CN103205371B

CN103205371B - 脱氮微生物菌剂及其制备方法和固定化颗粒及其应用

Info

Publication number: CN103205371B
Application number: CN201210008762.7A
Authority: CN
Inventors: 朱昌雄; 肖晶晶; 郭萍; 田云龙; 俞晓芸; 龚明波; 刘雪; 叶婧; 李峰
Original assignee: Kaichuang Sun Environmental Science And Technology Development Beijing Co ltd; Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Current assignee: Kaichuang Sun Environmental Science And Technology Development Beijing Co ltd; Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculturem of CAAS
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2032-01-12
Also published as: CN103205371A

Abstract

本发明公开了一种脱氮微生物菌剂及其制备方法，还涉及一种固定化颗粒和它们在脱氮中的应用。所述脱氮微生物菌剂含有培养基和菌体，所述菌体含有：ACCC 05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC 05729门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，并且，每毫升所述微生物菌剂所含的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个。本发明提供的脱氮微生物菌剂及含有微生物的固定化颗粒能够有效地将水体中的氮元素含量降低到符合环保要求的水平。

Description

脱氮微生物菌剂及其制备方法和固定化颗粒及其应用

技术领域

本发明涉及一种脱氮微生物菌剂及其制备方法，还涉及一种固定化颗粒和它们在脱氮中的应用。

背景技术

水是自然界的基本要素，是有生命的物质得以生存和繁衍的基本物质条件之一。目前，全球水环境面临着淡水资源缺乏、水体污染、洪涝灾害等问题，其中水体污染问题尤为突出。当进入水体的污染物在数量上超过了该物质在水体中的本体含量和水体的环境容量，即为水体污染。水体污染最初主要是自然因素造成的，如地面水渗漏和地下水流动将地层中某些矿物质溶解，使水中的盐分、微量元素或放射性物质浓度偏高而使水质恶化。

而当前，随着工业、农业和交通运输业的发展及人口的增加，水体污染主要是人类的生产和生活活动造成的。在人类高强度的干预影响下，氮、磷等进入湖泊、河口、海湾等环流水体中，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体溶解氧量下降、水质恶化、鱼类及其他生物大量死亡。在自然条件下，水体需经过非常缓慢的自然过程才能从贫营养状态过渡到富营养状态，而人为排放的营养物质所引起的水体富营养化则可以在短时间内出现。

近几十年来，我国湖泊、水库和江河富营养化的发展趋势非常迅速，富营养化问题十分严峻。我国的几大湖泊、水库、大江和河流的水质均不同程度的受到威胁。我国水体富营养化问题早已被环保部门及其他相关部门重视，从地方到中央投入较多的人力物力进行污染的治理，但多年来治理成效并不十分理想。

国外水体也曾发生过富营养化或有出现富营养化的趋势。世界范围内，各国都有许多整治水体的实例，但效果甚微。实践也证明了富营养化的逆转是相当困难的，对这种现象可谓是全球慢性灾害。今天我们遇到的水体富营养化问题，实际上是地球水环境在一个漫长的时间内量变的结果，因此我们也需认清对于富营养化的治理与修复也应是一场持久战。

在富营养化的过程中，氮和磷则是藻类生长的限制因素，一般认为水体中氮浓度超过0.2-0.3mg/L，磷浓度超过0.01-0.02mg/L就足以引起藻类的急剧繁殖，从而导致水体富营养化。引起水体污染的中的氮元素主要以氨态氮(如铵离子或氨)、亚硝酸盐态氮(如NO₂ ^-)和硝酸盐氮(如NO₃ ^-)等形式存在。

因此，将水体中的氮元素含量降低到符合环保要求的水平已经成为迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服日益严重的水体富营养化问题，提供一种能够有效地将水体中的氮元素含量降低到符合环保要求的水平的脱氮微生物菌剂和固定化颗粒及其制备方法和它们的应用。

本发明提供了一种脱氮微生物菌剂，其中，该脱氮微生物菌剂含有培养基和菌体，所述菌体含有ACCC 05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)，并且，每毫升所述微生物菌剂所含的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。

本发明还提供了所述的脱氮微生物菌剂的制备方法，其中，该方法包括将ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌接种于培养基中进行培养，使得到的每毫升微生物菌剂的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。

本发明还提供了一种含有微生物的固定化颗粒，其中，该固定化颗粒由含有菌体、包埋剂和无机载体的组合物在交联剂存在下固定化后分离得到，其中，所述菌体含有ACCC 05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)，并且，每毫升所述固定化颗粒所含的总活菌数为0.4×10¹⁰到3.2×10¹⁰个，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。

本发明中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是指从中国农业微生物菌种保藏中心商购得到的牌号为ACCC 05728的市售品；ACCC05729门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)是指从中国农业微生物菌种保藏中心商购得到的牌号为ACCC 05729的市售品；ACCC 05730枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是指从是指从中国农业微生物菌种保藏中心商购得到的牌号为ACCC 05730的市售品；ACCC 05731类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)是指从中国农业微生物菌种保藏中心商购得到的牌号为ACCC 05731的市售品。

此外，还提供了本发明的微生物菌剂或固定化颗粒在脱氮中的应用。

本发明提供的脱氮微生物菌剂及含有微生物的固定化颗粒能够有效地将水体中的氮元素含量降低到符合环保要求的水平，为控制水体污染提供了新的途径。

具体实施方式

本发明提供了一种脱氮微生物菌剂，该脱氮微生物菌剂含有培养基和菌体，其中，所述菌体含有：ACCC 05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)，并且，每毫升所述微生物菌剂所含的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个，其中，所述枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％；优选地，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％。

根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌，例如，可以为PDA培养基。

根据本发明，用于培养ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌的PDA培养基组成为本领域技术人员所公知，例如，所述PDA培养基为将200重量份的去皮土豆、20重量份的葡萄糖和1000重量份水混合后调整pH值为7.0后得到。

本发明还提供了所述脱氮微生物菌剂的制备方法，其中，该方法包括将ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌接种于培养基中进行培养，使得到的每毫升微生物菌剂的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。

本发明中，所述将ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌接种于培养基中进行培养的方法可以在很大范围内改变，例如，该方法包括：在各自独立的培养体系中分别培养ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌；并将分别培养得到的ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。

优选地，所述混合的比例使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％。

根据本发明，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的PDA培养基中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌的菌株，30℃发酵培养，直至ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为0.1×10¹⁰到2×10¹⁰个/mL的培养基。

根据本发明，所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的PDA培养基中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌的菌株，30℃发酵培养，直至ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为0.1×10¹⁰到2×10¹⁰个/mL的培养基。

根据本发明，所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的PDA培养基中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌的菌株，30℃发酵培养，直至ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为0.1×10¹⁰到2×10¹⁰个/mL的培养基。

根据本发明，所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的培养方法为本领域技术人员所公知，例如，在100重量份的PDA培养基中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌的菌株，30℃发酵培养，直至ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为0.1×10¹⁰到2×10¹⁰个/mL的培养基。

根据本发明，所述混合的条件没有特别的限制，只要能够使得到的微生物菌剂满足以下条件即可：使得到的微生物菌剂的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个/mL的微生物菌剂，其中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。优选地，所述混合使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％。

本发明还提供了一种含有微生物的固定化颗粒，其中，该固定化颗粒由含有菌体、包埋剂和无机载体的组合物在交联剂存在下固定化后分离得到，其中，所述菌体含有ACCC 05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)，并且，每毫升所述固定化颗粒所含的总活菌数为0.4×10¹⁰到3.2×10¹⁰个，其中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。优选地，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％。

本发明中，未做相反说明的情况下，各种物料的体积均为室温下的体积数值；其中，所述固定化颗粒的体积是指其自然堆积体积。

根据本发明，所述含有菌体、包埋剂和无机载体的组合物中，所述包埋剂和无机载体的含量可以在很大范围内改变，只要能使每毫升所述固定化颗粒所含的总活菌数为0.4×10¹⁰到3.2×10¹⁰个即可，优选地，所述含有菌体、包埋剂和无机载体的组合物中，相对于总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，所述包埋剂的含量为20-500克，更优选为50-200克，所述无机载体的含量为3-100克，更优选为10-30克；相对于所述组合物中的总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，以溶质的量计，所述交联剂的用量为50-1000克，更优选为120-400克。

根据本发明，所述培养基可以为PDA培养基，所述包埋剂可以为聚乙烯醇和/或海藻酸钠，所述无机载体可以为活性炭，所述交联剂可以为含氯化钙的硼酸溶液。其中，未做相反说明的情况下，交联剂的用量以溶质的量计算。

本发明中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)、ACCC 05730枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和ACCC 05731类产碱假单胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)可以通过商购得到，例如，从中国农业微生物菌种保藏中心商购得到。

本发明还提供了所述固定化颗粒的制备方法，其中，该方法包括：在各自独立的培养体系中分别培养ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌；并将分别培养得到的ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌按照比例进行混合，之后依次加入无机载体、包埋剂和交联剂，混合均匀并造粒。

所述包埋剂和无机载体的用量可以在很大范围内改变，只要能使每毫升所述固定化颗粒所含的总活菌数为0.4×10¹⁰到3.2×10¹⁰个即可，但优选地，所述组合物中，相对于总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，所述包埋剂的含量为20-500克，所述无机载体的含量为3-100克；更优选地，所述组合物中，相对于总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，所述包埋剂的含量为50-200克，所述无机载体的含量为10-30克。其中，相对于所述组合物中的总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，以溶质的量计，所述交联剂的含量为50-1000克，优选为120-400克。

ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC 05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌的混合比例使，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45％。优选地，混合比例使以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％。

所述包埋剂、无机载体和交联剂的种类如上文所述，在此不再赘述。

下面通过具体的实施例对本发明进行更加详细的说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。

(1)在100重量份的PDA培养基(将200重量份的去皮土豆、20重量份的葡萄糖和1000重量份水混合后调整pH值为7.0后得到，以下相同)中接种3重量份的ACCC 05728枯草芽孢杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为10¹⁰个/mL的培养基。

(2)在100重量份的PDA培养基中接种4重量份的ACCC 05729门多萨假单胞菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为10⁹个/mL的培养基。

(3)在100重量份的PDA培养基中接种2重量份的ACCC 05730枯草芽孢杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为10¹⁰个/mL的培养基。

(4)在100重量份的PDA培养基中接种2重量份的ACCC 05731类产碱假单胞菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为10⁹个/mL的培养基。

(5)将步骤(1)至(4)中得到的ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌分别稀释到活菌数为10⁹个/mL的培养基的浓度后按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的25％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的25％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的25％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的25％，得到微生物菌剂A1。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。

(1)在100重量份的PDA培养基中接种5重量份的ACCC 05728枯草芽孢杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为10¹⁰个/mL的培养基。

(2)在100重量份的PDA培养基中接种2重量份的ACCC 05729门多萨假单胞菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为10⁹个/mL的培养基。

(3)在100重量份的PDA培养基中接种3重量份的ACCC 05730枯草芽孢杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为10¹⁰个/mL的培养基。

(4)在100重量份的PDA培养基中接种4重量份的ACCC 05731类产碱假单胞菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为10⁹个/mL的培养基。

(5)将步骤(1)至(4)中得到的ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌分别稀释到活菌数为10⁹个/mL的培养基的浓度后按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的30％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的25％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15％，得到微生物菌剂A2。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的微生物菌剂及其制备方法。

(1)在100重量份的PDA培养基中接种2.5重量份的ACCC 05728枯草芽孢杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为10¹⁰个/mL的培养基。

(2)在100重量份的PDA培养基中接种3.5重量份的ACCC 05729门多萨假单胞菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为10⁹个/mL的培养基。

(3)在100重量份的PDA培养基中接种4.5重量份的ACCC 05730枯草芽孢杆菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为10¹⁰个/mL的培养基。

(4)在100重量份的PDA培养基中接种3.5重量份的ACCC 05731类产碱假单胞菌(购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培养，直至ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为10⁹个/mL的培养基。

(5)将步骤(1)至(4)中得到的ACCC 05728枯草芽孢杆菌、ACCC05729门多萨假单胞菌、ACCC 05730枯草芽孢杆菌和ACCC 05731类产碱假单胞菌分别稀释到活菌数为10⁹个/mL的培养基的浓度后按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，所述ACCC 05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15％、所述ACCC 05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15％、所述ACCC 05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的30％、所述ACCC 05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的40％，得到微生物菌剂A3。

实施例4-6

分别用实施例1-3中得到的微生物菌剂A1-A3对含氮的富营养化水(用模拟富营养化水代替)进行处理，具体步骤如下：分别取总活菌数为4×10¹⁰个的实施例1-3制得的微生物菌剂A1-A3，并分别加入到100ml模拟富营养化水中，每隔24小时检测氨氮和总氮浓度，氨氮浓度测定采用纳氏试剂比色法(按照GB/T 7479-87的规定进行)，亚硝酸盐浓度和硝酸盐浓度测定采用离子色谱法(按照GB/T 5009.33-2008的规定进行)。模拟富营养化水的各组分参数如下表1所示。检测结果如下表2所示。

表1

表2

从表2的数据可以看出，微生物菌剂A1-A3能有效地降低水样中的氨氮浓度、亚硝酸盐浓度和硝酸盐浓度。

实施例7

(1)实施例1中制得的微生物菌剂A1在5000g下离心10分钟，用无菌水洗涤菌体沉淀并离心两次，浓缩收集菌体，得到1.6×10¹⁴个菌体。之后用无机载体(活性炭)吸附，吸附的时间为10分钟，活性炭的用量为20克。

(2)将聚乙烯醇和海藻酸钠分别加热使其制成凝胶，将聚乙烯醇凝胶和海藻酸钠凝胶(重量比为1∶1)混和得到包埋剂，再将包埋剂与步骤(1)中吸附菌体的活性碳充分混匀(相对于1.6×10¹⁴个的菌体，聚乙烯醇凝胶和海藻酸钠的总用量为120克)，通过制粒器将此混合物滴入已调好pH的交联剂(氯化钙浓度为4重量％的硼酸饱和溶液，pH为7.4，相对于1.6×10¹⁴个的菌体，交联剂的用量为240克(以溶质的量计算))中，并不断搅动交联剂，使胶体颗粒与交联剂充分混和发生反应，避免胶体之间发生粘连，制成3-4mm的球状颗粒。之后将该球状颗粒放置于4℃冰箱中固化24小时，交联后用生理盐水洗涤3次，分离得到固定化颗粒B1。取固定化颗粒B1进行活菌数计数分析，测得每毫升固定化颗粒B1所含的总活菌数为1.6×10¹⁰个。

实施例8

(1)实施例2中制得的微生物菌剂A2在5000g下离心10分钟，用无菌水洗涤菌体沉淀并离心两次，浓缩收集菌体之后用活性炭吸附，吸附的时间为10分钟，相对于1.6×10¹⁴个的菌体，活性炭的用量为30克。

(2)将用聚乙烯醇加热使其制成凝胶，再与步骤(1)中吸附菌体的活性碳充分混匀(相对于1.6×10¹⁴个的菌体，聚乙烯醇凝胶的用量为190克)，通过制粒器将此混合物滴入已调好pH的交联剂(氯化钙浓度为4％的硼酸饱和溶液，pH为7.4，相对于1.6×10¹⁴个的菌体，交联剂的用量为380克(以溶质的量计算)中，并不断搅动交联剂，使胶体颗粒与交联剂充分混和发生反应，避免胶体之间发生粘连，制成3-4mm的球状颗粒。之后将放置于4℃冰箱中固化24小时，交联后用生理盐水洗涤3次，分离得到固定化颗粒B2。取固定化颗粒B1进行活菌数计数分析，测得每毫升固定化颗粒B1所含的总活菌数为0.6×10¹⁰个。

实施例9

(1)实施例3中制得的微生物菌剂A3在5000g下离心10分钟，用无菌水洗涤菌体沉淀并离心两次，浓缩收集菌体，之后分别用活性炭吸附，吸附的时间为10分钟，相对于1.6×10¹⁴个的菌体，活性炭的用量为12克。

(2)将用海藻酸钠加热使其制成凝胶，再与步骤(1)中吸附菌体的活性碳充分混匀(相对于1.6×10¹⁴个的菌体，海藻酸钠的用量为60克)，通过制粒器将此混合物滴入已调好pH的交联剂(氯化钙浓度为4％的硼酸饱和溶液，pH为7.4，相对于1.6×10¹⁴个的菌体，交联剂的用量为150克)中，并不断搅动交联剂，使胶体颗粒与交联剂充分混和发生反应，避免胶体之间发生粘连，制成3-4mm的球状颗粒。之后将放置于4℃冰箱中固化24小时，交联后用生理盐水洗涤3次，分离得到固定化颗粒B3。取固定化颗粒B1进行活菌数计数，测得每毫升固定化颗粒B1所含的总活菌数为2.8×10¹⁰个。

实施例10-12

分别用实施例7-9中得到的固定化颗粒B1-B3对含氮的富营养化水进行处理，具体步骤如下：

分别取总活菌数为4×10¹⁰个实施例7-9制得的固定化颗粒B1-B3，并分别加入到100ml模拟富营养化水中，3小时后检测氨氮的数值，氨氮测定采用纳氏试剂比色法(按照GB7479-87的规定进行)，模拟富营养化水的各组分参数如上表1所示。检测结果如下表3所示。

表3

从表3的数据可以看出，固定化颗粒B1-B3能有效地降低水样中的氨氮浓度、亚硝酸盐浓度和硝酸盐浓度。并且固定化颗粒相比如上所述的微生物菌剂菌剂具有更快速更高效的水处理能力。

Claims

1.一种脱氮微生物菌剂，该脱氮微生物菌剂含有培养基和菌体，其特征在于，所述菌体含有ACCC05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）、ACCC05730枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和ACCC05731类产碱假单胞菌（Pseudomonaspseudoalcaligenes），并且，每毫升所述微生物菌剂所含的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个，其中，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%。

2.根据权利要求1所述的脱氮微生物菌剂，其中，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30%、所述ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％。

3.权利要求1所述的脱氮微生物菌剂的制备方法，其中，该方法包括将ACCC05728枯草芽孢杆菌、ACCC05729门多萨假单胞菌、ACCC05730枯草芽孢杆菌和ACCC05731类产碱假单胞菌接种于培养基中进行培养，使得到的每毫升微生物菌剂的总活菌数为0.1×10¹⁰到8×10¹⁰个，其中，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%；

其中，所述将ACCC05728枯草芽孢杆菌、ACCC05729门多萨假单胞菌、ACCC05730枯草芽孢杆菌和ACCC05731类产碱假单胞菌接种于培养基中进行培养的方法包括：在各自独立的培养体系中分别培养ACCC05728枯草芽孢杆菌、ACCC05729门多萨假单胞菌、ACCC05730枯草芽孢杆菌和ACCC05731类产碱假单胞菌；并将分别培养得到的ACCC05728枯草芽孢杆菌、ACCC05729门多萨假单胞菌、ACCC05730枯草芽孢杆菌和ACCC05731类产碱假单胞菌按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，以得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30%、所述ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30%。

5.一种含有微生物的固定化颗粒，其中，该固定化颗粒由含有菌体、包埋剂和无机载体的组合物在交联剂存在下固定化后分离得到，其中，所述菌体含有ACCC05728枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、ACCC05729门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）、ACCC05730枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和ACCC05731类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes），并且，每毫升所述固定化颗粒所含的总活菌数为0.4×10¹⁰到3.2×10¹⁰个，其中，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%、所述ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的10-45％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的10-45%。

6.根据权利要求5所述的固定化颗粒，其中，所述ACCC05728枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05729门多萨假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30%、所述ACCC05730枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％、所述ACCC05731类产碱假单胞菌的活菌数为总活菌数的15-30％。

7.根据权利要求5所述的固定化颗粒，其中，所述组合物中，相对于总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，所述包埋剂的含量为20-500克，所述无机载体的含量为3-100克；相对于所述组合物中的总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，以溶质的量计，所述交联剂的用量为50-1000克。

8.根据权利要求6或7所述的固定化颗粒，其中，所述组合物中，相对于总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，所述包埋剂的含量为50-200克，所述无机载体的含量为10-30克；相对于所述组合物中的总活菌数为1.6×10¹⁴个的菌体，以溶质的量计，所述交联剂的用量为120-400克。

9.权利要求1或2所述的微生物菌剂或权利要求5-8中的任意一项所述的固定化颗粒在降低水体氮元素含量中的应用。