞成分，减少冷冻过程中对菌体造成的损伤，同时罗望子多糖和聚葡萄糖具有调节脂类代谢、减少糖类吸收、降低胆固醇的功效，相较于现有的淀粉和糖类物质不会引起血糖的升高，有效缓解了现有菌株保护剂容易引起的血糖升高的问题。
在本发明的一种优选实施方式中，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉10～15％、罗望子多糖0.1～0.3％、聚葡萄糖2～5％，余量为水；所述冻干保护剂中各组分的质量百分数之和为100％；
作为一种优选的实施方式，聚葡萄糖和罗望子多糖不同的添加比例会对冻干保护剂的保护效果和水分活度产生影响，上述原料的质量百分比可以在保持较低水分活度的情况下保证较高的存活率。优选方案添加量脱脂乳粉10％、罗望子多糖0.2％、聚葡萄糖2.5％，余量为水。
上述脱脂乳粉典型但非限制性的优选实施方案为：10％、11％、12％、13％、10％和15％；上述罗望子多糖典型但非限制性的优选实施方案为：0.1％、0.1％、和0.3％；上述聚葡萄糖典型但非限制性的优选实施方案为：2％、3％、4％和5％。
所述“余量为水”的含义为，在各组分的质量百分数之和为100％的情况下，除去脱脂乳粉、罗望子多糖、聚葡萄糖和任选组分的量外，冻干保护剂中其余的量为水。
优选地，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉12～14％、罗望子多糖0.1～0.2％、聚葡萄糖2～4％，余量为水；所述冻干保护剂中各组分的质量百分数之和为100％。
更优选地，按质量份数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉13％、罗望子多糖0.2％、聚葡萄糖3％和水83.8％。
本发明中，通过对各组分原料用量比例的进一步调整和优化，从而进一步优化了本发明冻干保护剂减少冷冻干燥过程中冰晶对发酵菌体的损伤以及调节脂类代谢、减少糖类吸收、降低胆固醇的功效。
根据本发明的一个方面，一种上述冻干保护剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将各原料混匀，灭菌，得到冻干保护剂；
本发明提供的冻干保护剂的制备方法，该制备方法为将各原料混匀，灭菌，得到冻干保护剂。上述制备方法具有制备工艺简单的优势。
在本发明的一种优选实施方式中，所述制备方法具体为以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，灭菌，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
所述步骤(a)和步骤(b)的顺序可调换；
在上述优选实施方式中，步骤(a)中灭菌为高压灭菌，采用高温灭菌可能杀灭原料中的其他微生物，防止污染发酵剂。
在上述优选实施方式中，步骤(b)中灭菌为过滤灭菌，过滤灭菌可以在不升温的条件下达到灭菌效果。采用高温灭菌可能会引起聚葡萄糖分解，与脱脂乳粉一同灭菌会发生美拉德反应，产生褐变，影响保护效果。
根据本发明的一个方面，一种发酵剂，所述发酵剂主要由上述冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2007年1月2日，保藏编号为CGMCC NO.6936。
优选地，所述冻干保护剂的含量在97.87％左右。其中脱脂乳粉占比77.67％，聚葡萄糖占比19.42％，罗望子多糖占比0.78％。
本发明提供的发酵剂，所述发酵剂主要由上述冻干保护剂和植物乳酸杆菌Bacillus substilis Zhang-LL制得，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心保藏(简称CGMCC)，保藏日期为2007年1月2日，保藏编号为CGMCC NO.6936。上述植物乳杆菌Zhang-LL虽然具有优良的发酵性能与降血糖降胆固醇的功能，但其抗冻性较差，直接冻干后存活率仅为2％左右。本申请发酵剂通过冻干保护剂的加入有效缓解现有植物乳杆菌Zhang-LL在冷冻干燥过程中发酵菌株活力下降的问题，具有较佳的发酵性能，同时也不会引起血糖升高的问题。
在本发明的一种优选实施方式中，所述发酵剂中植物乳酸杆菌Zhang-LL的活菌数为1.43～1.83×10-11CFU/g，水分活度为0.026～0.047；
优选地，所述发酵剂中植物乳酸杆菌Zhang-LL的活菌数为1.63×10-11CFU/g，水分活度为0.027。
根据本发明的一个方面，一种上述发酵剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
将植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增并分离菌泥，随后将菌泥与上述冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到发酵剂。
本发明提供的发酵剂的制备方法，该制备方法为将植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增并分离菌泥，随后将菌泥与上述冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到发酵剂。该制备方法具有工艺流程简单的优势。
在本发明的一种优选实施方式中，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：
胰蛋白胨8～12g、牛肉膏8～12g、酵母浸粉4～6g、柠檬酸三铵1～2.5g、葡萄糖15～25g、七水合磷酸氢二钾1～2g、无水乙酸钠2～7g、七水合硫酸镁0.2～0.7g、一水合硫酸锰0.1～0.5g、吐温80 0.5～1ml和水1000ml，pH值为6.2～6.5；
作为一种优选的实施方式，上述植物乳酸杆菌经过12h，37℃恒温培养后，活菌数可达到(2.8～4.6)x109CFU/ml。再经过后面浓缩的步骤后，菌泥中的活菌数可达到(1.4～2.3)x1011CFU/ml。
优选地，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：
胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水合磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.0～6.2。
本发明中，通过对各组分原料用量比例的进一步调整和优化，从而进一步优化了本发明植物乳酸杆菌活化扩增培养基的技术效果。
在本发明的一种优选实施方式中，将原菌液进行5～10倍的浓缩收集菌泥，随后将菌泥与冻干保护剂以1:5～10的混合体积比混合。
优选地，所述菌泥与冻干保护剂的混合体积比为1:6。在混合体积比为1:6时，混合液中的活菌数在1010CFU以上，经过冷冻干燥后，每克冻干发酵剂中的活菌数可达到1011CFU。
根据本发明的一个方面，一种上述发酵剂在制备发酵豆乳产品中的应用。
本申请提供的发酵剂可以广泛应用于发酵豆乳产品的制备中。
在本发明的一种优选实施方式中，所述应用为在豆乳中加入上述发酵剂制备发酵豆乳产品；
在上述优选实施方式中，所述发酵剂在豆乳中的加入量为1.0～1.5g/500ml；
作为一种优选的实施方式，上述发酵剂在豆乳中的加入量为1.5g/500ml时可使市售豆乳与豆浆粉在4～6h完全凝乳，略优于市售发酵剂。
优选地，所述发酵剂在豆乳中的加入量为1.5g/500ml。
下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
一种发酵剂，所述发酵剂主要由冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述发酵剂的制备方法包括：
(1)、制备冻干保护剂：
所述冻干保护剂，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉10％、罗望子多糖0.1％、聚葡萄糖2％，水87.9％；
所述制备方法包括以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，115℃，高压蒸汽灭菌7min，待温度降至80℃以下后迅速取出，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，0.22μm滤膜过滤灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
(2)、菌种活化：
将于甘油冻存管中的植物乳杆菌Zhang-LL按照3％的接种量接种于植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养12h，按此方式再次传代1次，得到Zhang-LL种子液。
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：胰蛋白胨12g、牛肉膏12g、酵母浸粉6g、柠檬酸三铵2.5g、葡萄糖25g、七水合磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠7g、七水合硫酸镁0.7g、一水合硫酸锰0.5g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.5。
(3)、扩大培养：
将上述种子液按照2％的接种量接种于上述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养12h，得到扩培菌液。
(4)、制备菌泥：
将扩培后的菌液分装于离心管中，6000r/min离心5min，弃上清，收集菌泥沉淀。
(5)、冷冻干燥：
将步骤(4)制得的菌泥沉淀与步骤(1)制得的冻干保护剂按1：5的体积比复配，震荡60s以上，充分混匀。
将上述浓缩菌液于-80℃预冻2h至完全冻结，将完全冻结的浓缩菌液于冻干温度-51℃，真空度0.200mbr条件下冻干48h至完全干燥状态，得到发酵剂。
实施例2
一种发酵剂，所述发酵剂主要由冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述发酵剂的制备方法包括：
(1)、制备冻干保护剂：
所述冻干保护剂，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉15％、罗望子多糖0.3％、聚葡萄糖5％，水79.7％；
所述制备方法包括以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，115℃，高压蒸汽灭菌15min，待温度降至80℃以下后迅速取出，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，0.22μm滤膜过滤灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
(2)、菌种活化：
将于甘油冻存管中的植物乳杆菌Zhang-LL按照5％的接种量接种于植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养14h，按此方式再次传代2次，得到Zhang-LL种子液。
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：胰蛋白胨8g、牛肉膏8g、酵母浸粉4g、柠檬酸三铵1g、葡萄糖15g、七水合磷酸氢二钾1g、无水乙酸钠2g、七水合硫酸镁0.2g、一水合硫酸锰0.2g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.2。
(3)、扩大培养：
将上述种子液按照4％的接种量接种于上述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养14h，得到扩培菌液。
(4)、制备菌泥：
将扩培后的菌液分装于离心管中，8000r/min离心10min，弃上清，收集菌泥沉淀。
(5)、冷冻干燥：
将步骤(4)制得的菌泥沉淀与步骤(1)制得的冻干保护剂按1：10的体积比复配，震荡60s以上，充分混匀。
将上述浓缩菌液于-80℃预冻6h至完全冻结，将完全冻结的浓缩菌液于冻干温度-51℃，真空度0.200mbr条件下冻干60h至完全干燥状态，得到发酵剂。
实施例3
一种发酵剂，所述发酵剂主要由冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述发酵剂的制备方法包括：
(1)、制备冻干保护剂：
所述冻干保护剂，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉11％、罗望子多糖0.2％、聚葡萄糖3％，水85.8％；
所述制备方法包括以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，115℃，高压蒸汽灭菌8min，待温度降至80℃以下后迅速取出，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，0.22μm滤膜过滤灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
(2)、菌种活化：
将于甘油冻存管中的植物乳杆菌Zhang-LL按照3％的接种量接种于植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养13h，按此方式再次传代1次，得到Zhang-LL种子液。
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水合磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.0。
(3)、扩大培养：
将上述种子液按照2％的接种量接种于上述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养12h，得到扩培菌液。
(4)、制备菌泥：
将扩培后的菌液分装于离心管中，7000r/min离心60min，弃上清，收集菌泥沉淀。
(5)、冷冻干燥：
将步骤(4)制得的菌泥沉淀与步骤(1)制得的冻干保护剂按1：6的体积比复配，震荡60s以上，充分混匀。
将上述浓缩菌液于-80℃预冻3h至完全冻结，将完全冻结的浓缩菌液于冻干温度-51℃，真空度0.200mbr条件下冻干50h至完全干燥状态，得到发酵剂。
实施例4
一种发酵剂，所述发酵剂主要由冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述发酵剂的制备方法包括：
(1)、制备冻干保护剂：
所述冻干保护剂，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉14％、罗望子多糖0.3％、聚葡萄糖4％，水81.7％；
所述制备方法包括以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，115℃，高压蒸汽灭菌12min，待温度降至80℃以下后迅速取出，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，0.22μm滤膜过滤灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
(2)、菌种活化：
将于甘油冻存管中的植物乳杆菌Zhang-LL按照5％的接种量接种于植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养14h，按此方式再次传代2次，得到Zhang-LL种子液。
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水合磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.0～6.2。
(3)、扩大培养：
将上述种子液按照4％的接种量接种于上述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养14h，得到扩培菌液。
(4)、制备菌泥：
将扩培后的菌液分装于离心管中，8000r/min离心8min，弃上清，收集菌泥沉淀。
(5)、冷冻干燥：
将步骤(4)制得的菌泥沉淀与步骤(1)制得的冻干保护剂按1：9的体积比复配，震荡60s以上，充分混匀。
将上述浓缩菌液于-80℃预冻5h至完全冻结，将完全冻结的浓缩菌液于冻干温度-51℃，真空度0.200mbr条件下冻干58h至完全干燥状态，得到发酵剂。
实施例5
一种发酵剂，所述发酵剂主要由冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述发酵剂的制备方法包括：
(1)、制备冻干保护剂：
所述冻干保护剂，按质量百分数计，所述冻干保护剂包括以下组分：脱脂乳粉13％、罗望子多糖0.2％、聚葡萄糖3％，水83.8％；
所述制备方法包括以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，115℃，高压蒸汽灭菌12min，待温度降至80℃以下后迅速取出，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，0.22μm滤膜过滤灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
(2)、菌种活化：
将于甘油冻存管中的植物乳杆菌Zhang-LL按照4％的接种量接种于植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养13h，按此方式再次传代2次，得到Zhang-LL种子液。
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水合磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.0～6.2。
(3)、扩大培养：
将上述种子液按照3％的接种量接种于上述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基中，37℃培养13h，得到扩培菌液。
(4)、制备菌泥：
将扩培后的菌液分装于离心管中，7000r/min离心8min，弃上清，收集菌泥沉淀。
(5)、冷冻干燥：
将步骤(4)制得的菌泥沉淀与步骤(1)制得的冻干保护剂按1：7的体积比复配，震荡60s以上，充分混匀。
将上述浓缩菌液于-80℃预冻4h至完全冻结，将完全冻结的浓缩菌液于冻干温度-51℃，真空度0.200mbr条件下冻干52h至完全干燥状态，得到发酵剂。
实施例6
本实施例除冻干保护剂，按质量百分数计，包括以下组分：脱脂乳粉13％、罗望子多糖0.2％、聚葡萄糖3％、β-环状糊精3％，水80.8％外，其余同实施例5。
实施例7
本实施例除冻干保护剂除冻干保护为脱脂乳粉12％、罗望子多糖0.1％、聚葡萄糖2.5％外还可以添加D-异抗坏血酸钠0.4％或低聚半乳糖5％，其余同实施例5。
实施例8
本实施例除冻干保护剂的制备方法中冻干温度为-49℃，真空度为0.040mbr条件下冻干60h至完全干燥状态外，其余同实施例5。
对比例1
本对比例除发酵菌株为保加利亚乳杆菌外，其余同实施例5。
对比例2
本对比例除冻干保护剂为麦芽糊精外，其余同实施例5。
效果例1
为表明本申请发酵剂具有较佳的发酵性能，现将实施例5制得的发酵剂用于豆乳的发酵，具体的发酵实验分三组进行，具体如下：
第一组：取500ml市售无糖豆乳，115℃灭菌15min后加入1.0～1.5g浓缩型豆乳发酵剂，观察凝乳状况，待发酵豆乳完全凝固且无乳清析出，记录凝乳时间，经过12h冷藏后，并按照具体实施方式中所述方法测定发酵豆乳的ph、滴定酸度、活菌数与持水力。
第二组：取500ml市售含糖调制豆乳(含糖量5％-7％)，115℃灭菌15min后加入1.0～1.5g浓缩型豆乳发酵剂，观察凝乳状况，待发酵豆乳完全凝固且无乳清析出，记录凝乳时间，经12h冷藏后，测定发酵豆乳的ph、滴定酸度、活菌数与持水力。
第三组：取75g市售豆浆粉(含糖)加入540ml蒸馏水，115℃灭菌15min后加入1.3～1.8g浓缩型豆乳发酵剂，观察凝乳状况，待发酵豆乳完全凝固且无乳清析出，记录凝乳时间，经12h冷藏后熟，测定发酵豆乳的ph、滴定酸度、活菌数与持水力。
所述具体检测方法如下：
(1)、所述发酵乳通过如下方法测定pH：取250ml豆乳灭菌后加入发酵剂使其发酵，每隔两小时充分摇匀后，取10ml样品，每个样品各取三次，采用pH计测定其pH。
(2)、所述发酵乳通过如下方式测定活菌数：取25g凝固的发酵豆乳，放入含225ml无菌生理盐水的均质袋中，以8000～10000r/min的速度拍打1min，制成10-1稀释液。取1ml稀释液加入含有9ml生理盐水的试管中，震荡30s以上，充分混匀，得到10-2稀释液。以此方式梯度稀释至10-8，取10-6～10-8梯度的稀释液各1ml置于培养皿中，倒入冷却至45-50℃的改良MRS固体培养基(市售发酵剂采用M17固体培养基培养)，轻轻晃动混匀，待其凝固后置于37℃恒温箱中培养24～48h，每个梯度取三次平行。
(3)、所述发酵乳通过如下方式测定滴定酸度：取10g凝固的发酵豆乳于150ml锥形瓶中，加入20ml灭菌后冷却至室温的蒸馏水，滴入3～5滴酚酞指示剂，混匀后用0.1mol/L氢氧化钠标准液滴定，边滴加边转动三角瓶，至溶液变色且30s内不褪色，记录消耗氢氧化钠的体积V。以相同体积灭菌蒸馏水，按上述步骤滴定，消耗氢氧化钠体积记为V0。
按如下公式计算样品酸度：X＝(V-V0)x20。
(4)、所述发酵乳通过如下方式测定持水力：称取一定质量的发酵豆乳于离心管中(离心管质量记为W0)，总质量记为W1，3000r/min离心20min后，静置10min后除去上清液，测定残余质量记为W2。
豆乳持水力按如下公式计算：
具体实验结果如表1、2所示：
表1：本效果例中发酵豆乳的凝固时间：
注：上表中“—”为未凝乳，“+”为出现凝乳现象，“++”为完全凝乳。
如上表凝乳时间可知，本发酵剂在豆乳中的凝乳时间在4h左右，由于豆浆粉蛋白含量较低，相比于市售豆乳需要的凝乳时间更久。
表2：本效果例中发酵豆乳的滴定酸度、活菌数与持水力：
如上表滴定酸度、活菌数与持水力可知，发酵豆乳的活菌数高于国标中对益生菌活菌数要达到1x106CFU/g(ml)的要求。滴定酸度反应菌株在不同类型原料中的产酸能力，由上表可知，适当添加糖类有助于乳杆菌发酵产酸，可以提高发酵豆乳的酸度。持水力反映了豆乳中蛋白凝胶网络对水的保持能力，持水力越低，则越易发生乳清析出，原料乳中蛋白含量越高，持水力越好，越不易有乳清析出的现象。
图1为本申请实施例5制备得到的发酵剂在各类发酵豆乳发酵过程中的pH值变化图。由图1可知，发酵豆乳在发酵过程中的pH值的变化可知，pH变化是由于乳酸菌产生乳酸造成的，它反映出发酵剂在发酵过程中菌株的产酸能力及发酵速度，由上图可看到，其中第一组发酵过程中pH下降最快，由于其中添加有的糖类可作为益生菌生长的碳源，加快乳酸菌繁殖速度。当pH下降到5.2左右时开始形成凝乳，第一组与第二组pH值均在第4h时降至凝乳pH以下，第三组豆浆粉由于低聚糖类和蛋白含量较低，所以乳酸菌生长较慢，pH下降也最为缓慢，直到第6h才形成凝乳。三组发酵豆乳的pH均在前6小时快速下降，随后趋于平缓，完成发酵过程。三组实验的实验结果也从侧面反映出，本发酵剂适合发酵各类豆乳产品。
效果例2
为表明本申请发酵剂具有较佳的发酵性能，现将实施例5制得的发酵剂用于豆乳的发酵，并用三种市售发酵剂作为对照，其中：
一号发酵剂为安琪酵母公司生产由嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌组成，是目前市面上最见的发酵剂；
二号发酵剂为川秀公司生产由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌5种不同益生菌组成；
三号发酵剂为仙客峰公司生产由保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌11种不同益生菌组成。
具体的对比实验分三部分进行，具体如下：
测定不同发酵剂的发酵性能：取2000ml市售含糖调制豆乳(含糖量5％左右)，115℃灭菌15min后分四组分装，每组500ml，分别按照标量加入发酵剂，观察凝乳状况，待发酵豆乳完全凝固且无乳清析出后，记录凝乳时间，待所有发酵豆乳均凝固后，测定发酵豆乳的pH、滴定酸度、活菌数与持水力。
测定不同发酵剂的后酸化能力：将剩余豆乳放于37℃储藏，每隔12h取出一次测定其pH与滴定酸度。
感官评价：选择从事食品及相关专业的人员7人进行感官评定，分别从外观、口感和滋味、气味4个方面进行评定，共有8项标准，每项标准满分10分。评分标准见表3。
表3：感官评价评分表
具体结果如表4所示:
表4：本效果例中不同发酵剂发酵豆乳的pH、滴定酸度、活菌数与持水力：
由上表可知，与三种市售发酵剂相比，本申请发酵剂凝乳时间最短，发酵速度最快。在相同的发酵时间内，本发酵剂发酵的豆乳pH最低，滴定酸度最高，证明本发酵剂具有良好的产酸能力。三组发酵剂发酵的豆乳在凝乳后检测的持水力均在40％-50％之间，没有较大差异，证明本发酵剂发酵出的豆乳在外观品质上与市售发酵剂相比无明显差异。综合来看，本发酵剂能够达到与市售发酵剂相同的发酵效果，且具有发酵时间更短、发酵豆乳中的活菌数更高的优势。
图2为本申请实施例5发酵剂与市售发酵剂在豆乳发酵过程中的pH值变化图。由图2可知，不同发酵剂在豆乳发酵过程中的pH值的变化，反应出不同发酵剂的产酸能力。由图可以看出，在四种发酵剂中，本申请发酵剂pH下降最迅速，且在结束发酵时pH值最低。与其他三种发酵剂相比，本发酵剂产酸速度最快，产酸性能最好。
表5：完成发酵后于37℃储藏时豆乳ph的变化：
表6：完成发酵后于37℃储藏时豆乳滴定酸度的变化：
发酵豆乳在形成凝乳结束发酵后，其中的活性益生菌会继续产酸，使豆乳酸度下降，这个过程称为后酸化。由表5、表6可知在结束发酵后储藏过程中，四种发酵剂的pH都明显下降，滴定酸度明显上升，其中3号市售发酵剂变化幅度最明显。后酸化作用会导致豆乳在储藏运输过程中继续产酸，引起豆乳在感官与口味方面的变化。在四组发酵剂中1号市售发酵剂与2号市售发酵剂后酸化能力最弱，3号市售发酵剂后酸化能力最好，本发酵处于中间水平，说明本发酵剂发酵的豆乳具有较好的稳定性，适合工业生产。
图3为本申请实施例5发酵剂与市售发酵剂制得的发酵豆乳的感官评价图。由上图可知，本发酵剂在组织状态、色泽、粘稠度等方面的感官特性与三组市售发酵剂相比有较大差别。本发酵剂在组织状态与色泽上评分较其他三组发酵剂发酵的豆乳更高，其中酸度、光滑感、风味上与其他三组发酵豆乳没有明显差别，但本发酵剂发酵出的豆乳在黏度上略低于其他三组。相比之下，本发酵剂发酵的豆乳口感更偏于清爽，色泽均匀且凝乳结实，乳清析出较少。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (12)
1.一种发酵剂，其特征在于，所述发酵剂主要由冻干保护剂和植物乳酸杆菌Zhang-LL制得；
所述植物乳酸杆菌Zhang-LL，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2007年1月2日，保藏编号为CGMCC NO.6936；
所述的冻干保护剂，按质量百分数计，包括以下组分：脱脂乳粉10～12％、罗望子多糖0.1～0.2％、聚葡萄糖2～4％，余量为水；所述冻干保护剂中各组分的质量百分数之和为100％；
所述冻干保护剂的制备方法包括以下步骤：
(a)、将脱脂乳粉和罗望子多糖溶解于部分水中，高压灭菌，得到混合溶液A；
(b)、将聚葡萄糖溶解于剩余的水中，过滤灭菌，得到聚葡萄糖溶液；
(c)、在无菌条件下，将混合溶液A与聚葡萄糖溶液混匀，得到冻干保护剂；
所述步骤(a)和步骤(b)的顺序可调换。
2.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂中植物乳酸杆菌Zhang-LL的活菌数为1.04～1.63×10-11CFU/g，水分活度为0.024～0.047。
3.根据权利要求2所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂中植物乳酸杆菌Zhang-LL的活菌数为1.63×10-11CFU/g，水分活度为0.027。
4.一种根据权利要求1～3任一项所述的发酵剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增，离心浓缩后分离菌泥，随后将菌泥与冻干保护剂混匀，冷冻干燥，得到发酵剂。
5.根据权利要求4所述发酵剂的制备方法，其特征在于，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：
胰蛋白胨8～12g、牛肉膏8～12g、酵母浸粉4～6g、柠檬酸三铵1～2.5g、葡萄糖15～25g、七水合磷酸氢二钾1～2g、无水乙酸钠2～7g、七水合硫酸镁0.2～0.7g、一水合硫酸锰0.1～0.5g、吐温80 0.5～1ml和水1000ml，pH值为6.2～6.5。
6.根据权利要求4所述发酵剂的制备方法，其特征在于，所述植物乳酸杆菌Zhang-LL活化扩增的培养基，主要由以下组分组成：
胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水合磷酸氢二钾2g、无水乙酸钠5g、七水合硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g、吐温80 1ml和水1000ml，pH值为6.2～6.5。
7.根据权利要求4所述发酵剂的制备方法，其特征在于，所述菌泥与冻干保护剂的混合体积比为1:5～10。
8.根据权利要求4所述发酵剂的制备方法，其特征在于，所述菌泥与冻干保护剂的混合体积比为1:6.63。
9.一种根据权利要求1～3任一项所述的发酵剂在制备发酵豆乳产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为在豆乳中加入权利要求1～3任一项所述的发酵剂制备发酵豆乳产品。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述发酵剂在豆乳中的加入量为1.0～1.5g/500ml。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述发酵剂在豆乳中的加入量为1.5g/500ml。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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