CN103602656A - 一种制备固定化酶和固定化菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备固定化酶和固定化菌种的方法，属于生物技术领域。一种制备固定化酶和固定化菌种的方法，包括制备酶溶液和菌种溶液，利用陶瓷膜对酶和菌种进行吸附，将吸附过酶和菌种的陶瓷膜接入聚乙烯亚胺交联剂溶液浸泡，过滤、干燥制得固定化酶和固定化菌种。本发明制备酶及菌种活力高、提取工艺简单、生产成本低、设备投入少，易于扩大生产规模。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备固定化酶和固定化菌种的方法，属于生物技术领域。
背景技术
酒精生产中，高深度的有机废水已经成为一个巨大的污染处理难题，这些污染物排入水体会消耗水中大量的溶解氧，破坏氧的平衡，导致水质的恶化，给环境带来严重的污染连锁反应。酒精废液悬浮含量高、平均悬浮物含量高达40000mg/L；污染浓度高，废水的COD高达2～3万，包括悬浮固体、溶解性COD和胶体，有机物占93％～94％，无机物占6％～7％，有机物的成分是碳水化合物，其次是含氮化合物，生物菌和未分解出去的产品：如丁醇、乙醇等，此外还有500mg/L的有机酸。
当今固定化酶和固定化细胞技术处理污水就是生物净化污水的方法之一，固定化酶和固定化细胞技术是酶工程技术。固定化酶又称水不溶性酶，是通过物理吸附法或化学键合法使水溶性酶和固态的不溶性载体相结合，将酶变成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物，微生物细胞是一个天然的固定化酶反应器，用制备固定化酶的方法直接将微生物细胞固定，即可催化一系列生化反应的固定化细胞。运用固定化酶和固定化细胞可以高效处理废水中的有机污染物、无机金属毒物等。
固定化酶的方法包括吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。但是每个方法都存有不足之处。吸附法对离子强度、pH、温度等因子敏感，故酶易损漏，且酶转载容量较小；共价偶联法中的偶联试剂对生命组织多有一定毒性，偶联条件激烈，易引起酶失效，成本较高；交联法的条件较激烈，常出现扩散限制，使用有一定难度。包埋法仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，反应常受扩散限制，不是所有单体材料与溶剂都适用于各种酶。
针对上述固定化方法存在的问题，可以通过耦合技术，克服单一固定化技术的缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备固定化酶和固定化菌种的方法。本发明的方法通过耦合吸附、交联这两种方法制备固定化酶和固定化菌种，其与已知的单一固定化方法获得的固定化产物相对稳定性更高，适合工业生产。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
1、一种制备固定化酶和固定化菌种的方法，包括以下步骤：
（1）制备酶溶液：控制酶溶液的酶活力单位大于3000U/mL，pH为6.5～7.5；
（2）制备菌种溶液；控制菌种溶液中的活菌含量为10～15亿个/mL；
（3）陶瓷膜吸附酶和菌种：以十二烷基硫酸钠为活化剂，将陶瓷膜浸泡于活化剂溶液中，活化3～5小时，将制得的酶溶液、菌种溶液、已活化的陶瓷膜置于反应器内混合，搅拌1～2小时，浸泡58～65小时，过滤除去溶液，制得吸附有酶和菌种的陶瓷膜；
（4）制备交联剂溶液：以聚乙烯亚胺为交联剂配置交联剂溶液，调节pH为8～9；
（5）将吸附有酶和菌种的陶瓷膜加入交联剂溶液浸泡15～20小时，过滤除去滤液、干燥制得固定化酶和固定化菌种。
优选的是：步骤（1）或（3）中所述的酶至少含有胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶中的一种。
优选的是：步骤（2）或（3）中所述的菌种至少含有双岐菌、乳酸菌、好氧芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌中的一种。
优选的是：步骤（3）中所述的活化剂溶液的质量分数为4%～8%。
优选的是：步骤（3）中每平方厘米的陶瓷膜需加入的酶、菌种溶液的总体积为2L，其中酶溶液、菌种溶液加入体积比为1：1，陶瓷膜孔径0.1μm～0.5μm。
优选的是：步骤（3）中所述的浸泡温度为25℃～30℃。
优选的是：步骤（4）中所述的交联剂溶液的质量分数为1.2%～1.5%。
本发明的有益效果：
（1）本发明的固定化酶及固定化菌种的制备方法结合吸附及交联的固定化方法，得到的固定化产物与其他只用到一种的固定化方法产物相比，酶的重循环利用率及酶活性均有大幅度提高。
（2）本发明所用的酶和菌种搭配对有机废水作用强、效果好。
（3）陶瓷膜具有分离效率高、效果稳定、化学稳定性好、耐酸碱、耐有机溶剂、耐菌、耐高温、抗污染、机械强度高、膜再生性能好、分离过程简单、能耗低、操作维护简便、膜使用寿命长等众多优势。
（4）本发明制备酶及菌种活力高、提取工艺简单、生产成本低、设备投入少，易于扩大生产规模。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
制备弹性蛋白酶水溶液，经过检测，酶活力单位为3500U/mL，用碳酸氢钠调节溶液pH为6.5。制备双岐菌水溶液，控制菌种溶液中的活菌含量为10亿个/mL；将膜孔径为0.1μm的陶瓷膜放置于质量分数为4%的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡活化3小时，溶液需没过陶瓷膜。将1L弹性蛋白酶水溶液、1L醋酸菌水溶液、1cm2陶瓷膜置于反应器内混合，搅拌1小时，在25℃条件下浸泡58小时，过滤除去溶液，制得吸附有酶和菌种的陶瓷膜。将吸附有酶和菌种的陶瓷膜置于pH为8，质量分数为1.2%的聚乙烯亚胺溶液浸泡15小时，溶液需没过陶瓷膜，过滤除去滤液、干燥制得固定化酶和固定化菌种。实施例2
制备羧肽酶水溶液，经过检测，酶活力单位为4000U/mL，用碳酸氢钠调节溶液pH为7.0。制备放线菌水溶液，控制菌种溶液中的活菌含量为12亿个/mL；将膜孔径为0.3μm的陶瓷膜放置于质量分数为6%的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡活化4小时，溶液需没过陶瓷膜。将1L羧肽酶水溶液、1L放线菌水溶液、1cm2陶瓷膜置于反应器内混合，搅拌1.5小时，在28℃条件下浸泡60小时，过滤除去溶液，制得吸附有酶和菌种的陶瓷膜。将吸附有酶和菌种的陶瓷膜置于pH为8.5，质量分数为1.3%的聚乙烯亚胺溶液浸泡18小时，溶液需没过陶瓷膜，过滤除去滤液、干燥制得固定化酶和固定化菌种。
实施例3
制备胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶混合水溶液，经过检测，酶活力单位为4500U/mL，用碳酸氢钠调节溶液pH为7.5。制备双岐菌、乳酸菌、好氧芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌混合水溶液，控制菌种溶液中的活菌含量为15亿个/mL；将膜孔径为0.5μm的陶瓷膜放置于质量分数为8%的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡活化5小时，溶液需没过陶瓷膜。将100L酶溶液、100L菌种溶液、100cm2陶瓷膜置于反应器内混合，搅拌2小时，在30℃条件下浸泡65小时，过滤除去溶液，制得吸附有酶和菌种的陶瓷膜。将吸附有酶和菌种的陶瓷膜置于pH为9，质量分数为1.5%的聚乙烯亚胺溶液浸泡20小时，溶液需没过陶瓷膜，过滤除去滤液、干燥制得固定化酶和固定化菌种。
以下是利用实施例3中制得的固定化酶和固定化菌种对广西沃鑫公司提供的糖厂滤泥过滤后污水处理实验数据，见表1：
表1固定化酶和固定化菌种对污水处理效果
| PH | COD（mg/L） | BOD（mg/L） | |
| 处理前 | 6.8 | 3.58×104 | 2.04×104 |
| 处理后 | 7 | 565 | 58.5 |
以下是利用实施例3中制得的固定化酶和固定化菌种对广西农垦思源酒业有限公司的污水的处理实验数据，见表2：
表2固定化酶和固定化菌种对污水处理效果
| PH | COD（mg/L） | BOD（mg/L） | |
| 处理前 | 5～6 | 2.5×104 | 1.82×104 |
| 处理后 | 6.9 | 447 | 41.7 |
Claims (7)
1.一种制备固定化酶和固定化菌种的方法，包括以下步骤：
（1）制备酶溶液：控制酶溶液的酶活力单位大于3000U/mL，pH为6.5～7.5；
（2）制备菌种溶液；控制菌种溶液中的活菌含量为10～15亿个/mL；
（3）陶瓷膜吸附酶和菌种：以十二烷基硫酸钠为活化剂，将陶瓷膜浸泡于活化剂溶液中，活化3～5小时，将制得的酶溶液、菌种溶液、已活化的陶瓷膜置于反应器内混合，搅拌1～2小时，浸泡58～65小时，过滤除去溶液，制得吸附有酶和菌种的陶瓷膜；
（4）制备交联剂溶液：以聚乙烯亚胺为交联剂配置交联剂溶液，调节pH为8～9；
（5）将吸附有酶和菌种的陶瓷膜加入交联剂溶液浸泡15～20小时，过滤除去滤液、干燥制得固定化酶和固定化菌种。
2.根据权利要求1所述的制备固定化酶和固定化菌种的方法，其特征在于：步骤（1）或（3）中所述的酶至少含有胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备固定化酶和固定化菌种的方法，其特征在于：步骤（2）或（3）中所述的菌种至少含有双岐菌、乳酸菌、好氧芽孢杆菌、光合细菌、酵母菌、放线菌、醋酸菌中的一种。
4.根据权利要求1所述的制备固定化酶和固定化菌种的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的活化剂溶液的质量分数为4%～8%。
5.根据权利要求1所述的制备固定化酶和固定化菌种的方法，其特征在于：步骤（3）中每平方厘米的陶瓷膜需加入的酶、菌种溶液的总体积为2L，其中酶溶液、菌种溶液加入体积比为1：1，陶瓷膜孔径0.1μm～0.5μm。
6.根据权利要求1所述的制备固定化酶和固定化菌种的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的浸泡温度为25℃～30℃。
7.根据权利要求1所述的制备固定化酶和固定化菌种的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的交联剂溶液的质量分数为1.2%～1.5%。
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