CN111235140A

CN111235140A - 固定化酶、其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN111235140A
Application number: CN202010353558.3A
Authority: CN
Inventors: 洪浩; 詹姆斯·盖吉; 肖毅; 张娜; 罗杰斯卡·维亚撒·威廉姆斯; 崔瑜霞; 赵佳东; 高妍妍; 傅涵
Original assignee: Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Current assignee: Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2040-04-29
Also published as: WO2021217774A1; US20230108483A1; CN111235140B; EP4144842A1; KR20230006885A; EP4144842A4; JP2023523363A; CN111826370A

Abstract

本发明提供了一种固定化酶、其制备方法及其应用。该固定化酶包括活化的PEI以及共价结合在活化的PEI上的酶，酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。通过将酶与PEI固定，将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间，提高了机械稳定性，实现了酶的固定化，而且避免了在固定化过程中酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。

Description

固定化酶、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及其应用。

背景技术

微生物细胞或分离的酶或工程酶的应用使得生物催化取得了重大进展，且使得制造方式发生了转变。许多种类的酶如酰基转移酶、酰胺酶、转氨酶、酮还原酶、氧化酶、单加氧酶及水解酶等被用于生产涉及抗生素、除草剂、医药中间体和新时代治疗剂的反应中。

当游离酶用作生物催化剂时，会有很大的酶浪费，因为回收水溶性酶非常困难。而水不溶性固定化酶，在每个循环后，通过非常简单的过滤就可以容易地回收。

大家熟知的是，采用载体或支撑物来对自由酶进行固定化。然而固相载体存在成本高及量转移受限的缺陷，而且，制备载体或支撑物，尤其是聚合物树脂，会引起严重的污染环境。大多的固相载体固定化酶方法存在固有的缺陷：酶负载少及酶特异性低。克服该缺陷的一种方法是通过纯化酶来避免污染蛋白或酶的负载，但酶的纯化成本也很高，进一步增加了固定化生物催化剂的成本。

现有已经报道了对脂肪酶（Lipase）、青霉素酰化酶（penicillin acylase）、蛋白酶（protease）、氨基酰化酶（aminoacylase）等酶的无载体固定化方法。然而无载体支持，不含载体的固定化酶由于较低的机械稳定性不能对抗剪切力和搅拌条件，而且还会引起过滤问题，因而不能充分满足于大批量生产。

而且，不含载体的固定化酶方法也不适用于某些敏感性的酶，比如转氨酶（TA）,酮还原酶（KRED）、单加氧酶（CHMO）、氨裂解酶（PAL）、烯还原酶（ERED）、亚胺还原酶（IRED）、氨基酸脱氢酶（AADH）及腈水解酶（Nitrilase）。

因此，有必要开发不含载体的固定化酶方法，以提高敏感性酶活性及其循环利用率。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种固定化酶、其制备方法及其应用，以解决现有技术中难以实现对敏感性酶的活性及其循环利用的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括活化的阳离子聚合物以及共价结合在活化的所述阳离子聚合物上的酶，活化的阳离子聚合物为经辅因子或交联剂活化的PEI，交联剂为多元醇处理或未处理的交联剂；酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。

进一步地，转氨酶来源于B.thuringiensis、Arthrobacter citreus或Chromobacterium violaceum DSM30191；优选地，酮还原酶来源于Acetobacter sp. CCTCCM209061或Candida macedoniensis. AKU4588；优选地，单加氧酶为来源于Brachymonas petroleovorans或Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶；优选地，氨裂解酶来源于photorhabdus luminescens或Solenostemon scutellarioides的苯丙氨酸氨裂解酶；优选地，烯还原酶来源于Saccharomyces cerevisiae或Chryseobacterium sp. CA49；优选地，亚胺还原酶来源于Streptomyces sp.或Bacillus cereus；优选地，氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶或来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；优选地，腈水解酶来源于Aspergillus niger CBS 513.88或Neurospora crassa OR74A。

进一步地，PEI的分子量为3 KDa~600 KDa；优选地，固定化酶中酶与PEI的质量比为0.1~1.5：1，更优选地，质量比为0.2~1：1。

进一步地，辅因子为PLP、NAD或NADP，交联剂为戊二醛；优选地，多元醇为PEG，更优选，PEG为PEG400~6000。

进一步地，固定化酶中还包括酶的辅因子，辅因子共价结合与PEI上，优选辅因子为PLP、NAD或NADP。

进一步地，酶为一种或多种，辅因子为一种或多种，一种或多种辅因子与一种或多种酶相对应，优选地，固定化酶中辅因子与PEI的质量比为1~80 : 120，更优选为1~60 :100。

根据本申请的第二个方面，提供了一种固定化酶的制备方法，该制备方法包括：利用活化剂对阳离子聚合物进行活化，得到活化的阳离子聚合物；将酶与活化的阳离子聚合物固定，得到固定化酶；其中，活化剂为多元醇未修饰的交联剂、多元醇修饰的交联剂或辅因子；酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。

进一步地，在利用活化剂对PEI进行活化之前，制备方法还包括对PEI进行预处理的步骤，优选地，预处理包括：用纯水将PEI稀释至终浓度为1 g/100mL~8 g/100mL，更优选为1 g/100mL~5 g/100mL，得到稀释PEI；调节稀释PEI的pH为5~11，更优选为7.0~10.0，得到预处理后的PEI。

进一步地，酶是沉淀酶，交联剂为戊二醛，活化剂为戊二醛或PEG修饰的戊二醛；优选地，预处理的步骤中，调节稀释PEI的pH为5.0~11.0，优选为7.0~10.0，得到预处理后的PEI；更优选地，利用活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：向预处理后的PEI中滴加戊二醛或PEG修饰的戊二醛，并控制体系中戊二醛或者PEG修饰的戊二醛的终浓度为0.1 g/100mL~4g/100mL，优选为0.3 g/100mL~2 g/100mL，得到活化PEI。

进一步地，沉淀酶通过采用沉淀剂对酶进行沉淀得到，沉淀剂选自有机溶剂、硫酸铵、PEG400~6000或者分子量为3 KDa~70 KDa 的PEI。

进一步地，在向预处理后的PEI中滴加戊二醛或PEG修饰的戊二醛的过程中，控制戊二醛或PEG修饰的戊二醛的滴加速度为10~50 mL/min，优选地，在滴加的过程中，还包括搅拌的步骤，优选搅拌的温度为4~25℃，搅拌的速度为50~400 rpm，进一步优选为100~300rpm，搅拌的时间为1~12 h，进一步优选为2~10 h。

进一步地，将酶与活化PEI结合，得到固定化酶包括：向沉淀酶中滴加活化PEI，得到混合物；对混合物依次进行静置、离心、过筛和干燥处理，得到固定化酶；优选地，酶与活化PEI的质量比0.2~1：1；优选地，静置的时间为1~5小时；优选地，过筛为过20~50目筛；优选地，干燥为自然晾干，更优选为过夜晾干；优选地，在对混合物进行干燥之后，以及得到PEI固定化酶之前，制备方法还包括：依次用磷酸盐缓冲液、水及磷酸盐缓冲液对干燥后的混合物进行清洗的步骤，每种清洗重复3~5次，磷酸盐缓冲液的pH为7.0~8.0。

进一步地，酶是游离酶，活化剂为辅因子，辅因子为PLP、NAD或NADP；优选地，预处理的步骤中，采用纯化水调节稀释PEI的浓度为1 g/100mL~8g/100mL，优选为1 g/100mL~3g/100mL，pH为6~11，更优选地，pH为8.0~11.0，得到预处理后的PEI；更优选地，利用活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：向预处理后的PEI中加入辅因子，并控制辅因子的终浓度为0.3~20 mg/mL，进一步优选辅因子终浓度为1~10 mg/mL，然后搅拌10~600 min，更优选搅拌30~180 min，得到活化PEI。

进一步地，游离酶为一种酶的酶液或多种酶的混合液，辅因子为多种酶对应的辅因子。

进一步地，将酶与活化PEI固定，得到固定化酶的步骤包括：在4~25 ℃下，向游离酶酶液中滴加活化PEI，得到PEI吸附酶；向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶；优选地，游离酶的浓度0.05~0.3 g/mL；优选地，PEI与游离酶的质量比为0.2~1：1。

进一步地，向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶包括：向PEI吸附酶中滴加交联剂，并控制交联剂的终浓度为0.2 g/100mL~1 g/100mL，得到待固定化物；对待固定化物依次进行静置、离心以及干燥，得到干燥酶；对干燥酶进行清洗，得到固定化酶；优选地，静置的时间是10~300 min，进一步优选为30~120min，干燥为自然晾干，清洗是依次采用磷酸盐缓冲液清洗3~5次、水清洗3~5次及磷酸盐缓冲液清洗3~5次，磷酸盐缓冲液包含NaCl，其中NaCl的浓度为0.5~1M。

根据本申请的第三个方面，提供了上述任一种固定化酶或者上述任一种制备方法制备得到的固定化酶在生物催化反应中的应用。

进一步地，生物催化反应为批次反应或连续化反应。

应用本发明的技术方案，通过将酶与PEI固定，将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间，提高了机械稳定性，实现了酶的固定化，而且避免了在固定化过程中，酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，现有技术虽然已经有报道一些无载体支持的固定化酶，但不适合敏感性的酶，因此，仍需要开发新的固定化方式，以提高敏感性酶的活性及其循环利用效率。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种固定化酶，该固定化酶包括活化的阳离子聚合物以及共价结合在活化的阳离子聚合物上的酶，活化的阳离子聚合物为经辅因子或交联剂活化的PEI，交联剂为多元醇处理或未处理的交联剂，酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。

本申请的固定化酶中，酶与酶之间，以及酶与PEI之间形成网状结合，提高了机械稳定性，不仅实现了酶的固定化，而且能够提高敏感性酶的活性、稳定性及循环利用次数。

上述固定化酶中，PEI即Polyethylene imine，简称PEI，聚乙烯亚胺，又称聚氮杂环丙烷，是一种水溶性高分子聚合物，溶于水和乙醇，不溶于苯。市售品通常为20%~50%浓度的水溶液。PEI最初报道被用来作为一种多聚阳离子型非病毒载体，因其价格低廉、体内外转染效果好，且具有使用方便、可大规模生产以及无免疫原性等优点，因而在作为药物的非病毒载体方面受到极大关注。PEI聚合物含有多个氨基，可与戊二醛交联反应产生各种多聚网状的纳米结构。这种网状结构中分散有醛基、氨基等各官能团，能够与酶蛋白间通过共价作用、氢键作用、离子作用、以及疏水作用等多种方式结合，而不是像与单一的戊二醛那样仅仅是共价结合，共价键作用极易破坏酶的活性。

因此本申请的上述固定化酶，通过将酶与PEI固定，将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间，实现了酶的固定化，而且避免了在固定化过程中，酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。上述PEI的具体分子量并无特殊限定，只要能够实现对酶的固定化即可。在本申请一种优选的实施例中，PEI的分子量为3 KDa~600 Kda。PEI的具体分子量大小，可以根据所固定酶种类的不同进行合理优化选择，在上述分子量范围内，对现有酶类的固定化效果相对更好。

上述固定化酶中，酶与PEI可以根据具体酶种类的不同合理调整质量比。在一种优选的实施例中，固定化酶中酶与PEI的质量比为0.1~1.5：1，优选地，质量比为0.2~1：1。在0.1~1.5：1的质量比范围内，使得固定化酶的循环利用次数较高，而质量比在0.2~1：1范围内，固定化酶的循环利用次数更高。

上述辅因子为PLP、NAD或NADP，交联剂为戊二醛；优选地，多元醇为PEG，更优选，PEG为PEG400~6000。

上述固定化酶，可以是单一酶的固定化，也可以是多种酶的固定化。当多种酶固定化时，可以是主酶和辅酶的共固定化。在本申请一种优选的实施例中，固定化酶中还包括酶的辅因子，辅因子共价结合与PEI上，优选辅因子为PLP、NAD或NADP。主酶和辅酶的共固定化酶，具有催化活性稳定，循环利用次数高的效果。

如上述，本申请的固定化酶中的酶可以为一种或多种，相应地，辅因子也为一种或多种，一种或多种辅因子与一种或多种酶相对应。优选地，固定化酶中辅因子与PEI的质量比为1~80 : 120，更优选为1~60 : 100。

当两种或两种以上的酶具有不同的辅因子时，固定化酶中包含各自酶的不同的辅因子；当两种或两种以上的酶具有相同的辅因子时，固定化酶中所包含的辅因子的用量根据与各种不同主酶的用量进行合理配比。根据具体辅因子用量的不同，相应的PEI的用量也有所不同。

在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种固定化酶的制备方法，该制备方法包括：利用活化剂对阳离子聚合物进行活化，得到活化的阳离子聚合物；将酶与活化的阳离子聚合物固定，得到固定化酶；其中，活化剂为多元醇未修饰的交联剂、多元醇修饰的交联剂或辅因子，酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。

上述固定化酶的制备方法，通过先采用戊二醛或辅因子对PEI进行活化之后，再与酶结合即可得到固定化酶。该方法简单且在固定过程中不容易影响酶的活性，从而使得固定化酶的活性高，稳定性好，循环利用次数多。

为了更有效地对PEI进行活化，在本申请一种优选的实施例中，在利用活化剂对PEI进行活化之前，该制备方法还包括对PEI进行预处理的步骤，更优选地，该预处理包括：用纯水将PEI稀释至终浓度为1g/100mL~8g/100mL，进一步优选为1g/100mL~5g/100mL，得到稀释PEI；调节稀释PEI的pH为5~11，更优选为7.0~10.0，得到预处理后的PEI。稀释的原因是：降低PEI的粘度和浓度，利于活化过程的进行，防止因浓度过高形成沉淀。调pH的目的是：过高或过低的pH会引起酶的变性失活，也会影响PEI上各级别氨基官能团与戊二醛的结合程度，过高的pH还容易导致在活化过程中形成沉淀。

上述制备方法中，根据酶具体是沉淀酶还是游离酶，其活化剂也不同，具体的制备步骤也略有差异。在一种优选实施例中，酶是沉淀酶，交联剂为戊二醛，活化剂为戊二醛或PEG化的戊二醛。更优选地，预处理的步骤中，调节稀释PEI的pH为5.0~11.0，优选为7.0~10.0，得到预处理后的PEI。在一种更优选的实施例中，上述利用活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：向预处理后的PEI中滴加戊二醛或PEG化的戊二醛，并控制体系中戊二醛或PEG化的戊二醛的终浓度为0.1 g/100mL~4g/100mL，优选为0.3 g/100mL~2 g/100mL，得到活化PEI。

当酶是沉淀酶时，利用戊二醛或PEG化的戊二醛活化PEI，通过控制戊二醛或PEG化的戊二醛的浓度在上述优选的范围内，能够获得活化性能较佳的PEI，从而更有利于与酶有效结合。

戊二醛或PEG化的戊二醛活化PEI的步骤无特殊要求，只要控制戊二醛或PEG化的戊二醛对PEI的活性效率最佳即可。为了更充分、更均匀地对PEI进行活化，在一种优选的实施例中，在向预处理后的PEI中滴加戊二醛或PEG化的戊二醛的过程中，控制戊二醛或PEG化的戊二醛的滴加速度为10~50 mL/min，更优选地，在滴加的过程中，还包括搅拌的步骤，优选搅拌的温度为4~25℃，搅拌的速度为50~400rpm，进一步优选为100~300 rpm，搅拌的时间为1~12 h，进一步优选为2~10 h。

上述沉淀酶可采用现有方法形成，本申请中优选通过采用沉淀剂对酶进行沉淀得到，沉淀剂的选择包括但不仅限于有机溶剂（比如乙腈）、硫酸铵、PEG400~6000或者分子量为3 KDa~70 KDa 的PEI。更优选采用PEG400~6000或者分子量为3 KDa~70 KDa 的PEI获得沉淀酶。需要说明的是，当沉淀剂为3 KDa~70 KDa 的PEI时，由于沉淀酶中含有PEI，且在沉淀过程中实现了PEI与酶的物理吸附，因而此时可直接在戊二醛的交联作用下实现与酶的共价结合形成固定化酶。当然，如果此时与戊二醛活化的PEI进行反应，同样是沉淀酶聚集体经过交联剂的手臂作用与PEI共价结合，形成酶与酶之间，酶与PEI之间的网状结合。

而当沉淀酶为有机溶剂、硫酸铵、PEG400~6000等形成时，则需要与戊二醛活化的PEI结合。在一种优选实施例中，上述将酶与活化PEI结合，得到固定化酶的步骤包括：向沉淀酶中滴加活化PEI，并在滴加过程中控制pH值为5~11，优选地，7.0~9.0，得到混合物；对混合物依次进行静置、离心、过筛和干燥处理，得到固定化酶；更优选地，酶与活化PEI的质量比0.2~1：1。

当pH值在5~11的范围内时具有在保证酶活的基础上提高PEI与活化剂更牢固结合的有益效果，而控制滴加过程中控制pH值在7.0~9.0的范围内时具有对酶的活性最有益以及PEI与活化剂结合程度最佳且操作更容易的更优异的效果。酶与活化PEI的质量比在0.2~1：1范围内，能够获得不浪费酶的基础上得到活性最高的固定化酶的技术效果。

上述优选实施例中，静置的作用是使酶分子与活化的PEI之间的内部作用进一步加强形成机械强度更高的固定化酶。过筛使形成颗粒大小均一的固定化酶。在一种优选的实施例中，上述静置的时间为1~5小时；更优选地，过筛为过20~50目筛；更优选地，干燥为自然晾干，更优选为过夜晾干；更优选地，在对混合物进行干燥之后，以及得到PEI固定化酶之前，上述制备方法还包括：依次用磷酸盐缓冲液、水及磷酸盐缓冲液对干燥后的混合物进行清洗的步骤，每种清洗重复3~5次，磷酸盐缓冲液的pH为7.0~8.0，磷酸盐缓冲液中包括NaCl，其中，NaCl 的浓度为0.5~1 M。

上述优选实施例中，对混合物清洗采用磷酸盐缓冲液清洗能够防止清洗液对酶的活性造成不良影响。上述浓度和pH范围内的缓冲液不会影响酶的活性。

当酶是一种游离酶时，在一种优选的实施例中，酶是游离酶，活化剂为辅因子，辅因子为PLP、NAD或NADP。在上述辅因子的作用下，PEI被活化，活化PEI可有效吸附游离酶，之后可以在交联剂的作用下实现PEI与酶的交联固定。

在一种优选的实施例中，上述预处理的步骤，采用纯化水调节稀释PEI的浓度为1g/100mL~8g/100mL，优选为1 g/100mL~3 g/100mL，pH为6~11，优选pH为8.0~11.0，得到预处理后的PEI。针对游离酶将稀释PEI的浓度和pH在上述范围内，使得活化后的PEI有效官能团分布更有利于与酶分子的结合，固定化酶沉淀状态好，更利于从溶液中分离出来。

对于游离酶的固定化，在一种优选的实施例中，利用活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：向预处理后的PEI中加入辅因子，并控制辅因子的终浓度为0.3~20mg/mL，进一步优选辅因子终浓度为1~10 mg/mL，然后搅拌10~600 min，更优选搅拌30~180min，得到活化PEI。

控制辅因子的终浓度为在上述范围内，具有在不浪费辅因子的基础对PEI的活化程度最佳更利于后期和酶分子结合的效果。将加入的辅因子进行搅拌，利于充分实现辅因子对PEI的活化。

上述游离酶为一种酶的酶液或多种酶的混合液，相应地，辅因子为一种酶或多种酶对应的辅因子。

在一种优选的实施例中，将酶与活化PEI固定，得到固定化酶的步骤包括：在4~25℃下，向游离酶酶液中滴加活化PEI，得到PEI吸附酶；向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶；更优选地，游离酶的浓度0.05~0.3 g/mL；更优选地，活化PEI与游离酶的质量比为0.2~1：1。

将游离酶的浓度控制在0.05~0.3 g/mL范围内，有利于颗粒大小合适、分布均匀的固定化酶且固定化酶利于从溶液中分离出来的作用。活化PEI与游离酶的质量比控制在0.2~1：1范围内，有在不浪费游离酶的基础上形成获利回收最高的固定化酶的作用。

在一种优选的实施例中，向PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到PEI固定化酶包括：向PEI吸附酶中滴加交联剂，并控制交联剂的终浓度为0.2 g/100mL~1 g/100mL，得到待固定化物；对待固定化物依次进行静置、离心以及干燥，得到干燥酶；对干燥酶进行清洗，得到固定化酶；优选地，静置的时间是10~300 min，进一步优选为30~120min，干燥为自然晾干，清洗是依次采用磷酸盐缓冲液清洗3~5次、水清洗3~5次及磷酸盐缓冲液清洗3~5次，磷酸盐缓冲液包含NaCl，其中NaCl的浓度为0.5~1M。

控制交联剂的终浓度在0.2 g/100mL~1 g/100mL范围内，具有既能保证形成结合牢固的固定化酶且酶活回收最高的效果。此处静置、清洗等作用同前述。

在本申请第三种典型的实施例中，还提供了上述任一种固定化酶，或者上述任一种制备方法制备而成的固定化酶在生物催化反应中的应用。该固定化酶具有稳定性高，循环利用效率高的优势，因而在生物催化反应中可多次重复使用。

在一种更优选的实施例中，上述固定化酶所应用的生物催化反应为批次反应或连续化反应，更有选为连续化反应。固定化酶循环利用效率高，因而适合应用于连续化的生物催化反应，提高反应效率。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。

表1：

表2：部分酶的母本及其突变体的序列

表3：

表4：

表5：

表6：

上述酶所参与反应的化学过程简述如下：

上述反应式中的R，R1和R2可以各自独立的选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R1与其所连接的杂环形成稠环体系。

下列实施例中的PB代表磷酸缓冲液的意思。

实施例1：戊二醛活化的PEI共价固定化酶聚集体的制备（GA：Glutaraldehyde，PEI: Polyethylene imine，GP：GA activated PEI，戊二醛活化的PEI）

PEG 修饰的戊二醛：将戊二醛用水稀释至终浓度为20 g/100mL，并添加 2-10g/100mLPEG 2000 或 PEG 6000，室温下混合1-3 h 备用。

活化PEI溶液的制备1：100 mL水溶液中加入2 g戊二醛和4 g PEI（3-70 KDa），pH8.0，搅拌3 h。

活化PEI溶液的制备2：100 mL水溶液中加入4 g PEI（3 KDa），pH8.0，以及PEG修饰的戊二醛（戊二醛在溶液中的终浓度为2 g/100mL）搅拌3 h。

固定化：10 mL酶（酶蛋白含量为100-200 mg/mL，相应地包含3-10 mg/mL辅因子）置于圆底摇瓶中，冷却至5~10 °C后，混合10min。缓慢加入沉淀剂如硫酸铵（45%~65%）、乙醇(80%~90%)或PEI(20%~60%)，混合30-60 min，得到沉淀酶。向沉淀酶中滴加15 mL活化PEI溶液，混合10-30 min，静置1-2 h后离心。收集不溶性沉淀物，并过30目筛。自然环境下晾干后，用0.1 M PB （pH7.5，含 0.5 M NaCl)浸泡3小时，然后再用0.1 M PB（pH7.5）冲洗。

实施例2：辅因子活化的PEI共价固定化酶聚集体的制备

辅因子活化的PEI溶液制备：PEI (Mw=3-70 KDa) 用水稀释至PEI的终浓度为 1g/100mL~2 g/100mL，pH 值为 7.0~11.0。根据酶的需要，向PEI溶液中添加3-10 mg/mL 每种酶辅因子，室温下混合 30-60 min。

固定化：在4-10 ℃下，将7.5 mL辅因子活化的PEI溶液滴加到5 mL of 酶液中（酶蛋白含量30-80 mg/mL，相应地也包含辅因子），混合30-60 min后，加入交联剂戊二醛或者PEG修饰的戊二醛，并使得戊二醛终浓度为0.2-1 g/100mL。混合30-60 min后，离心并收集不溶性沉淀物，然后过30目筛。自然晾干后，沉淀物于0.1 M PB（ pH 7.0-8.0，含 0.5-0.9M NaCl)中浸泡3小时，然后再用0.1 M PB（ pH 7.0-8.0）冲洗。

实施例3：转氨酶-戊二醛活化的PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

。

在10 mL的反应瓶中，加入0.3 mL DMSO，溶解0.1 g主原料1或2，并加入4 eq异丙胺盐酸盐和1.0 mg PLP（5’-磷酸吡哆醛），补加0.1 M PB 7.0至反应液终体积为1 mL，0.1g固定化转氨酶（湿的，含水量在70%~80%），在30 ℃搅拌16-20 h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表。

表7：

实施例4：转氨酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶方法中酶液浓度，PEI浓度与GA浓度的考察

以PEG6000作为沉淀剂，其余制备过程同实施例1，设置不同的PEI浓度，交联剂浓度，酶与PEI的比例，制备相应的固定化酶。

在10 mL的反应瓶中，加入0.3 mL DMSO，溶解0.1 g主原料1或2，并加入4 eq异丙胺盐酸盐和1.0 mg PLP（5’-磷酸吡哆醛），补加0.1 M PB 7.0至反应液终体积为1 mL，再加入0.1 g固定化转氨酶（湿的，含水量为70%~80%），在30 ℃搅拌16-20 h。体系经HPLC检测转化率，结果见下表。

表8：

。

上表结果显示，PEI浓度1~7 g/100 mL较适宜；酶与PEI的比例为0.2~1：1最佳；交联剂浓度在0.5~1.5 g/100 mL时稳定性最理想。

实施例5：转氨酶-辅因子活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

采用与实施例3相同的水相反应进行活性验证，结果如下表。结果显示，PEI浓度在1%~5%较合适；辅因子浓度>5 mg/mL后基本无区别，节约起见，可选5~10 mg/mL；交联剂浓度0.5~1%最适宜。PEG修饰的交联剂制备的固定化酶活性略有提高。

表9：转氨酶辅因子活化PEI共价固定化酶水相反应概况

实施例6：酮还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

按照实施例1的方法制备酮还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。

。

在10 mL的反应瓶中，加入0.5 mL 异丙醇（IPA），溶解0.1 g主原料 3 或 4，并加入0.5 mL 0.1 M PB 7.0 和 1-10 mg NAD+，再加入由0.1 g 固定化酶（湿的，含水量为70~80%），在30 ℃搅拌16-20 h。体系经GC检测转化率，反应数据如下表。

表10：酮还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶水相反应概况

实施例7：酮还原酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

同实施例2的方法制备酮还原酶辅因子-PEI共价固定化酶。

同实施例6进行固定化酶酶活和稳定性检测。检测结果见下表。

表11：酮还原酶辅因子-PEI共价固定化酶水相反应概况

实施例8 环己酮单加氧酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

按照实施例1的方法制备环己酮单加氧酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。

固定化酶的活性通过利用以下底物5进行反应来检测。

0.3mL的异丙醇装入10ml的反应瓶中，随后加入500mg的底物5， 3mL含有5mg NADP+的0.1M PB（pH 8.0），然后加入50 mg 醇脱氢酶ADH-Tb游离酶及0.1 g CHMO固定化酶（湿的，含水量70~80％）。在 30℃下反应16-20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。结果见下表。

表12：环己酮单加氧酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例9. 环己酮单加氧酶-辅因子活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

同实施例2，制备环己酮单加氧酶-辅因子活化PEI共价固定化酶聚。

同实施例8，检测固定化酶活性和重复使用次数，结果见下表。

表13：环己酮单加氧酶-辅因子活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例10 烯还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

按照实施例1的方法制备烯还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。

固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物6进行反应来检测

3mL的0.1M PB（pH7.0- 8.0）装入10ml的反应瓶中，随后通过加入100mg的底物6，接着加入 10 mg NAD(P)+，80mg甲酸铵，20 mg FDH及100 mg的ERED固定化酶（湿的，含水量为70~80%）。在 30℃下反应16-20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。

表14：烯还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例11 烯还原酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

同实施例2的方法制备烯还原酶辅因子-PEI共价固定化酶；

同实施例10进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。

表15：烯还原酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例12. 腈水解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

按照实施例1的方法制备腈水解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶

固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物7进行反应来检测

将2 mL 0.1 M PB 缓冲液（pH 7.0-8.0 ）加入10 mL反应瓶中，并加入100 mg上述底物9，然后加入含有200 mg NIT固定化酶（湿的，含水量为70~80%）。在30 ℃ 下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。

表16：腈水解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶性和重复使用次数

实施例13. 腈水解酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

同实施例2的方法制备腈水解酶辅因子-PEI共价固定化酶；

同实施例12进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。

表17：腈水解酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例14. 亚胺还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

按照实施例1的方法制备亚胺还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶。

固定化酶的活性通过利用以下底物8进行反应来检测。

将2 mL 0.1 M PB 缓冲液（pH 7.0-8.0 ）加入10 mL反应球中，然后加入100 mg上述底物8、 10mg NAD⁺、60 mg甲酸铵、10 mg FDH和100 mg IRED固定化酶（湿的，含水量为70~80%）。在30 ℃ 下反应20小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。

表18：亚胺还原酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例15 亚胺还原酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

同实施例2的方法制备亚胺还原酶辅因子-PEI共价固定化酶

同实施例14进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。

表19：亚胺还原酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例16. 氨裂解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

按照实施例1的方法制备氨裂解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶

固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物9进行反应来检测

将8 mL 4 M 氨基甲酸铵水溶液（pH 9.0~9.5）加入10 mL反应瓶中，并加入100 mg上述底物9，然后加入含有200 mg氨裂解酶固定化酶（湿的，含水量为70~80%）。在30 ℃ 下反应16-20小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。测试结果见下表。

表20：氨裂解酶-戊二醛活化PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例17 氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

同实施例2的方法制备氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶；

同实施例16进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。

表21：氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶活性和重复使用次数

实施例18：氨基酸脱氢酶戊二醛活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

按照实施例1的方法制备氨基酸脱氢酶戊二醛活化PEI共价固定化酶。

固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物10、11或12进行反应来检测。

在10 mL的反应瓶中，加入5 mL 0.1 M Tris-Cl缓冲液（pH 8.0-9.0），溶解100mg主原料10、11或12，并加入108 mg氯化铵，调节pH为7.5-8.0，然后加入10-50 mg NAD+、50mg GDH及100 mg固定化的AADH湿酶，在30℃搅拌16-20 h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下。

表22：氨基酸脱氢酶戊二醛活化PEI共价固定化酶水相反应概况

实施例19：氨基酸脱氢酶辅因子活化PEI共价固定化酶聚集体水相反应验活

同实施例2的方法制备氨裂解酶辅因子-PEI共价固定化酶；

同实施例18进行固定化酶酶活和稳定性检测，结果见下表。

表23：氨基酸脱氢酶辅因子活化PEI共价固定化酶水相反应概况

实施例20：共固定化TA, LDH和 FDH 三种酶与戊二醛活化的 PEI共价固定化

固定化：10 mL酶（TA: LDH: FDH ）按比例混合，置于圆底摇瓶中，冷却至5~10 °C后，混合10min。缓慢加入沉淀剂如硫酸铵（45%~65%）、或PEG(20%~60%)，混合30-60 min，得到沉淀酶。向沉淀酶中滴加15 mL活化PEI溶液，混合10-30 min，静置1-2 h后离心。收集不溶性沉淀物，并过30目筛。自然环境下晾干后，用0.1 M PB （pH7.5，含 0.5 M NaCl)浸泡3小时，然后再用0.1 M PB（pH7.5）冲洗。

所得共固定化酶按如下方法测试酶活性：

在10 mL的反应瓶中，加入5 mL 0.1 M PB（pH 8.0），溶解100m g主原料12，80 mg甲氨酸和5 mg PLP（5’-磷酸吡哆醛），调节pH值为7.5-8.0，然后加5 mg NAD+，100 mg共固定化酶(湿的，含水量70~80%)。在30 ℃搅拌16-20 h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表。

表24：

实施例21 转氨酶戊二醛修饰PEI共价固定化酶在填充床连续反应中的应用

实施例3中转氨酶TA-Cv-戊二醛修饰PEI共价固定化酶填充至120 mL柱体积的柱状反应器中，固定化酶（湿的，含水量70~80%）用量90 g。

500 g底物1，用1.5 L的甲醇溶解，并加入4 eq的异丙胺盐酸盐（1.8 L的6 M 异丙胺盐酸盐水溶液）和 5 g PLP，不加PB缓冲液（0.1 M, pH8.0）定容至5 L。

设置流速0.6 mL/min，即保留时间200 min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞92%，持续运行500 h，转化率无降低。

实施例22 转氨酶-辅因子修饰PEI固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用

使用同实施例2的方法制备的转氨酶-辅因子修饰PEI固定化酶60 g，加入到200 mL反应器中，加入150 mL磷酸缓冲液。

500 g底物1，加入3.2 L PB(0.1 M, pH 7.0)，1.8 L 异丙胺盐酸盐水溶液（6 M）和5 g PLP，打浆制成混悬液。

以0.4 mL/min的速度向反应瓶中连续添加底物混悬液（即保留时间500 min），同时以同样的流速在出口抽出反应体系（管道末端加过滤头，防止将固定化酶抽出）。在该条件下，转化率可达90%以上，且连续运行600 h，转化率基本无降低。

实施例23 TA、LDH和 FDH 三种酶与戊二醛活化的 PEI共价固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用

使用同实施例20的共固定化酶，200 mL反应器中加入70 g转氨酶TA-Bt与辅酶LDH,FDH的共固定化酶，加入150 mL磷酸缓冲液。

500 g底物12，108 mg氯化铵，用4.5 L的PB缓冲液（0.1 M, pH8.0）溶解，氢氧化钠溶液调节pH至pH 7.5-8.0，然后加入10-50mg NAD⁺，80mg甲酸铵，最后用PB缓冲液定容至5L。

以0.8 mL/min的速度向连续搅拌罐中连续添加底物（即保留时间250 min），同时以同样的流速在出口抽出反应体系（管道末端加过滤头，防止将固定化酶抽出）。在该条件下，转化率可达92%以上，且连续运行600 h，转化率基本无降低。

实施例24

同实施例2的方法，将制备的酮还原酶KRED-Ac固定化酶（湿的，含水量70~80%），8 g填充至10 mL柱状反应器。

100 g底物3，用0.3 L的异丙醇溶解，加入0.7 LPB缓冲液（0.1 M, pH7.0）溶解，然后加入0.1 g NAD ⁺。

设置流速0.05 mL/min，即保留时间200 min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞90%，持续运行500 h，转化率无降低。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过将酶与PEI固定，将酶固定于PEI形成的多聚网状结构之间，提高了机械稳定性，实现了酶的固定化，而且避免了在固定化过程中，酶直接与戊二醛等交联剂的直接共价结合而降低活性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司

<120> 固定化酶、其制备方法及其应用

<130> PN111987KLY

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> PRT

<213> 转氨酶(Chromobacterium violaceum)

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(459)

<223> TA-Cv-母本

<400> 1

Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala

1 5 10 15

His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu

35 40 45

Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val

85 90 95

Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp

100 105 110

Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile

115 120 125

Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys

130 135 140

Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly

180 185 190

Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu

195 200 205

Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val

210 215 220

Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys

290 295 300

Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val

325 330 335

Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile

340 345 350

Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu

355 360 365

His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu

370 375 380

Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile

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Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg

405 410 415

Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg

420 425 430

Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu

435 440 445

Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala

450 455

<210> 2

<211> 459

<212> PRT

<213> 转氨酶(Chromobacterium violaceum)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(459)

<223> TA-Cv-V1

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (1)..(459)

<223> R416T+T7C+S47C+Q380L

<400> 2

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1 5 10 15

His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Cys Glu

35 40 45

Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val

85 90 95

Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp

100 105 110

Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile

115 120 125

Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys

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165 170 175

Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly

180 185 190

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195 200 205

Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val

210 215 220

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Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu

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Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys

290 295 300

Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu

355 360 365

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370 375 380

Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile

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450 455

<210> 3

<211> 459

<212> PRT

<213> 转氨酶(Chromobacterium violaceum)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(459)

<223> TA-Cv-V2

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (1)..(459)

<223> R416T+T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L

<400> 3

Met Gln Lys Gln Arg Thr Cys Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala

1 5 10 15

His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Cys Glu

35 40 45

Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Gly Thr Thr His Pro Pro Val

85 90 95

Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp

100 105 110

Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile

115 120 125

Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys

130 135 140

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165 170 175

Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly

180 185 190

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290 295 300

Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val

325 330 335

Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile

340 345 350

Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu

355 360 365

His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Leu Ala Phe Thr Leu

370 375 380

Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile

385 390 395 400

Gly Thr Leu Cys Glu Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Thr

405 410 415

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450 455

<210> 4

<211> 476

<212> PRT

<213> 转氨酶(Arthrobacter citreus)

<220>

<221> SITE

<222> (1)..(476)

<223> TA-Ac-母本

<400> 4

Met Gly Leu Thr Val Gln Lys Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys Glu Trp

1 5 10 15

Asp Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Phe Ser Thr Gln Asn Glu Tyr Gln

20 25 30

Pro Val Pro Ile Glu Ser Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ile Thr Pro Gly

35 40 45

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Phe Phe Asn Gln Leu Cys Cys Val Asn Leu

50 55 60

Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp

65 70 75 80

Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg

130 135 140

Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg

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Leu Arg Ser Phe Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe

165 170 175

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180 185 190

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Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln

225 230 235 240

Gly Val Gly Ser Thr Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Val Pro Gln Ile Arg

245 250 255

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595 600

Claims

1.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶由活化的阳离子聚合物以及共价结合在活化的所述阳离子聚合物上的酶组成，

其中，所述活化的阳离子聚合物为经辅因子或交联剂活化的PEI，所述交联剂为多元醇处理或未处理的交联剂；

所述酶选自如下任意一种：转氨酶、酮还原酶、单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶。

2.根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于，所述转氨酶来源于B.thuringiensis、 Arthrobacter citreus或Chromobacterium violaceum DSM30191；

所述酮还原酶来源于Acetobacter sp. CCTCC M209061或Candida macedoniensis.AKU4588；

所述单加氧酶为来源于Brachymonas petroleovorans或Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶；

所述氨裂解酶来源于photorhabdus luminescens或Solenostemon scutellarioides的苯丙氨酸氨裂解酶；

所述烯还原酶来源于Saccharomyces cerevisiae或Chryseobacterium sp. CA49；

所述亚胺还原酶来源于Streptomyces sp.或Bacillus cereus；

所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶或来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；

所述腈水解酶来源于Aspergillus niger CBS 513.88或Neurospora crassa OR74A。

3.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述PEI的分子量为3 KDa~600KDa。

4.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，

所述固定化酶中所述酶与所述PEI的质量比为0.1~1.5：1。

5.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述辅因子为PLP、NAD或NADP，所述交联剂为戊二醛。

6.根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于，所述多元醇为PEG。

7.根据权利要求6所述的固定化酶，其特征在于，所述PEG为PEG400~6000。

8.根据权利要求5所述的固定化酶，其特征在于，所述酶为一种或多种，所述辅因子为一种或多种，一种或多种所述辅因子与一种或多种所述酶相对应。

9.根据权利要求5所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶中所述辅因子与所述PEI的质量比为1~80 : 120。

10.根据权利要求5所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶中所述辅因子与所述PEI的质量比为1~60 : 100。

11.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

利用活化剂对阳离子聚合物PEI进行活化，得到活化的阳离子聚合物；

将酶与所述活化的阳离子聚合物固定，得到由所述活化的阳离子聚合物和所述酶组成的所述固定化酶；

其中，所述活化剂为多元醇未修饰的交联剂、多元醇修饰的交联剂或辅因子；

12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在利用所述活化剂对所述PEI进行活化之前，所述制备方法还包括对所述PEI进行预处理的步骤。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括：

用纯水将PEI稀释至终浓度为1 g/100mL~8 g/100mL，得到稀释PEI；

调节所述稀释PEI的pH为5~11，得到预处理后的PEI。

14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括：

用纯水将PEI稀释至终浓度为1 g/100mL~5 g/100mL，得到稀释PEI；

调节所述稀释PEI的pH为5~11，得到预处理后的PEI。

15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括：

用纯水将PEI稀释至终浓度为1 g/100mL~8 g/100mL，得到稀释PEI；

调节所述稀释PEI的pH为7~10，得到预处理后的PEI。

16.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述预处理包括：

用纯水将PEI稀释至终浓度为1 g/100mL~5 g/100mL，得到稀释PEI；

调节所述稀释PEI的pH为7.0~10.0，得到预处理后的PEI。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶是沉淀酶，所述交联剂为戊二醛，所述活化剂为戊二醛或PEG修饰的戊二醛。

18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述预处理的步骤中，调节所述稀释PEI的pH为5.0~11.0，得到预处理后的所述PEI。

19.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，调节所述稀释PEI的pH为7.0~10.0。

20.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，利用所述活化剂对所述PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：

向预处理后的所述PEI中滴加所述戊二醛或所述PEG修饰的戊二醛，并控制体系中所述戊二醛或者所述PEG修饰的戊二醛的终浓度为0.1 g/100mL~4g/100mL，得到所述活化PEI。

21.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，利用所述活化剂对所述PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：

向预处理后的所述PEI中滴加所述戊二醛或所述PEG修饰的戊二醛，并控制体系中所述戊二醛或者所述PEG修饰的戊二醛的终浓度为0.3 g/100mL~2 g/100mL，得到所述活化PEI。

22.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀酶通过采用沉淀剂对酶进行沉淀得到，所述沉淀剂选自有机溶剂、硫酸铵、PEG400~6000或者分子量为3 KDa~70 KDa的PEI。

23.根据权利要求20或21所述的制备方法，其特征在于，在向预处理后的所述PEI中滴加所述戊二醛或所述PEG修饰的戊二醛的过程中，控制所述戊二醛或所述PEG修饰的戊二醛的滴加速度为10~50 mL/min。

24.根据权利要求23所述的制备方法，其特征在于，

在所述滴加的过程中，还包括搅拌的步骤，所述搅拌的温度为4~25℃，所述搅拌的速度为50~400rpm，所述搅拌的时间为1~12 h。

25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的速度为100~300rpm。

26.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的时间为2~10 h。

27.根据权利要求中17所述的制备方法，其特征在于，将所述酶与所述活化PEI固定，得到所述固定化酶包括：

向所述沉淀酶中滴加所述活化PEI，得到混合物；

对所述混合物依次进行静置、离心、过筛和干燥处理，得到所述固定化酶。

28.根据权利要求中27所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀酶与所述活化PEI的质量比0.2~1：1。

29.根据权利要求中27所述的制备方法，其特征在于，所述静置的时间为1~5小时。

30.根据权利要求中27所述的制备方法，其特征在于，所述过筛为过20~50目筛。

31.根据权利要求中27所述的制备方法，其特征在于，所述干燥为自然晾干。

32.根据权利要求中27所述的制备方法，其特征在于，所述干燥为过夜晾干。

33.根据权利要求中27所述的制备方法，其特征在于，

在对所述混合物进行干燥之后，以及得到所述PEI固定化酶之前，所述制备方法还包括：依次用磷酸盐缓冲液、水及所述磷酸盐缓冲液对干燥后的所述混合物进行清洗的步骤，每种清洗重复3~5次，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0~8.0。

34.根据权利要求13至16中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶是游离酶，所述活化剂为辅因子，所述辅因子为PLP、NAD或NADP。

35.根据权利要求34所述的制备方法，其特征在于，所述预处理的步骤中，采用纯化水调节所述稀释PEI的浓度为1 g/100mL~8g/100mL，pH为6~11，得到预处理后的所述PEI。

36.根据权利要求35所述的制备方法，其特征在于，采用纯化水调节所述稀释PEI的浓度为 1 g/100mL~3 g/100mL。

37.根据权利要求35所述的制备方法，其特征在于，调节所述稀释PEI的pH为8.0~11.0。

38.根据权利要求35所述的制备方法，其特征在于，利用所述活化剂对PEI进行活化，得到活化PEI的步骤包括：

向预处理后的所述PEI中加入所述辅因子，并控制所述辅因子的终浓度为0.3~20 mg/mL，然后搅拌10~600 min得到所述活化PEI。

39.根据权利要求38所述的制备方法，其特征在于，制所述辅因子的终浓度为1~10 mg/mL。

40.根据权利要求38所述的制备方法，其特征在于，搅拌30~180 min。

41.根据权利要求34所述的制备方法，其特征在于，所述游离酶为一种酶的酶液或多种酶的混合液，一种或多种所述辅因子与一种或多种所述酶对应。

42.根据权利要求38所述的制备方法，其特征在于，将所述酶与所述活化PEI结合，得到所述固定化酶的步骤包括：

在4~25 ℃下，向所述游离酶的酶液中滴加所述活化PEI，得到PEI吸附酶；

向所述PEI吸附酶中滴加交联剂进行固定化，得到所述PEI固定化酶。

43.根据权利要求42所述的制备方法，其特征在于，所述游离酶的浓度0.05~0.3 g/mL。

44.根据权利要求42所述的制备方法，其特征在于，

所述PEI与所述游离酶的质量比为0.2~1：1。

45.根据权利要求42所述的制备方法，其特征在于，向所述PEI吸附酶中滴加所述交联剂进行固定化，得到所述PEI固定化酶包括：

向所述PEI吸附酶中滴加所述交联剂，并控制所述交联剂的终浓度为0.2 g/100mL~1g/100mL，得到待固定化物；

对所述待固定化物依次进行静置、离心以及干燥，得到干燥酶；

对所述干燥酶进行清洗，得到所述固定化酶。

46.根据权利要求45所述的制备方法，其特征在于，

所述静置的时间是10~300 min，所述干燥为自然晾干，所述清洗是依次采用磷酸盐缓冲液清洗3~5次、水清洗3~5次及磷酸盐缓冲液清洗3~5次，所述磷酸盐缓冲液包含NaCl，其中NaCl的浓度为0.5~1M。

47.根据权利要求45所述的制备方法，其特征在于，所述静置的时间是30~120min。

48.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述转氨酶来源于B.thuringiensis、Arthrobacter citreus或Chromobacterium violaceum DSM30191；

所述亚胺还原酶来源于Streptomyces sp.或Bacillus cereus；

49.权利要求1至10中任一项所述的固定化酶或者权利要求11至48中任一种制备方法制备得到的固定化酶在生物催化反应中的应用。

50.根据权利要求49所述的应用，其特征在于，所述生物催化反应为批次反应或连续化反应。