CN101691569A - 蜡状芽孢杆菌微生物制剂和该制剂处理含氮废水的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)微生物制剂及其制备方法，所述蜡状芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.3047，其步骤如下：利用琼脂和聚乙烯醇将蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047进行固定化，并通过20-60℃气流干燥最终制成生物菌剂。该制备方法中琼脂和聚乙烯醇的使用量少，生产成本低，制备方法简单；该方法制成的生物菌剂微生物活性高、易保存、运输方便，容易回收；利用此菌剂处理含氮废水，在NH₄ ⁺-N初始浓度在100mg/L、NO₃ ^--N初始浓度在30mg/L的条件下，NH₄ ⁺-N的去除率达到93.7％，TN(废水中NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度之和)的去除率达到88.6％；该法的另一特点是，该菌株可同时去除NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N。因此，鉴于以上特点，此方法不仅适用于各种城市及生活废水，也适用于高浓度氨氮工业废水的脱氮治理。

Description

蜡状芽孢杆菌微生物制剂和该制剂处理含氮废水的方法

技术领域

本发明涉及一株具有脱氮性能的蜡状芽孢杆菌，及由该菌株制备的微生物制剂和利用该微生物制剂处理含氮废水的方法，属于微生物领域。

背景技术

传统的废水脱氮方法中，氨氮需经过硝化菌转变为硝基氮，再通过反硝化菌将水中的硝基氮还原成气态，从水中排除。但是近年来，有不少文献报道发现了一些反硝化菌同时兼具硝化性能，这种菌可以将氨氮直接转变成氮的气态形式将氮从水体中直接排出。这种菌具有很高的利用价值，在废水脱氮中可以减少脱氮步骤，节省时间，提高处理效率。

发明人早期专利“具有好氧反硝化性能的戴尔福特菌及其处理废水的方法”ZL 200610140872.3，该专利是一种涉及采用戴尔福特(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797菌株在好氧条件下进行生物脱氮处理废水的方法。发明专利“具有好氧反硝化性能的睾丸酮丛毛单胞菌及其处理废水的方法”ZL200610140870.4，该专利是一种涉及采用睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)WXZ-18 CGMCC No.1800菌株及其应用于废水脱氮处理的方法。发明专利“具有好氧反硝化性能的恶臭假单胞菌及其处理废水的方法”ZL200610140871.9，该专利是一种涉及采用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)WXZ-4 CGMCC No.1798菌株及其应用于废水脱氮处理的方法。发明专利“具有好氧反硝化性能的草螺菌及其处理废水的方法”ZL 200610140869.1，该专利是一种涉及采用草螺菌(Herbaspirillum huttiense)WXZ-14 CGMCC No.1799菌株及其应用于废水脱氮处理的方法。这四项专利所涉及的这些菌株具有优异的好氧反硝化性能，可以去除废水中的硝基氮和亚硝基氮。异养硝化作用(heterotrophicnitrification)是异养微生物参与无机氮氧化的生物化学过程，它的底物是无机态氨氮。近年来，有研究者提出更为严格的异养硝化作用的定义为(Papen，1998)：异养微生物在好氧条件下将氨/铵或是有机态氮氧化到羟胺，亚硝酸盐和硝酸盐的过程，即：

目前国外的研究报道中尚未见芽孢杆菌异养硝化-好氧反硝化的报道，但国内已有了相关的研究。郝桂玉研究了SBR中芽孢杆菌的异养硝化作用，指出SBR周期连续运行后，污泥浓度会相对稳定，芽孢杆菌能很好适应好氧与缺氧环境，成为污泥中的优势菌种。但在驯化过程中，进水氨氮浓度在20mg/L左右，且最大氨氮去除率低于60％，但未指出究竟是否有脱氮功能，因此不能判断是否存在好氧反硝化性能。于爱茸从鱼塘中分离到1株高效的有氧反硝化菌Bacillus sp.W2，经Biolog法细菌鉴定，初步鉴定为芽孢杆菌。该菌在硝基氮浓度为25mg/L，溶解氧达到2mg/L时，除氮率达到97％；溶解氧达到4~5mg/L时，除氮率为85％以上；同时在好氧条件下，菌体浓度为1000个/mL时，对自然水体中高达1mg/L亚硝酸浓度也能发挥高效的反硝化作用，但未见Bacillus sp.W2菌株的异养硝化性能的相关研究报道。何霞等从膜生物反应器中分离出来的1株异养硝化细菌Bacillus sp.LY，经鉴定为芽孢杆菌。在氨氮浓度分别为40、80和120mg/L 3种情况下，120h反应后，氨氮的去除率分别是100％、85.7％、73.7％。该菌株的硝化作用启动慢，在120h才能达到较好的脱氮效果。并报道经研究Bacillussp.LY具有脱氮性能，但未指出总氮去除率。

但是在实际工程中，实验室筛选的优良菌株受运输及保存条件、保存时间等限制，影响广泛使用。采用菌株固定化可以解决这一问题，菌株固定化是利用物理、化学等因素将菌种约束或限制在一定的空间介质内(上)，而菌种仍保留其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力。固定化后的菌种只要通过常温干燥保存可保存数月，并且运输方便，可以回收。

综上所述具有异养硝化-好氧反硝化作用的高效脱氮菌如做成菌剂产品，将对废水脱氮市场产生重要意义。

现有菌剂的包埋材料主要为天然多糖类凝胶和有机合成高分子凝胶两类。常见的天然高分子凝胶主要有：海藻酸钠、卡拉胶、琼脂等；常见的有机高分子凝胶主要有：聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。两类凝胶各有优缺点，天然高分子凝胶其优点是制作过程简单，易成球，包埋剂对微生物活性影响小，其缺点是抗微生物分解能力差，机械强度较低；有机合成高分子凝胶的优点是，机械强度高，抗微生物分解能力强，但其缺点是制作过程复杂，有些凝胶易粘连，且对微生物活性影响较大。因此，目前的研究表明，只有两种或多种包埋剂联合使用，才能发挥其各自的优点，弥补彼此的缺点。

以发明人叶正方、李沧海、李三喜的“固定化微生物处理污水工艺”CN1405099A是关于利用改性泡沫吸附优势菌株的发明专利，并且此专利并没有提到保存时间，且该发明只提到了氨氮的去除，并没有提到总氮的去除。

以发明人罗明芳、刘会洲等的“利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法”CN1458229A是以海藻酸钠为包埋剂的发明专利，以氯化钙为交联剂，将德氏假单胞菌固定化，但此法主要是用于油品脱硫菌的包埋方法。

文献“不同材料包埋固定化厌氧氨氧化混培物”报道了(朱刚利等，2008)分别采用羧甲基纤维素钠(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)以及PVA-SA混合液，对ANAMMOX混培物进行了包埋固定化和基本性能测试，四种包埋方法氨氮去除率均达到了90％以上，但均有硝酸盐积累现象，积累值均达到25mg/L。

文献“亚硝酸盐氧化细菌固定化方法的优化研究”(崔华平等，2009)报道了采用聚乙烯醇和海藻酸钠混合固定亚硝酸盐氧化细菌，得到最佳包埋条件为：聚乙烯醇8％、海藻酸钠1％、包埋菌液浓度26g/L、固定化小球交联时间16h，10d内将亚硝酸盐氮从1.210mg/L降至0.041mg/L。

文献“改性载体固定化微生物处理高氨氮废水的研究”(李彦锋等，2008)报道了采用改性聚氨酯泡沫体作为固定化高效微生物载体，在初始氨氮500mg/L条件下，氨氮去除率可达97.75％，但此文并没有提到总氮去除率。

文献“聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究”(李峰等，2000)报道了以聚乙烯醇为包埋剂对活性污泥进行固定化，以固定化细胞的COD_Cr去除率为包埋效果的主要指标，并对固定化细胞的保存进行了试验研究。利用合成废水浸泡(4℃)保存十天后，经过十天的活化其COD_Cr仍不到70％。

迄今尚未见有关采用聚乙烯醇和琼脂作混合包埋剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株以硝酸盐或氨氮为氮源进行生长的菌株；并将其制成菌剂，菌剂的制作和干燥过程简单，接种于常规好氧污泥中，即可实现含氨氮废水的直接脱氮作用。可以解决传统废水处理中脱氮需要利用不同的硝化和反硝化菌群，更不需要反硝化在缺氧环境、硝化在好氧环境分段处理的问题；也解决了优良菌株工程应用不易保存、运输困难，菌剂生产过程复杂，生产成本过高等诸多问题。

本发明的发明思路是采用已筛选的具有天然生长优势的高效异养硝化-好氧反硝化菌株，根据现有菌株包埋技术的缺陷，发明人利用琼脂和聚乙烯醇的结合，在制作过程、包埋后微生物活性、以及传质效果等方面改进了现有技术在菌剂包埋方面的问题。将包埋菌剂接种于不同浓度的氨氮废水中，并通过不同反应条件试验(溶解氧，碳氮比，pH等)，证实菌剂在简单保存条件下有良好的活性，具有广泛的应用适应性。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株具有异养硝化-好氧反硝化性能的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2009年4月30日，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.3047。

上述的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047用于制备生物脱氮用微生物制剂的用途。

一种用于处理含氮废水的微生物制剂，所述微生物制剂包括蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047。

上述微生物制剂的制备方法，其具体步骤为：

(1)配制琼脂和聚乙烯醇的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶(2～6)；与蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌液混合后终浓度为1％～4％和2％～8％，121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却至室温；

(2)将对数生长期的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌悬液，菌悬液与混合液为1∶50的体积百分比，菌悬液的菌体浓度为40％～50％(质量百分比)，再将混合液用针管滴入已灭菌饱和硼酸中，形成小球。此过程中，操作温度需控制在30～70℃；

(3)将小球放入冰箱中0～5℃交联8～32小时，用无菌水洗净0～5℃保存待用；

(4)把固定化好的小球放入干燥箱中，20～60℃干燥5～40h取出，用自封袋包装，放入CaCl₂作为干燥剂，菌剂制备完成。

利用上述微生物制剂处理含氮废水的方法，将菌剂(菌剂质量∶含氮废水质量＝1∶(200～1000))加入含氮废水中，摇床振荡培养4天，其条件是转数为100～200r/min、温度20～40℃、pH为7～9、C/N为15～35。

本发明的优点及有益效果是：

1、本发明蜡状芽孢杆菌兼具异养硝化和好氧反硝化性能，异养硝化要比传统自养硝化菌的硝化反应速度快得多，在本案例中，甚至快于反硝化速度；好氧反硝化菌和传统缺氧反硝化菌相比，可以和硝化同时进行，在本案例中，单菌株就实现硝化和反硝化过程。

2、本发明菌株除了具有异养硝化和好氧反硝化性能外，还具有特殊的生物N₂O控逸作用，在以柠檬酸三钠为唯一碳源，硫酸铵为唯一氮源，温度＝30℃，C/N＝25，pH＝9.0，转数＝180r/min(DO＝5.76～6.59mg/L)，NH₄ ⁺-N初始浓度分别为100mg/L条件下，空气密封培养96h后，NH₄ ⁺-N和TN去除率分别达到96.3％和93.81％，产生的N₂O气体为0.00945mg，N₂为9.5005mg，仅占从水体中脱除的氮的0.047％；

3、本发明制备的微生物制剂能实现含氮废水的同步硝化反硝化，可以解决传统废水处理中脱氮需要采取缺氧反硝化，好氧硝化分段处理的问题。在温度＝20～40℃，C/N＝15～35，pH＝7～9，转数＝100～200r/min，初始NH₄ ⁺-N和NO₃ ^--N浓度分别达到100mg/L和30mg/L条件下，NH₄ ⁺-N和TN去除率分别达到93.7％和88.6％。

4、本发明微生物制剂制备方法简单，成本低廉、生物活性高、易保存、运输方便，容易回收。该微生物制剂在干燥密封的保存条件下可以至少保存三个月，且活性不受影响，经实验室验证，本发明制备菌剂干燥保存90天的NH₄ ⁺-N和TN去除率可分别达到89.1％和84.2％。此微生物制剂不仅适用于各种城市及生活废水，也适用于高浓度氨氮工业废水的治理。

5、本发明的包埋材料选择和包埋方法，使微生物制剂小球易于保存，在运输和使用过程中不易破碎，并且可以保证微生物的活性不受影响。

附图说明

图1为干燥保存90天本发明微生物菌剂的总氮去除率；注：以菌剂处理废水氨氮去除率表示菌剂的活性。

图2为本发明菌剂图片。

具体实施方式

实施例1蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株的筛选

该菌株来自于本实验室，以硝酸盐为底物，高溶解氧条件驯化下的SBR曝气反应器A(总无机氮(TIN)去除率60.0～83.0％，COD去除率85.0～90.0％)中的活性污泥，保藏编号为CGMCC NO.3047。

利用BTB培养基中所含的溴百里酚蓝为产碱指示剂，遇碱变蓝的特点，采用梯度稀释及涂布法将本实验室反应器A中的混合液均匀涂布于BTB培养基，30℃恒温好氧培养数天后，挑取周围培养基出现蓝色的晕圈并且菌落形态不相同的单菌落作为初筛的好氧反硝化菌，在平板上划线进行菌株的纯化。划线筛选得到的纯菌株在试管中划斜面保存。接着对菌株进行反硝化性能测试(以硝基氮还原率和总氮去除率来衡量)，复筛出纯的好氧反硝化菌。将筛选出的好氧反硝化菌株接种于异养硝化培养基中，测定菌株的硝化性能(硝化性能以氨氮的去除率来衡量)，选取氨氮去除率60％以上的菌株，至此认为筛选出具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌株。

实施例2：蜡状芽孢杆菌CGMCC NO.3047好氧反硝化培养方法

为了防止模拟废水中带入杂菌，硝酸盐模拟废水在高温灭菌锅0.1MP中灭活20min。取菌剂1g菌剂接种到装有200mL硝酸盐模拟废水的250mL锥形瓶中进行反硝化、脱氮性能测定。每隔24小时，用装有0.2μm混合纤维膜的针式过滤器过滤抽取锥形瓶中废水样品5mL，测定NO₂ ^--N和NO₃ ^--N浓度。通过计算NO₃ ^--N还原率和总氮(废水中NH₄ ⁺-N、NO₃ ^--N和NO₂ ^--N浓度之和)去除率分析菌株的NO₃ ^--N还原性能和脱氮性能。

硝酸盐模拟废水(/L)：琥珀酸钠：2.4g，KNO₃：0.722g，KH₂PO₄：1.0g，MgSO₄·7H₂O：1.0g。

实施例3：蜡状芽孢杆菌CGMCC NO.3047的好氧反硝化性能的测定方法

废水好氧反硝化条件为：溶解氧浓度，通过控制不同转速rpm实现，转速为100rpm，对应溶解氧浓度为4.2～5.6mg/L；硝基氮浓度为63.8mg/L左右；碳氮比10，pH值为6.5。

按照实施例2方法进行反硝化性能测定，试验结果：4天后NO₃ ^--N还原率78.0％，4天后TIN去除率为76.8％。

实施例4：蜡状芽孢杆菌CGMCC NO.3047异养硝化-好氧反硝化性能的测定方法

为了防止模拟废水中带入杂菌，氨氮模拟废水在高温灭菌锅0.1MP中灭活20min。将0.2g菌剂接种到装有200ml氨氮模拟废水II的250mL锥形瓶中进行硝化、脱氮性能测定。每隔24小时，用装有0.2μm混合纤维膜的针式过滤器过滤抽取锥形瓶中废水样品5mL，测定NH₄ ⁺-N，NO₂ ^--N和NO₃ ^--N浓度。通过计算氨氮去除率和总氮(废水中氨氮，硝酸盐和亚硝酸盐浓度之和)的去除率分析菌株的硝化性能和脱氮性能。

氨氮模拟废水(/L)：(NH₄)₂SO₄：0.47g，柠檬酸三钠(C₆H₅Na₃O₇·2H₂O)：5.1g；碳源用量依据正交实验设计COD/N比调节，维氏盐溶液50ml；加水溶解，补充蒸馏水至1L，并同时调节初始pH值。其中维氏盐溶液(/L)：K₂HPO₄：5.0g；FeSO₄·7H₂O：0.05g；NaCl：2.5g；MgSO₄·7H₂O：2.5g；MnSO₄·4H₂O：0.05g，溶解后加水定容至1L。

实施例5：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株CGMCC NO.3047的脱氮处理反应条件

通过试验优选出该菌株的硝化、反硝化优选培养条件为：以柠檬酸三钠为唯一碳源，硫酸铵为唯一氮源，NH₄ ⁺-N初始浓度分别为100mg/L条件下，空气密封培养，温度为30℃、COD/N为25、初始pH值为9.0、转速为180r/min(DO＝5.76～6.59mg/L)。此条件下，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)在16h时氨氮去除率达最大，为96.30％。该菌株对数生长期发生在最初24小时内，菌体生长量在第24小时达到最大，OD600值为1.094。TN的去除与NH₄ ⁺-N的去除有着相同的趋势，在第16小时TN去除率达93.81％，在整个硝化过程中仅有极少量的NO₃ ^--N、NO₂ ^--N的累积，菌株在硝化过程中将NH₄ ⁺-N氧化为NO₃ ^--N、NO₂ ^--N，且通过好氧反硝化作用被去除。

实施例6：空气密封瓶培养条件下，以柠檬酸三钠为碳源，硫酸铵为唯一氮源，对蜡状芽孢杆菌CGMCC NO.3047异养硝化过程中N₂O的生物控逸技术

为了防止模拟废水中带入杂菌，氨氮模拟废水I和氨氮模拟废水II均在高温灭菌锅0.1MPa中灭活20min。将以液体石蜡封存的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)CGMCC NO.3047接入氨氮模拟废水I，置于气浴恒温摇床，恒温保持30℃，摇床转速120～160r/min进行菌株活化。活化12～16小时后，以5％的接种量接种到装有200ml氨氮模拟废水II的1L带有密封橡胶塞的三角瓶中进行硝化能力、脱氮产物N₂O气体测定。在20～40℃，，pH＝7.0～9.0，转速为90～180r/min，COD/N为15～30的条件下，用气浴恒温摇床下进行培养，分析测定。同样条件下，空白废水样品(未接菌株的氨氮模拟废水II)作为对比基准试验。

每隔24小时，用10ml锁式进样器缓慢匀速抽取锥形瓶中逸出的气体，直接分析检测N₂O。同时用抽取液体样品，测定NH₄ ⁺-N，NO₂ ^--N和NO₃ ^--N浓度。通过计算氨氮去除率、总氮去除率以及N₂O的气体产量分析菌株的硝化性能和脱氮性能。

N₂O采用GC-ECD法测定，Varian 3800气相色谱仪；10mci63Ni电子捕获检测器(ECD)；3m×3mm不锈钢柱，填充固体Porapak Q柱，80/100目。选用的综合色谱条件：检测器温度(T_D)(350℃)、分离柱温度(T_C)(50℃)、载气流速(f_C)(20mL/min)，在此条件下具有较高的灵敏度和精确度，重现性较好(相对标准偏差C.V＝1.05％，n＝23)。如图2所示，依据上述测试条件可以看出，O₂和N₂O分离度较大，说明气体成分清楚，下述结果测量精准。

实验结果表明：在空气密封培养条件下，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CGMCC NO.3047菌株在以柠檬酸三钠为唯一碳源，硫酸铵为唯一氮源，温度＝30℃，COD/N＝25，pH＝8.0，转速＝160r/min，NH₄ ⁺-N初始浓度为100mg/L，实验条件下，96h后NH₁ ^--N去除率为90.52％，总氮去除率＝91.54％，产生的N₂O为0.00945mg，占从水体中脱除的氮的0.047％。

实施例7：纯氧密封瓶培养条件下，以柠檬酸三钠为碳源，硫酸铵为唯一氮源，对蜡状芽孢杆菌CGMCC NO.3047异养硝化过程中N₂O的生物控逸技术

与实施例11不同，本试验中将200ml氨氮模拟废水II接入1L带有双孔密封橡胶塞的三角瓶中进行硝化能力、脱氮产物N₂O气体测定。如图1所示，为实验中为测定N₂O所用特制双孔培养摇瓶示意图；其中该培养摇瓶包括双孔橡胶塞1、气体取样口2、阀门3、液体取样口4、出气口5(带有夹子的橡胶管另一端连着玻璃管)和进气口6(带有夹子的橡胶管另一端连着玻璃管)。

培养中，将99.999％的高纯氧气以相同流速注入到培养瓶中，充氧时间为60秒(注：通过前期的实验验证，40秒的充氧时间能够保证1L瓶中含95％以上的氧气)，立刻用夹子夹紧连着玻璃管的橡胶管，然后进行摇床培养。每隔24小时，用10ml锁式进样器缓慢匀速抽取锥形瓶中逸出的气体，直接分析检测N₂O。同时用抽取液体样品，测定NH₄ ⁺-N，NO₂ ^--N和NO₃ ^--N浓度。通过计算氨氮去除率、总氮去除率以及N₂O的气体产量分析菌株的硝化性能和脱氮性能。

实验结果表明：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株在以柠檬酸三钠为唯一碳源，硫酸铵为唯一氮源，温度＝30℃，COD/N＝25，pH＝8.0，转速＝160r/min，NH₁ ⁺-N初始浓度为100mg/L实验条件下，96h后NH₄ ⁺-N去除率为91.45％，总氮去除率＝92.49％，产生的N₂O为0.00425mg，占从水体中脱除的氮的0.024％。

实施例8：本发明微生物制剂的制备

1)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047的增殖。

将营养琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)在121℃条件下灭菌20min，倒入培养皿中，营养琼脂的量可以根据菌体需要而定，本实施例中为10ml/g(营养琼脂体积/菌体重量)，待琼脂凝固后，将斜面中的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047划入平板中，尽量将平板划满，划线完成后，将培养皿放入生化培养箱中，30℃下培养2天。2天后，平板培养基上蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047基本布满平板，再将平板中的菌转移到已灭菌的增殖培养基中，在摇床转数为100r/min，30℃的条件下培养96h，再将液体增殖后的菌液在4000r/min下离心10min，将离心后的湿菌体用无菌水洗两遍，放入4℃冰箱中待用。

增殖培养基(1L)：(NH₄)₂SO₄：0.47g；KH₂PO₄：1g；FeCl₂·6H₂O：1.25；CaCl₂·7H₂O：0.2；MgSO₁·7H₂O：1.0g；柠檬酸三钠：5.1g。

2)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047微生物制剂的制备

配制琼脂(天津光复精细化工研究所)和聚乙烯醇(天津光复精细化工研究所)的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶6；与菌液混合后终浓度为1％和6％，121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却后，将菌液加入混合液中，用玻璃棒搅匀，将混合液放入30℃的水浴锅中，再将混合液用针管滴入已灭菌饱和硼酸(国药集团化学试剂有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4℃交联8小时，用无菌水洗净4℃保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，20℃干燥40h取出，用自封袋包装，放入CaCl₂作为干燥剂。菌剂制备完成。如图2所示，本发明菌剂大小形状均一，品质好。

按照实施例4的方法进行菌剂活性测定。其氨氮和总氮去除率分别为92.1％和86.7％。

实施例9：本发明微生物制剂的制备

1)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047的增殖。

步骤同实施例8。

2)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047微生物制剂的制备

配制琼脂(天津光复精细化工研究所)和聚乙烯醇(天津光复精细化工研究所)的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶2；与菌液混合后终浓度为4％和8％，121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却后，将菌液加入混合液中，用玻璃棒搅匀，将混合液放入70℃的水浴锅中，再将混合液用针管滴入已灭菌饱和硼酸(国药集团化学试剂有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4℃交联32小时，用无菌水洗净4℃保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，60℃干燥5h取出，用自封袋包装，放入CaCl₂作为干燥剂。菌剂制备完成。

按照实施例4的方法进行菌剂活性测定。其氨氮和总氮去除率分别为91.4％和85.8％。

实施例10：本发明微生物制剂的制备

1)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047的增殖。

将营养琼脂(北京奥博星生物技术有限责任公司)在121℃条件下灭菌20min，倒入培养皿中，营养琼脂的量可以根据菌体需要而定，10ml/g(营养琼脂体积/菌体重量)，待琼脂凝固后，将斜面中的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047划入平板中，尽量将平板划满，划线完成后，将培养皿放入生化培养箱中，30℃下培养2天。2天后，平板培养基上蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047基本布满平板，再将平板中的菌转移到已灭菌的增殖培养基中，在摇床转数为200r/min，30℃的条件下培养8h，再将液体增殖后的菌液在14000r/min下离心2min，将离心后的湿菌体用无菌水洗两遍，放入4℃冰箱中待用。

2)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047微生物制剂的制备

配制琼脂(天津光复精细化工研究所)和聚乙烯醇(天津光复精细化工研究所)的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶5；与菌液混合后终浓度为1％和5％，121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却后，将菌液加入混合液中，用玻璃棒搅匀，将混合液放入40℃的水浴锅中，再将混合液用针管滴入已灭菌饱和硼酸(国药集团化学试剂有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4℃交联16小时，用无菌水洗净4℃保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，40℃干燥15h取出，用自封袋包装，放入CaCl₂作为干燥剂。菌剂制备完成。

按照实施例4的方法进行菌剂活性测定。其氨氮和总氮去除率分别为93.7％和88.6％。

实施例11：本发明微生物制剂的制备

1)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047的增殖。

步骤同实施例8

2)蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047微生物制剂的制备

配制琼脂(天津光复精细化工研究所)和聚乙烯醇(天津光复精细化工研究所)的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶3；与菌液混合后终浓度为2％和6％，121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却后，将菌液加入混合液中，用玻璃棒搅匀，将混合液放入50℃的水浴锅中，再将混合液用针管滴入已灭菌饱和硼酸(国药集团化学试剂有限公司)中，形成小球。放入冰箱中4℃交联12小时，用无菌水洗净4℃保存待用。把固定化好的小球放入干燥箱中，30℃干燥12h取出，用自封袋包装，放入CaCl₂作为干燥剂。菌剂制备完成。

按照实施例4的方法进行菌剂活性测定。其氨氮和总氮去除率分别为93.1％和87.9％。

实施例12-15：蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌剂干燥保存0天、30天、60天、90天活性测定(含氨氮废水培养的总氮去除率测定)

根据实施例8的方法制作菌剂，将菌剂置于常温下保存，分别取保存0天、30天、60天、90天的菌剂，按照实施例4的方法进行菌剂活性测定。

编号	保存时间/天	氨氮去除率/％	TN去除率/％
				实施例12	0	93.7	88.6
实施例13	30	92.1	85.4
				实施例14	60	90.2	84.7
实施例15	90	89.1	84.2

编号	保存时间/天	氨氮去除率/％	TN去除率/％
				单独使用聚乙烯醇包埋对比	30	51.8％	45.5％

Claims (4)

1.蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)用于制备生物脱氮用微生物制剂的用途，其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.3047。

2.一种用于处理含氮废水的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包括蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047。

3.权利要求2所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)配制琼脂和聚乙烯醇的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶2～6；与蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌液混合后终浓度为质量1％～4％和2％～8％；将混合液121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却至室温；

(2)将对数生长期的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌悬液加入琼脂和聚乙烯醇混合液中搅匀，菌悬液与混合液为1∶50的体积百分比，菌悬液的菌体浓度为40％～50％，再将混合液用针管型枪注入已灭菌饱和硼酸中，形成小球，此过程中，操作温度需控制在30～70℃；

(3)将小球在0～5℃交联8-32小时，用无菌水洗净0～5℃保存待用；

(4)把固定化好的小球放入干燥箱中，20～60℃干燥5～40h取出，用自封袋包装，放入CaCl₂作为干燥剂。

4.权利要求3制备的微生物制剂处理含氮废水的方法，其特征在于，将菌剂加入含氮废水中，培养反应4天，其条件是转数为100～200r/min；DO＝4.2～6.7mg/L、温度20～40℃、pH为7～9、C/N为15～35；菌剂质量∶含氮废水质量＝1∶200～1000。

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