CN105063010A - 一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法，属于固定化酶技术领域，利用聚乙烯亚胺与金属离子配位固定甘油脱氢酶、辅酶氧化酶，以及甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶，在固定化过程中聚乙烯亚胺分子通过亚胺与金属离子的配位作用，形成网状的聚乙烯亚胺骨架，配位在聚乙烯亚胺上的金属离子与甘油脱氢酶、辅酶氧化酶的C端组氨酸标签，以及甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的C端组氨酸标签形成配位键，获得固定化多酶体系。金属离子在固定化过程中起配位交联作用，并可提高多酶体系的催化效率。本发明的优点在于多酶耦联效率高、制备条件温和、工艺简单易行。所得固定化酶具有固定化率高，活性回收率高，能够明显提高温度稳定性、重复使用稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法。
背景技术
二羟基丙酮(Dihydroxyacetone)广泛应用于医药、农药中间体的制备，可用来合成杂环化合物、甘油三酯、酮位取代化合物。二羟基丙酮可作防晒化妆品的组成成分。在微生物代谢转化甘油为二羟基丙酮的氧化途径中，甘油在依赖于NAD+的甘油脱氢酶(Glyceroldehydrogenase，简称GDH，EC1.1.1.6)的作用下形成二羟基丙酮。甘油脱氢酶在医学诊断分析中也得到广泛应用，例如用于酶法分析血脂含量。
在氧化还原酶催化过程中，辅酶的再生利用至关重要，在二羟基丙酮的酶法生产中，使用辅酶氧化酶辅助辅酶再生，可以实现辅酶的循环利用，从而降低酶法生产二羟基丙酮的成本。利用固定化多酶耦联体系催化合成二羟基丙酮，较微生物发酵法和化学法具有反应效率高，操作简易，有利于连续反应和下游分离等优点，有利于此技术的工业化推广。
聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，简称PEI)是一种水溶性聚胺，大分子链上具有大量氨基。当pH<10时，其分子链上的氨基多处于质子化状态，是一种带正电荷的聚电解质。大部分酶在pH<10时带负电，因此聚乙烯亚胺在该条件下对酶分子具有静电吸附作用，从而实现固定化。Palomo等人曾用聚乙烯亚胺修饰的Sepabeads树脂固定化脂肪酶用于扁桃酸甲酯的水解，结果表明固定化酶的对映体选择性优于游离酶；CesarMateo等人用聚乙烯亚胺制备可以重复回收使用的固定化载体，实现酶的可逆固定化。
基于静电相互作用的聚乙烯亚胺固定化酶的方法作用力较弱，需增强酶与PEI之间的作用力。戊二醛是传统的固定化方法中采用较为广泛的交联剂，应用于脂肪酶、蛋白酶、半乳糖苷酶等的固定化上。由于戊二醛交联形成共价键，对于易失活的氧化还原酶容易造成酶活性大幅度下降。
发明内容
本发明利用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶，以及甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶，人工构建体外多酶耦联体系，提高多酶体系的稳定性与催化效率，并且实现辅酶的循环再生。包括以下步骤：
1)工程菌的构建：构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因、带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因，并利用上述两基因构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶基因，用BamHⅠ和xholⅠ分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌(DH5α)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达甘油脱氢酶、可表达辅酶氧化酶、可表达甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的工程菌；
2)粗酶液制备：将步骤1)得到的工程菌接种到含有氨苄霉素的LB培养基中培养，培养一段时间后加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(简称IPTG)；培养所得发酵液在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；超声破碎，将破碎液离心，收集上清液即为粗酶液；
3)纯酶的制备：采用镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化并利用Tris-HCl缓冲液(pH6.5～8.0)超滤除盐，得到甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶；
4)聚乙烯亚胺-金属溶液制备：配置浓度为5～200mg/ml的聚乙烯亚胺溶液，向该溶液中加入金属盐溶液并使其终浓度为0.05～50mmol/L，配成混合溶液，4℃保温0.5～4h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的酶浓度为0.05mg/ml～10mg/ml的酶溶液加入至步骤4)中获得的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，冲洗，重悬于0.05M的pH7.0的Tris-HCl缓冲液或0.05～0.1M的pH8.0～10.0的氨水-氯化铵缓冲液中，即得聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。
其中，所述步骤1)中，带有组氨酸标签的甘油脱氢酶、带有组氨酸标签的辅酶氧化酶、带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。
其中，所述步骤1)中，接种量为1～3％，所述的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/L，酵母粉1.0～10.0g/L，NaCl0.0～15.0g/L，接种前添加氨苄霉素使其终浓度为50～150μg/mL；所述培养条件为：起始pH7.0～7.5，培养温度37℃，150～250转/分钟培养4～6h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养1.5～3h；培养所得的发酵液，在冷冻离心机中4℃，8000rpm离心15min获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-盐酸缓冲液(pH6.5～8.0)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，获得细胞，配置浓度为50～150g/L的细胞液，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1厘米，功率200W，超声2秒，间隔4秒，超声20～60次。然后4℃、12000rpm将破碎液离心15min去除不溶性细胞碎片，收集上清即为粗酶液。
其中，所述步骤3)中，纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrapHP镍柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐，除盐后获得的液体即为纯酶溶液。
其中，所述步骤4)中，聚乙烯亚胺包括分子量20～500KDa的直链PEI(优选为分子量为22KDa，87KDa，217KDa)与分子量20～500KDa的支链PEI(优选分子量为25KDa，187KDa)两种。
其中，所述步骤4)中，使用的金属盐为CuCl2、NiCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、CoCl2、TiCl4。
一种根据上述的制备方法所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。
本发明的有益效果如下：
本发明选用聚乙烯亚胺作为固定化骨架，利用金属离子在聚乙烯亚胺分子以及重组酶的组氨酸标签之间的配位作用力，实现酶的高效稳定固定化，从而制备聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。金属离子不仅在固定化过程中起配位交联作用，还可提高多酶体系的催化效率。本发明所获得的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系具有操作方法简单，固定化迅速，温度稳定性高及重复使用稳定性好等优点，并能提高酶的催化能力和多酶体系的协同作用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明实施例一所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化辅酶氧化酶的表面扫描电镜(SEM)图。
图2为本发明实施例一所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化辅酶氧化酶的温度稳定性实验变化图，其中横坐标为时间，纵坐标为相对酶活，NOX+Mn2++PEI为聚乙烯亚胺金属配位固定化辅酶氧化酶，NOX为游离酶。
图3为本发明实施例二所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶的表面扫描电镜(SEM)图。
图4为本发明实施例二所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶的温度稳定性实验变化图，其中横坐标为时间，纵坐标为相对酶活，PEI+Mn2++GDH为聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶，GDH为游离酶。
图5为本发明实施例三所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多酶耦联体系的表面扫描电镜(SEM)图。
图6为本发明实例三所制备的聚乙烯亚金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多酶耦联体系与游离酶体系催化甘油生产二羟基丙酮的转化率对比图，其中纵坐标为转化率，PEI-Mn-GDH-NOX为聚乙烯亚金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多酶耦联体系，Freecoupling为游离酶体系。
图7为本发明实施例四所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的表面扫描电镜(SEM)图。
图8为本发明实例四所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系与游离酶体系催化甘油生产二羟基丙酮的转化率对比图，其中纵坐标为转化率，PEI-Ca-GDH-NOX为聚乙烯亚金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，Freecoupling为游离酶体系。
图9为本发明所使用的二羟基丙酮标准工作曲线。
图10为本发明所使用的甘油检测的液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1
1)工程菌的构建：PCR法构建如SEQIDNO.2所述的带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因，用BamHⅠ和xholⅠ分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌(DH5α)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达辅酶氧化酶NOX的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a；所述辅酶氧化酶基因的原始序列来源于Lactobacillusbrevis；
2)粗酶液制备：以1％的接种量，将工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a接种到200mL含有氨苄青霉素的LB培养基中；LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/LNaCl，接种前添加氨苄霉素使其终浓度为50～150μg/mL，培养条件为：起始pH7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小后加入诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养2小时；培养所得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞，配制成浓度为50～150g/L的细胞液，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W，然后4℃、12,000rpm将破碎液离心15min去除不溶性细胞碎片，收集上清液即为粗酶液；
3)辅酶氧化酶的纯酶的制备：采用GE公司的HisTrap镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化，所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签(即组氨酸标签)的蛋白质的HisTrapHP镍柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用pH6.5～8.0的Tris-HCl缓冲液、PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐，得到辅酶氧化酶；
4)聚乙烯亚胺-金属溶液制备：配置浓度为25mg/ml的直链PEI(分子量为22KDa)溶液，向该溶液中加入氯化锰溶液并使其终浓度为1mmol/L，配成混合溶液，4℃保温0.5h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化辅酶氧化酶体系制备：将含有0.75mg/ml步骤3)中得到的辅酶氧化酶的Tris-HCl(0.05M，pH7.0)酶溶液以1:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化辅酶氧化酶，其包埋率为91.4％，辅酶氧化酶活性为1.84U/mg，相对于游离酶活性提高了18.6％，其SEM形态见图1。
6)酶活力的检测方法：辅酶氧化酶的活性测定反应体系包含0.2mmol/LNADH、0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)，37.5℃下测定340nm处的吸光度变化。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmolNADH所需要的酶量为一个酶活力单位。
将游离酶与步骤5)中得到的固定化辅酶氧化酶分别在37.5℃的条件下测试酶的热稳定性，每隔一段时间取样，迅速冷却到室温，取出10μL保温过的酶液测定酶的残余活力，以游离酶的初始酶活为100％，得到相对酶活的变化曲线。结果见图2，可以看出固定化辅酶氧化酶的稳定性明显得到了提高。
实施例2
1)工程菌的构建：PCR法构建如SEQIDNO.1所述的带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因，用BamHⅠ和xholⅠ分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌(DH5α)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达甘油脱氢酶GDH的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a；所述甘油脱氢酶基因的原始序列来源于Klebsiellapneumonia；
2)粗酶液制备：以1％的接种量，将工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a接种到200mL含有氨苄青霉素的LB培养基中；LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/LNaCl，接种前添加氨苄霉素使其终浓度为50～150μg/mL，培养条件为：起始pH7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养2小时；培养所得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞，配制成浓度为50～150g/L的细胞液，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W，然后4℃、12,000rpm将破碎液离心15min去除不溶性细胞碎片，收集上清液即为粗酶液；
3)甘油脱氢酶的纯酶的制备：采用GE公司的HisTrap镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化，所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrapHP镍柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用pH6.5～8.0的Tris-HCl缓冲液、PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐，得到甘油脱氢酶；
4)聚乙烯亚胺-金属溶液制备：配置浓度为50mg/ml的直链PEI(分子量为87KDa)溶液，向该溶液中加入氯化锰溶液并使其终浓度为0.25mmol/L，配成混合溶液，4℃保温4h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化甘油脱氢酶体系制备：将含有0.375mg/ml步骤3)中得到的甘油脱氢酶的Tris-HCl(0.05M，pH7.0)酶溶液以1:1的比例加入步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶，其包埋率为87.7％，甘油脱氢酶活性为4.75U/mg，相对于游离酶活性提高了80.5％，其SEM形态见图3。
6)酶活力的检测：甘油脱氢酶的活性测定反应体系包括30.0mmol/L(NH4)2SO4、0.2mol/L甘油、2.0mmol/LNAD+、0.1mol/L碳酸钾缓冲溶液(pH12.0)，37.5℃下测定340nm处的吸光度变化。将游离酶与步骤5)中得到的固定化甘油脱氢酶分别在37.5℃的条件下测试酶的热稳定性，每隔一段时间取样，迅速冷却到室温，取出10μL保温过的酶液测定酶的残余活力，以游离酶的初始酶活为100％，得到相对酶活的变化曲线。结果见图4，可以看出固定化甘油脱氢酶的稳定性明显得到了提高。
实施例3
1)工程菌的构建：利用实施例1中的带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因、实施例2中的带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因，采用重叠PCR法构建如SEQIDNO.3所述的带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶基因，用BamHⅠ和xholⅠ分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌(DH5α)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a；
2)粗酶液制备：以1％的接种量，将工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a接种到200mL含有氨苄青霉素的LB培养基中；LB培养基的组成为10.0g/L胰蛋白胨，5.0g/L酵母粉，10g/LNaCl，接种前添加氨苄霉素使其终浓度为50～150μg/mL，培养条件为：起始pH7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为10mg/ml，继续在30℃、200rpm条件下培养2小时；培养所得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞，配制成浓度为50～150g/L的细胞液，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W，然后4℃、12,000rpm将破碎液离心15min去除不溶性细胞碎片，收集上清液即为粗酶液；
3)甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的纯酶的制备：采用GE公司的HisTrap镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化，所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged标签的蛋白质的HisTrapHP镍柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用pH6.5～8.0的Tris-HCl缓冲液、PALL公司的10K的超滤离心管进行超滤除盐，得到甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为200mg/ml的直链PEI(分子量217KDa)溶液，向该溶液中加入氯化锰溶液并使其终浓度为50mmol/L，配成混合溶液，4℃保温4h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶体系制备：将含有浓度为0.25mg/ml的步骤3)中得到的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)酶溶液以1:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多酶耦联体系，甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的包埋率为97.6％，甘油脱氢酶酶活为12.8U/mg，辅酶氧化酶酶活为1.7U/mg，其SEM形态见图5。
6)利用催化甘油生产二羟基丙酮检测酶活性的方法：
原理：二羟基丙酮有还原性，在煮沸条件下，可以与磷钼酸试剂发生反应，生成钼蓝，使溶液呈蓝色，其颜色深度与二羟丙酮的浓度成正比，可以用比色法时行定量测定。
标准曲线的制备：分别吸取各标准浓度二羟丙酮(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.4mg/mL)100μL于1.5mL离心管，然后分别加入100μL磷钼酸试剂，置于100℃水浴箱加热15min。取20μL显色液加入200μL去离子水中，在630nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，二羟丙酮浓度为横坐标绘制标准曲线，其线性回归方程为：y＝9.5429x+0.0454，R2＝0.9989(图9)。
底物甘油的浓度用高效液相色谱检测，色谱条件为：Aminex-HPX-87H色谱柱(Bio-rad)，流动相为5mmol/L的硫酸溶液(用娃哈哈纯净水配制)，流动相流速为0.5mL/min，柱温65℃，示差折光检测器，检测器温度45℃，进样量20μL，色谱图见图10。
催化甘油生产二羟基丙酮：反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，实验结果见图6，可以看出固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多酶耦联体系的转化率为73.2％，游离酶体系为32.5％，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶多酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
实施例4
1)工程菌的构建：采用实施例2中制备的可表达甘油脱氢酶GDH的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a和实施例1中制备的可表达辅酶氧化酶NOX的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a；
2)～3)实验步骤如实施例1和2的步骤2)～3)，制备得到甘油脱氢酶和辅酶氧化酶；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为5mg/ml的支链PEI(分子量187KDa)溶液，向该溶液中加入氯化钙溶液并使其终浓度为0.05mmol/L，配成混合溶液，4℃保温2h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓度均为0.2mg/ml的Tris-HCl(0.05M，pH7.0)酶溶液以4:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为85.6％和94.5％，酶活分别为5.54U/mg和2.39U/mg，相比于游离酶活性分别提高了110.7％和54.2％，其SEM形态见图7。
6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实施例3，反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，实验结果见图8，可以看出固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为65.2％，游离酶体系为27.0％，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
实施例5
1)～3)实验步骤如实施例4的步骤1)～3)；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为5mg/ml的支链PEI(分子量25KDa)溶液，向该溶液中加入氯化铜溶液并使其终浓度为0.5mmol/L，配成混合溶液，4℃保温2h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓度均为0.5mg/ml的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)酶溶液以2:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为92.3％和94.3％，酶活分别为1.48U/mg和0.27U/mg。
6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实施例3，反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为78.8％，游离酶体系为27.0％，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
实施例6
1)～3)实验步骤如实施例4的步骤1)～3)；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为100mg/ml的直链PEI(分子量217KDa)溶液，向该溶液中加入氯化镍溶液并使其终浓度为50mmol/L，配成混合溶液，4℃保温4h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓度均为10mg/ml的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)酶溶液以1:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为85.8％和98.6％，酶活分别为6.42U/mg和0.30U/mg。
6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实施例3，反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为98.6％，游离酶体系为27％，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
实施例7
1)～3)实验步骤如实施例4的步骤1)～3)；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为5mg/ml的支链PEI(分子量25KDa)溶液，向该溶液中加入氯化镁溶液并使其终浓度为25mmol/L，配成混合溶液，4℃保温2h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓度均为5mg/ml的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)酶溶液以2:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于氨水-氯化铵(0.1M，pH8.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为95.5％和91.6％，酶活分别为2.25U/mg和0.46U/mg。
6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实施例3，反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为98.2％，游离酶体系为27.0％，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
实施例8
1)～3)实验步骤如实施例4的步骤1)～3)；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为5mg/ml的直链PEI(分子量22KDa)溶液，向该溶液中加入氯化锌溶液并使其终浓度为0.5mmol/L，配成混合溶液，4℃保温1h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓度均为0.05mg/ml的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)酶溶液以1:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于氨水-氯化铵(0.05M，pH10.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为87.5％和90.1％，酶活分别为7.45U/mg和1.29U/mg。
6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实施例3，反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为32.3％，游离酶体系为27.0％。
实施例9
1)～3)实验步骤如实施例4的步骤1)～3)；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为100mg/ml的直链PEI(分子量217KDa)溶液，向该溶液中加入氯化钛溶液并使其终浓度为20mmol/L，配成混合溶液，4℃保温3h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓度均为0.5mg/ml的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)酶溶液以2:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为94.7％和88.6％，酶活分别为4.56U/mg和1.99U/mg。
6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实施例3，反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为92.5％，游离酶体系为27％，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
实施例10
1)～3)实验步骤如实施例4的步骤1)～3)；
4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为50mg/ml的支链PEI(分子量187KDa)溶液，向该溶液中加入氯化钴溶液并使其终浓度为10mmol/L，配成混合溶液，4℃保温3h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓度均为1mg/ml的Tris-HCl(0.1M，pH7.0)酶溶液以2:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于氨水-氯化铵(0.1M，pH9.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为83.2％和78.5％，酶活分别为4.01U/mg和1.48U/mg。
6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实施例3，反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30℃，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为87.5％，游离酶体系为27％，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (5)
1.一种聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)工程菌的构建：构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因、带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因，并利用上述两基因构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶基因，用BamHⅠ和xholⅠ分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌(DH5α)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达甘油脱氢酶、可表达辅酶氧化酶、可表达甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的工程菌；
2)粗酶液制备：将步骤1)得到的工程菌接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，培养一段时间后加入诱导剂IPTG；培养所得发酵液离心获得细胞，配制成细胞液；超声破碎，将破碎液离心，收集上清液即为粗酶液；
3)纯酶的制备：采用镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化并利用pH6.5～8.0的Tris-HCl缓冲液超滤除盐，得到甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶；
4)聚乙烯亚胺-金属溶液制备：配置浓度为5～200mg/ml的聚乙烯亚胺溶液，向该溶液中加入金属盐溶液并使其终浓度为0.05～50mmol/L，配成混合溶液，4℃保温0.5～4h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH8.0～10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的酶浓度为0.05mg/ml～10mg/ml的酶溶液以1～4:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，形成固定化颗粒，离心分离，冲洗，重悬于0.05M的pH7.0的Tris-HCl缓冲液或0.05～0.1M的pH8.0～10.0的氨水-氯化铵缓冲液中，即得聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。
2.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因、带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因、带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶基因的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。
3.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，聚乙烯亚胺是分子量范围为20～500kDa的直链或支链的聚乙烯亚胺。
4.如权利要求1所述的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，使用的金属盐为CuCl2、NiCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、CoCl2、TiCl4。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系的制备方法所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。
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