JP2023523363A - Ｐｅｉ固定化酵素、その製造方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
固定化酵素、その製造方法及びその使用を提供する。該固定化酵素は、活性化されたＰＥＩと、活性化されたＰＥＩに共有結合された酵素とを含み、酵素は、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、エンレダクターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びニトリラーゼから選ばれるいずれか１種である。
Description
本発明は固定化酵素の分野に関し、具体的には、固定化酵素、その製造方法及びその使用に関する。
微生物細胞、単離された酵素や人工酵素の使用により生物触媒が大きく発展しており、そして、製造方式も変わっている。多くの酵素、例えばアシルトランスフェラーゼ、アミダーゼ、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、オキシダーゼ、モノオキシゲナーゼや加水分解酵素などは、抗生物質、除草剤、医薬品中間体や新世代治療薬に関する反応に利用されている。
遊離酵素が生物触媒として使用される場合、多くの酵素が浪費されてしまい、水溶性酵素の回収が極めて困難であるからである。水不溶性固定化酵素は、サイクルするたびに、非常に簡単なろ過によって回収され得る。
担体又は支持物を用いて自由酵素を固定化することが知られている。ただし、固相担体では、コストが高く、量遷移が限られるという欠点があり、また、担体又は支持物、特にポリマー樹脂の製造により、深刻な環境汚染が発生する。ほとんどの固相担体への酵素固定化方法には以下の固有の欠陥が存在する。酵素担持量が少なく、酵素の特異性が低い。このような欠陥を解決するための方法の１つとして、酵素を精製することにより汚染されたタンパク質又は酵素の担持を回避するが、酵素精製のためのコストが非常に高く、固定化生物触媒のコストがその分高まる。
現在、リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ）、ペニシリンアシラーゼ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ
ａｃｙｌａｓｅ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、アミノアシラーゼ（ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ）などの酵素の担体無し固定化方法が報告されている。ただし、担体で支持されていない担体不含固定化酵素では、機械的安定性が低いので、せん断力や撹拌条件に対応できず、また、ろ過についても問題が生じるため、量産を満たすとはいえない。
ａｃｙｌａｓｅ）、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、アミノアシラーゼ（ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ）などの酵素の担体無し固定化方法が報告されている。ただし、担体で支持されていない担体不含固定化酵素では、機械的安定性が低いので、せん断力や撹拌条件に対応できず、また、ろ過についても問題が生じるため、量産を満たすとはいえない。
さらに、担体無し酵素固定化方法は、ある感受性の高い酵素、例えばトランスアミナーゼ（ＴＡ），ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）、モノオキシゲナーゼ（ＣＨＭＯ）、アンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、エンレダクターゼ（ＥＲＥＤ）、イミンレダクターゼ（ＩＲＥＤ）、 アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＡＡＤＨ）及びニトリラーゼ（Ｎｉｔｒｉｌａｓｅ）に適していない。
このため、高感受性酵素の活性及びその再利用率を向上させるために、担体無し酵素固定化方法が期待される。
本発明の主な目的は、従来技術では高感受性の酵素の活性及びその再利用が実現できないという問題を解決するために、固定化酵素、その製造方法及びその使用を提供することである。
上記の目的を達成させるために、本発明の一態様によれば、活性化されたカチオン性ポリマーと、活性化された前記カチオン性ポリマーに共有結合された酵素とからなり、活性化されたカチオン性ポリマーは補因子又は架橋剤で活性化されたＰＥＩであり、架橋剤はポリオールで処理された又は処理されていない架橋剤であり、酵素はトランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、エンレダクターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びニトリラーゼから選ばれるいずれか１種である、固定化酵素を提供する。
さらに、トランスアミナーゼは、バチルス・チューリンゲンシス、アルスロバクター・シトレウス又はクロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ３０１９１に由来し、好ましくは、ケトレダクターゼは、アセトバクター属ＣＣＴＣＣ
Ｍ２０９０６１又はキャンディダ・マセドニエンシスＡＫＵ４５８８に由来し、好ましくは、モノオキシゲナーゼは、ブラキモナス・ペトロレオボランス又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、好ましくは、アンモニアリアーゼは、フォトラブダス・ルミネッセンス又はソレノステモン・スクテラリオイデスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、好ましくは、エンレダクターゼは、サッカロミケス・セレビシエ又はクリセオバクテリウム属ＣＡ４９に由来し、好ましくは、イミンレダクターゼは、ストレプトマイセス属又はバチルス・セレウスに由来し、好ましくは、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス・セレウスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼ又はバチルス・スフェリカスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、好ましくは、ニトリラーゼは、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ
５１３．８８又はアカパンカビＯＲ７４Ａに由来する。
Ｍ２０９０６１又はキャンディダ・マセドニエンシスＡＫＵ４５８８に由来し、好ましくは、モノオキシゲナーゼは、ブラキモナス・ペトロレオボランス又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、好ましくは、アンモニアリアーゼは、フォトラブダス・ルミネッセンス又はソレノステモン・スクテラリオイデスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、好ましくは、エンレダクターゼは、サッカロミケス・セレビシエ又はクリセオバクテリウム属ＣＡ４９に由来し、好ましくは、イミンレダクターゼは、ストレプトマイセス属又はバチルス・セレウスに由来し、好ましくは、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス・セレウスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼ又はバチルス・スフェリカスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、好ましくは、ニトリラーゼは、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ
５１３．８８又はアカパンカビＯＲ７４Ａに由来する。
さらに、ＰＥＩの分子量が３ＫＤａ～６００ＫＤａであり、好ましくは、固定化酵素中、酵素とＰＥＩとの質量比が０．１～１．５：１で、より好ましくは、０．２～１：１である。
さらに、補因子はＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰであり、架橋剤はグルタルアルデヒドであり、好ましくは、ポリオールはＰＥＧで、より好ましくは、ＰＥＧ４００～６０００である。
さらに、固定化酵素は酵素の補因子をさらに含み、補因子はＰＥＩに共有結合されており、好ましくは、ＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰである。
さらに、酵素は１種又は複数種であり、補因子は１種又は複数種であり、１種又は複数種の補因子は１種又は複数種の酵素相に対応し、好ましくは、固定化酵素中、補因子とＰＥＩとの質量比が、１～８０：１２０で、より好ましくは１～６０：１００である。
本願の第２態様によれば、カチオン性ポリマーを活性化剤で活性化させて、活性化されたカチオン性ポリマーを得るステップと、酵素と活性化されたカチオン性ポリマーとを固定化し、固定化酵素を得るステップとを含み、活性化剤はポリオールで修飾されていない架橋剤、ポリオールで修飾された架橋剤又は補因子であり、酵素は、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、エンレダクターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びニトリラーゼから選ばれるいずれか１種である、固定化酵素の製造方法を提供する。
さらに、ＰＥＩを活性化剤で活性化させる前に、製造方法は、ＰＥＩを前処理するステップをさらに含み、好ましくは、前処理は、ＰＥＩを純水で最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～８ｇ／１００ｍＬ、より好ましくは１ｇ／１００ｍＬ～５ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、希釈ＰＥＩを得ることと、希釈ＰＥＩのｐＨを５～１１、より好ましくは７．０～１０．０に調整して、前処理後のＰＥＩを得ることとを含む。
さらに、酵素は沈殿酵素であり、架橋剤はグルタルアルデヒドであり、活性化剤はグルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドであり、好ましくは、前処理ステップにおいて、希釈ＰＥＩのｐＨを５．０～１１．０、好ましくは７．０～１０．０に調整して、前処理後のＰＥＩを得て、より好ましくは、ＰＥＩを活性化剤で活性化させて、活性化ＰＥＩを得るステップは、前処理後のＰＥＩにグルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドを滴下し、系中のグルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドの最終濃度を０．１ｇ／１００ｍＬ～４ｇ／１００ｍＬ、好ましくは０．３ｇ／１００ｍＬ～２ｇ／１００ｍＬに制御し、活性化ＰＥＩを得ることを含む。
さらに、沈殿酵素は沈殿剤を用いて酵素を沈殿させたものであり、沈殿剤は有機溶媒、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ４００～６０００又は分子量３ＫＤａ～７０ＫＤａのＰＥＩから選ばれる。
さらに、前処理後のＰＥＩにグルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドを滴下する過程において、グルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドの滴下速度が１０～５０ｍＬ／分である様に制御し、好ましくは、滴下において、撹拌ステップをさらに含み、好ましくは、撹拌温度が４～２５℃で、撹拌速度が５０～４００ｒｐｍで、さらに好ましくは１００～３００ｒｐｍで、撹拌時間が１～１２時間で、さらに好ましくは２～１０時間である。
さらに、酵素と活性化ＰＥＩとを結合させて、固定化酵素を得るステップは、沈殿酵素に活性化ＰＥＩを滴下して、混合物を得ることと、混合物に対して静置、遠心分離、篩分け及び乾燥処理を順次行い、固定化酵素を得ることとを含み、好ましくは、酵素と活性化ＰＥＩとの質量比が０．２～１：１であり、好ましくは、静置時間が１～５時間であり、好ましくは、篩分けは２０～５０メッシュの篩にかけることであり、好ましくは、乾燥は自然乾燥、より好ましくは一晩乾燥であり、好ましくは、混合物を乾燥させた後かつＰＥＩ固定化酵素を得る前に、製造方法は、ｐＨ７．０～８．０のリン酸塩緩衝液、水及びリン酸塩緩衝液を用いて乾燥後の混合物を３～５回ずつ洗浄するステップをさらに含む。
さらに、酵素は遊離酵素であり、活性化剤は補因子であり、補因子はＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰであり、好ましくは、前処理ステップにおいて、希釈ＰＥＩの濃度を精製水で１ｇ／１００ｍＬ～８ｇ／１００ｍＬ、好ましくは１ｇ／１００ｍＬ～３ｇ／１００ｍＬに調整し、ｐＨを６～１１、より好ましくは、８．０～１１．０とし、前処理後のＰＥＩを得て、より好ましくは、ＰＥＩを活性化剤で活性化させて、活性化ＰＥＩを得るステップは、前処理後のＰＥＩに補因子を加え、補因子の最終濃度を０．３～２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍｇ／ｍＬに制御し、次に、１０～６００分、より好ましくは３０～１８０分撹拌して、活性化ＰＥＩを得ることを含む。
さらに、遊離酵素は１種の酵素の酵素液又は複数種の酵素の混合液であり、補因子は複数種の酵素に対応する補因子である。
さらに、酵素と活性化ＰＥＩとを固定化して、固定化酵素を得るステップは、４～２５℃で、遊離酵素の酵素液に活性化ＰＥＩを滴下し、ＰＥＩ吸着酵素を得ることと、ＰＥＩ吸着酵素に架橋剤を滴下して固定化し、ＰＥＩ固定化酵素を得ることとを含み、好ましくは、遊離酵素の濃度は０．０５～０．３ｇ／ｍＬであり、好ましくは、ＰＥＩと遊離酵素との質量比は０．２～１：１である。
さらに、ＰＥＩ吸着酵素に架橋剤を滴下して固定化し、ＰＥＩ固定化酵素を得るステップは、ＰＥＩ吸着酵素に架橋剤を滴下し、架橋剤の最終濃度を０．２ｇ／１００ｍＬ～１ｇ／１００ｍＬに制御し、固定化対象物を得ることと、固定化対象物に対して静置、遠心分離及び乾燥を順次行い、乾燥酵素を得ることと、乾燥酵素を洗浄して、固定化酵素を得ることとを含み、好ましくは、静置時間は１０～３００分、さらに好ましくは３０～１２０分であり、乾燥は自然乾燥であり、洗浄は、順次、リン酸塩緩衝液で３～５回洗浄し、水で３～５回洗浄し、及びリン酸塩緩衝液で３～５回洗浄し、リン酸塩緩衝液はＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が０．５～１Ｍである。
さらに、トランスアミナーゼは、バチルス・チューリンゲンシス、アルスロバクター・シトレウス又はクロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ３０１９１に由来し、好ましくは、ケトレダクターゼは、アセトバクター属ＣＣＴＣＣ
Ｍ２０９０６１又はキャンディダ・マセドニエンシスＡＫＵ４５８８に由来し、好ましくは、モノオキシゲナーゼは、ブラキモナス・ペトロレオボランス又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、好ましくは、アンモニアリアーゼは、フォトラブダス・ルミネッセンス又はソレノステモン・スクテラリオイデスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、好ましくは、エンレダクターゼは、サッカロミケス・セレビシエ又はクリセオバクテリウム属ＣＡ４９に由来し、好ましくは、イミンレダクターゼは、ストレプトマイセス属又はバチルス・セレウスに由来し、好ましくは、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス・セレウスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼ又はバチルス・スフェリカスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、好ましくは、ニトリラーゼは、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ
５１３．８８又はアカパンカビＯＲ７４Ａに由来する。
Ｍ２０９０６１又はキャンディダ・マセドニエンシスＡＫＵ４５８８に由来し、好ましくは、モノオキシゲナーゼは、ブラキモナス・ペトロレオボランス又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、好ましくは、アンモニアリアーゼは、フォトラブダス・ルミネッセンス又はソレノステモン・スクテラリオイデスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、好ましくは、エンレダクターゼは、サッカロミケス・セレビシエ又はクリセオバクテリウム属ＣＡ４９に由来し、好ましくは、イミンレダクターゼは、ストレプトマイセス属又はバチルス・セレウスに由来し、好ましくは、アミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス・セレウスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼ又はバチルス・スフェリカスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、好ましくは、ニトリラーゼは、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ
５１３．８８又はアカパンカビＯＲ７４Ａに由来する。
本願の第３態様によれば、上記のいずれか１種の固定化酵素又は上記のいずれか１種の製造方法によって製造される固定化酵素の生体触媒反応における使用を提供する。
さらに、生体触媒反応はバッチ反応又は連続反応である。
本発明の技術的解決手段によれば、酵素とＰＥＩとを固定化し、酵素をＰＥＩからなる重合網状構造の間に固定化することで、機械的安定性を向上させ、酵素の固定化を実現し、しかも、固定化中に酵素がグルタルアルデヒドなどの架橋剤と直接共有結合されることによる活性低下を回避する。
なお、矛盾しない限り、本願の実施例及び実施例の特徴は互意に組み合わせられてもよい。以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
背景技術に記載のとおり、従来技術では、担体支持無しの固定化酵素が報告されているが、感受性の高い酵素に適しておらず、このため、高感受性酵素の活性及びその再利用効率を向上させるために、新しい固定化方式が期待される。本願の代表的な実施形態では、固定化酵素が提供されており、活性化されたカチオン性ポリマーと、活性化されたカチオン性ポリマーに共有結合された酵素とを含み、活性化されたカチオン性ポリマーは補因子又は架橋剤で活性化されたＰＥＩであり、架橋剤はポリオールで処理された又は処理されていない架橋剤であり、酵素は、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、エンレダクターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びニトリラーゼから選ばれるいずれか１種である。
本願の固定化酵素では、酵素と酵素との間、及び酵素とＰＥＩとの間が網状に結合されており、これにより、機械的安定性を向上させ、酵素の固定化を実現するとともに、高感受性酵素の活性、安定性及び再利用回数を向上させる。
上記の固定化酵素では、ＰＥＩはＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｎｅであり、ＰＥＩと略称し、ポリエチレンイミンであって、ポリアジリジンとも呼ばれ、水やエタノールに可溶であるが、ベンゼンに不溶である水溶性高分子ポリマーである。市販品は通常濃度２０％～５０％の水溶液である。ＰＥＩは最初にはポリカチオン性非ウイルス担体として報告されたものであり、低コストで、インビトロやインビボでのトランスフェクション効果が高く、取り扱性に優れ、量産が可能であり、免疫原性ではないなどの利点があり、このため、医薬品の非ウイルス担体の面では注目を集めている。ＰＥＩポリマーは複数のアミノを含有し、グルタルアルデヒドと架橋反応して各種の重合網状のナノ構造を生成することができる。このような網状構造にはアルデヒド基、アミノなどの官能基が分散しており、共有結合作用、水素結合作用、イオン作用や疎水化作用などの複数種の方式によって酵素タンパク質とに結合することができ、単一のグルタルアルデヒドの様に共有結合だけによって結合され、共有結合作用が酵素の活性を破壊しやすいのではない。
このため、本願の上記の固定化酵素では、酵素とＰＥＩとを固定化し、酵素をＰＥＩからなる重合網状構造の間に固定化することで、酵素の固定化を実現し、固定化中に酵素がグルタルアルデヒドなどの架橋剤と直接共有結合されることによる活性低下を回避する。上記のＰＥＩの具体的な分子量について特に限定はなく、酵素を固定化できればよい。本願の好適な一実施例では、ＰＥＩの分子量は３ＫＤａ～６００ＫＤａである。ＰＥＩの具体的な分子量は、固定化すべき酵素の種類に応じて合理的に好適に決定されてもよく、上記の分子量範囲内であれば、従来の酵素類への固定化効果が相対的により良い。
上記の固定化酵素では、酵素とＰＥＩとの質量比は酵素の具体的な種類に応じて合理的に調整されてもよい。好ましい一実施例では、固定化酵素中、酵素とＰＥＩとの質量比は０．１～１．５：１、好ましくは、０．２～１：１である。０．１～１．５：１の質量比範囲とすると、固定化酵素の再利用回数が多く、質量比が０．２～１：１範囲であると、固定化酵素の再利用回数がより多くなる。
上記の補因子はＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰであり、架橋剤はグルタルアルデヒドであり、好ましくは、ポリオールはＰＥＧであり、より好ましくは、ＰＥＧはＰＥＧ４００～６０００である。
上記の酵素固定化は、単一の酵素の固定化であってもよいし、複数種の酵素の固定化であってもよい。複数種の酵素の固定化である場合、主酵素と副酵素の共固定化であってもよい。本願の好ましい一実施例では、固定化酵素は酵素の補因子をさらに含み、補因子はＰＥＩに共有結合されており、好ましくは、補因子はＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰである。主酵素と副酵素を共固定化した酵素は、触媒活性が安定的であり、再利用回数が多いという効果がある。
上記したとおり、本願の固定化酵素中の酵素は１種又は複数種であってもよく、このため、補因子も１種又は複数種であり、１種又は複数種の補因子は１種又は複数種の酵素に対応する。好ましくは、固定化酵素中、補因子とＰＥＩとの質量比は１～８０：１２０で、より好ましくは１～６０：１００である。
２種以上の酵素が異なる補因子を有する場合、固定化酵素はそれぞれの酵素の異なる補因子を含み、２種以上の酵素が同じ補因子を有する場合、固定化酵素に含まれる補因子の使用量は各種の異なる主酵素の使用量に応じて合理的に決定される。具体的な補因子の使用量によって、対応するＰＥＩの使用量も異なる。
本願の別の代表的な実施形態では、固定化酵素の製造方法が提供されており、該製造方法は、カチオン性ポリマーを活性化剤で活性化させて、活性化されたカチオン性ポリマーを得るステップと、酵素と活性化されたカチオン性ポリマーとを固定化し、固定化酵素を得るステップとを含み、活性化剤はポリオールで修飾されていない架橋剤、ポリオールで修飾された架橋剤又は補因子であり、酵素は、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、エンレダクターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びニトリラーゼから選ばれるいずれか１種である。
上記の固定化酵素の製造方法では、まず、グルタルアルデヒド又は補因子でＰＥＩを活性化させ、次に、酵素と結合すると、固定化酵素が得られる。該方法は、簡単であり、固定中に酵素の活性が影響を受けにくく、それにより、固定化酵素は、活性が高く、安定性に優れ、再利用回数が多い。
ＰＥＩをより効果的に活性化させるために、本願の好ましい一実施例では、ＰＥＩを活性化剤で活性化させる前に、該製造方法は、ＰＥＩを前処理するステップをさらに含み、より好ましくは、該前処理は、ＰＥＩを純水で最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～８ｇ／１００ｍＬ、さらに好ましくは１ｇ／１００ｍＬ～５ｇ／１００ｍＬとなるまで希釈し、希釈ＰＥＩを得ることと、希釈ＰＥＩのｐＨを５～１１、より好ましくは７．０～１０．０に調整して、前処理後のＰＥＩを得ることとを含む。希釈は、ＰＥＩの粘度や濃度を低下させることを目的とし、これは活性化の進行に有利であり、濃度が高すぎることにより沈殿が生じることを回避する。ｐＨ調整の目的は、ｐＨが高すぎたり低すぎたりすることにより酵素が変性して不活性化させてしまい、ＰＥＩの各レベルのアミノ官能基とグルタルアルデヒドとの結合の度合いに影響を与え、高すぎるｐＨによって活性化中に沈殿が生じやすいことを回避することにある。
上記の製造方法では、酵素が沈殿酵素であるか遊離酵素であるかによって、活性化剤は異なり、具体の製造ステップもわずかに異なる。好ましい一実施例では、酵素は沈殿酵素であり、架橋剤はグルタルアルデヒドであり、活性化剤はグルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドである。より好ましくは、前処理ステップにおいて、希釈ＰＥＩのｐＨを５．０～１１．０、好ましくは７．０～１０．０に調整して、前処理後のＰＥＩを得る。より好ましい一実施例では、上記のＰＥＩを活性化剤で活性化させて、活性化ＰＥＩを得るステップは、前処理後のＰＥＩにグルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドを滴下し、系中のグルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドの最終濃度を０．１ｇ／１００ｍＬ～４ｇ／１００ｍＬ、好ましくは０．３ｇ／１００ｍＬ～２ｇ／１００ｍＬに制御し、活性化ＰＥＩを得ることを含む。
酵素が沈殿酵素である場合、グルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドでＰＥＩを活性化させ、グルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドの濃度を上記の好ましい範囲に制御することによって、活性化性能が良いＰＥＩが得られ、酵素との効果的な結合により有利である。
グルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドでＰＥＩを活性化させるステップについて特に限定がなく、グルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドのＰＥＩへの活性効率を最適に制御できればよい。ＰＥＩをより十分かつ均一に活性化させるために、好ましい一実施例では、前処理後のＰＥＩにグルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドを滴下する過程において、グルタルアルデヒド又はＰＥＧ化グルタルアルデヒドの滴下速度は１０～５０ｍＬ／分に制御され、より好ましくは、滴下において、撹拌ステップをさらに含み、好ましくは、撹拌温度が４～２５℃で、撹拌速度が５０～４００ｒｐｍで、さらに好ましくは１００～３００ｒｐｍで、撹拌時間が１～１２時間で、さらに好ましくは２～１０時間である。
上記の沈殿酵素は従来の方法で形成されたものであってもよく、本願では、沈殿剤を酵素で沈殿させたものが好ましく、沈殿剤は、有機溶媒（例えばアセトニトリル）、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ４００～６０００又は分子量３ＫＤａ～７０ＫＤａのＰＥＩを含むが、これらに限定されるものではない。より好ましくはＰＥＧ４００～６０００又は分子量３ＫＤａ～７０ＫＤａのＰＥＩを用いて沈殿酵素を得る。なお、沈殿剤が３ＫＤａ～７０ＫＤａのＰＥＩである場合、沈殿酵素にＰＥＩが含有されており、且つ沈殿中にＰＥＩと酵素との物理吸着が行われるので、グルタルアルデヒドの架橋作用によって酵素の共有結合が直接行われて、固定化酵素が形成され得る。もちろん、グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩと反応する場合にも、同様に、沈殿酵素集合体は架橋剤のアームの作用を経由してＰＥＩに共有結合され、酵素と酵素との間、酵素とＰＥＩとの間の網状結合を達成させる。
沈殿酵素が有機溶媒、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ４００～６０００などで形成される場合、グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩと結合される必要がある。好ましい一実施例では、酵素と活性化ＰＥＩとを結合させて、固定化酵素を得る上記ステップは、沈殿酵素に活性化ＰＥＩを滴下しながら、ｐＨを５～１１、好ましくは、７．０～９．０に制御し、混合物を得ることと、混合物に対して静置、遠心分離、篩分け及び乾燥処理を順次行い、固定化酵素を得ることとを含み、より好ましくは、酵素と活性化ＰＥＩとの質量比が０．２～１：１である。
ｐＨが５～１１の範囲内である場合、酵素活性を確保しながら、ＰＥＩと活性化剤とをより強固に結合させるという有益な効果があり、また、滴下しながらｐＨ値を７．０～９．０の範囲内に制御する場合、酵素の活性には最も有益であり、ＰＥＩと活性化剤との結合の度合いが最も良好であり、取り扱い性により優れるという効果がある。酵素と活性化ＰＥＩとの質量比が０．２～１：１範囲内である場合、酵素が浪費されずに活性が最高の固定化酵素が得られるという技術的効果が得られる。
上記の好ましい実施例では、静置は、酵素分子と活性化されたＰＥＩとの間の内部の作用をさらに高めて、機械的強度がより高い固定化酵素を得る役割を果たす。篩分けによって粒子の大きさが均一な固定化酵素が製造される。好ましい一実施例では、上記の静置時間は１～５時間であり、より好ましくは、篩分けは２０～５０メッシュの篩にかけることであり、より好ましくは、乾燥は自然乾燥、より好ましくは一晩乾燥であり、より好ましくは、混合物を乾燥させた後かつＰＥＩ固定化酵素を得る前に、上記の製造方法は、ｐＨ７．０～８．０リン酸塩緩衝液、水及びリン酸塩緩衝液を用いて乾燥後の混合物を順次３～５回ずつ洗浄するステップをさらに含み、リン酸塩緩衝液はＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が０．５～１Ｍである。
上記の好ましい実施例では、混合物の洗浄には、リン酸塩緩衝液による洗浄は洗浄液による酵素の活性への悪影響を回避する。上記の濃度及びｐＨの範囲内の緩衝液は酵素の活性に悪影響を与えることがない。
酵素が遊離酵素である場合、好ましい一実施例では、酵素は遊離酵素であり、活性化剤は補因子であり、補因子はＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰである。上記の補因子の作用の下で、ＰＥＩは活性化され、活性化ＰＥＩは遊離酵素を効果的に吸着し、次に、架橋剤の作用の下で酵素と架橋して固定される。
好ましい一実施例では、上記の前処理ステップにおいて、希釈ＰＥＩの濃度を精製水で１ｇ／１００ｍＬ～８ｇ／１００ｍＬ、好ましくは１ｇ／１００ｍＬ～３ｇ／１００ｍＬに調整し、ｐＨを６～１１、好ましくは８．０～１１．０とし、前処理後のＰＥＩを得る。遊離酵素について希釈ＰＥＩの濃度及びｐＨを上記の範囲とすることにより、活性化後のＰＥＩの有効官能基の分布は酵素分子との結合により有利であり、固定化酵素の沈殿状態が良好になり、溶液からの分離により有利である。
遊離酵素の固定化に関しては、好ましい一実施例では、ＰＥＩを活性化剤で活性化させて、活性化ＰＥＩを得るステップは、前処理後のＰＥＩに補因子を加え、補因子の最終濃度を０．３～２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは１～１０ｍｇ／ｍＬに制御し、次に、１０～６００分、より好ましくは３０～１８０分撹拌して、活性化ＰＥＩを得ることを含む。
補因子の最終濃度を在上記の範囲内に制御することによって、補因子が浪費されない上にＰＥＩの活性化の度合いが最適であり、後続で酵素分子と結合することにより有利である効果が得られる。加えられた補因子を撹拌することは、補因子によるＰＥＩの活性化を十分に行う。
上記の遊離酵素は１種の酵素の酵素液又は複数種の酵素の混合液であり、このため、補因子は１種の酵素又は複数種の酵素に対応する補因子である。
好ましい一実施例では、酵素と活性化ＰＥＩとを固定化し、固定化酵素を得るステップは、４～２５℃で、遊離酵素の酵素液に活性化ＰＥＩを滴下し、ＰＥＩ吸着酵素を得ることと、ＰＥＩ吸着酵素に架橋剤を滴下して固定化し、ＰＥＩ固定化酵素を得ることとを含み、より好ましくは、遊離酵素の濃度は０．０５～０．３ｇ／ｍＬであり、より好ましくは、活性化ＰＥＩと遊離酵素との質量比は０．２～１：１である。
遊離酵素の濃度を０．０５～０．３ｇ／ｍＬ範囲内に制御することによって、粒子のサイズが適切で、分布が均一な固定化酵素に有利であり、また、固定化酵素が溶液から分離されやすいという効果が得られる。活性化ＰＥＩと遊離酵素との質量比を０．２～１：１範囲内に制御することによって、遊離酵素が浪費されない上に、最も回収可能な固定化酵素が得られるという効果が得られる。
好ましい一実施例では、ＰＥＩ吸着酵素に架橋剤を滴下して固定化し、ＰＥＩ固定化酵素を得るステップは、ＰＥＩ吸着酵素に架橋剤を滴下し、架橋剤の最終濃度を０．２ｇ／１００ｍＬ～１ｇ／１００ｍＬに制御し、固定化対象物を得ることと、固定化対象物に対して静置、遠心分離及び乾燥を順次行い、乾燥酵素を得ることと、乾燥酵素を洗浄して、固定化酵素を得ることとを含み、好ましくは、静置時間は１０～３００分、さらに好ましくは３０～１２０分であり、乾燥は自然乾燥であり、洗浄は、順次、リン酸塩緩衝液で３～５回洗浄し、水で３～５回洗浄し、及びリン酸塩緩衝液で３～５回洗浄することであり、リン酸塩緩衝液はＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が０．５～１Ｍである。
架橋剤の最終濃度を０．２ｇ／１００ｍＬ～１ｇ／１００ｍＬ範囲内に制御することによって、結合が強固な固定化酵素を生成することを確保しながら、酵素活性の再生が最も高い効果が得られる。ここでは、静置、洗浄などの作用は前記したとおりである。
本願のさらなる代表的な実施例では、上記のいずれか１種の固定化酵素、又は上記のいずれか１種の製造方法によって製造される固定化酵素の生体触媒反応における使用が提供されている。該固定化酵素は、安定性が高く、再利用効率が高いという優位性があり、このため、生体触媒反応において繰り返して使用可能である。
より好ましい一実施例では、上記の固定化酵素が使用される生体触媒反応はバッチ反応又は連続反応、より好ましくは連続反応である。固定化酵素は再利用効率が高いので、連続した生体触媒反応に適しており、反応効率が高められる。
以下、具体的な実施例を参照して本願の有益な効果をさらに説明する。
表１
表１
以下の実施例では、ＰＢはリン酸緩衝液を表す。
実施例１：グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の製造（ＧＡ：Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＥＩ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ
ｉｍｉｎｅ、ＧＰ：ＧＡ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＩ、グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ）
ＰＥＧ修飾グルタルアルデヒド：
グルタルアルデヒドを水で最終濃度が２０ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、２～１０ｇ／１００ｍＬ ＰＥＧ ２０００又はＰＥＧ ６０００を添加し、室温で１～３時間混合して使用に備えた。
ｉｍｉｎｅ、ＧＰ：ＧＡ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＩ、グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ）
ＰＥＧ修飾グルタルアルデヒド：
グルタルアルデヒドを水で最終濃度が２０ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、２～１０ｇ／１００ｍＬ ＰＥＧ ２０００又はＰＥＧ ６０００を添加し、室温で１～３時間混合して使用に備えた。
活性化ＰＥＩ溶液の製造１：
水溶液１００ｍＬにグルタルアルデヒド２ｇとＰＥＩ（３－７０ＫＤａ）４ｇ（ｐＨ８．０）を加えて、３時間撹拌した。
水溶液１００ｍＬにグルタルアルデヒド２ｇとＰＥＩ（３－７０ＫＤａ）４ｇ（ｐＨ８．０）を加えて、３時間撹拌した。
活性化ＰＥＩ溶液の製造２：
水溶液１００ｍＬにＰＥＩ（３ＫＤａ）４ｇ（ｐＨ８．０）、及びＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒド（溶液中のグルタルアルデヒドの最終濃度は２ｇ／１００ｍＬである、）を加えて３時間撹拌した。
水溶液１００ｍＬにＰＥＩ（３ＫＤａ）４ｇ（ｐＨ８．０）、及びＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒド（溶液中のグルタルアルデヒドの最終濃度は２ｇ／１００ｍＬである、）を加えて３時間撹拌した。
固定化：
酵素（酵素タンパク質の含有量が１００～２００ｍｇ／ｍＬで、これに対応して補因子が３～１０ｍｇ／ｍＬ含有された。）１０ｍＬを丸底フラスコに投入して、５～１０℃に冷却した後、１０分混合した。沈殿剤例えば硫酸アンモニウム（４５％～６５％）、エタノール（８０％～９０％）又はＰＥＩ（２０％～６０％）を緩やかに加えて、３０～６０分混合し、沈殿酵素を得た。沈殿酵素に活性化ＰＥＩ溶液１５ｍＬを滴下し、１０～３０分混合し、１～２時間静置した後、遠心分離した。不溶性沈殿物を収集して、３０メッシュの篩にかけた。自然環境で乾燥後、０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨが７．５で、０．５Ｍ ＮａＣｌが含有された。）に入れて３時間浸漬し、次に、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．５）でリンスした。
酵素（酵素タンパク質の含有量が１００～２００ｍｇ／ｍＬで、これに対応して補因子が３～１０ｍｇ／ｍＬ含有された。）１０ｍＬを丸底フラスコに投入して、５～１０℃に冷却した後、１０分混合した。沈殿剤例えば硫酸アンモニウム（４５％～６５％）、エタノール（８０％～９０％）又はＰＥＩ（２０％～６０％）を緩やかに加えて、３０～６０分混合し、沈殿酵素を得た。沈殿酵素に活性化ＰＥＩ溶液１５ｍＬを滴下し、１０～３０分混合し、１～２時間静置した後、遠心分離した。不溶性沈殿物を収集して、３０メッシュの篩にかけた。自然環境で乾燥後、０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨが７．５で、０．５Ｍ ＮａＣｌが含有された。）に入れて３時間浸漬し、次に、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．５）でリンスした。
実施例２：補因子で活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の製造
補因子で活性化されたＰＥＩ溶液の製造：
ＰＥＩ（Ｍｗ＝３～７０ＫＤａ）を水でＰＥＩの最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～２ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、ｐＨを７．０～１１．０とした。所望の酵素に応じて、ＰＥＩ溶液に各種の酵素補因子を３～１０ｍｇ／ｍＬ添加し、室温で３０～６０分混合した。
補因子で活性化されたＰＥＩ溶液の製造：
ＰＥＩ（Ｍｗ＝３～７０ＫＤａ）を水でＰＥＩの最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～２ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、ｐＨを７．０～１１．０とした。所望の酵素に応じて、ＰＥＩ溶液に各種の酵素補因子を３～１０ｍｇ／ｍＬ添加し、室温で３０～６０分混合した。
固定化：
４～１０℃で、補因子で活性化されたＰＥＩ溶液７．５ｍＬを酵素液中（酵素タンパク質含有量が３０～８０ｍｇ／ｍＬで、この場合、補因子も含有された。）５ｍＬに滴下し、３０～６０分混合した後、架橋剤としてグルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドを加えて、グルタルアルデヒドの最終濃度を０．２～１ｇ／１００ｍＬとした。３０～６０分混合後、遠心分離して不溶性沈殿物を収集し、次に、３０メッシュの篩にかけた。自然乾燥後、沈殿物を０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨが７．０～８．０で、０．５～０．９Ｍ ＮａＣｌが含有された）に入れて３時間浸漬し、次に、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．０～８．０）でリンスした。
４～１０℃で、補因子で活性化されたＰＥＩ溶液７．５ｍＬを酵素液中（酵素タンパク質含有量が３０～８０ｍｇ／ｍＬで、この場合、補因子も含有された。）５ｍＬに滴下し、３０～６０分混合した後、架橋剤としてグルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドを加えて、グルタルアルデヒドの最終濃度を０．２～１ｇ／１００ｍＬとした。３０～６０分混合後、遠心分離して不溶性沈殿物を収集し、次に、３０メッシュの篩にかけた。自然乾燥後、沈殿物を０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨが７．０～８．０で、０．５～０．９Ｍ ＮａＣｌが含有された）に入れて３時間浸漬し、次に、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．０～８．０）でリンスした。
実施例３：トランスアミナーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応による活性試験
０．３ｍＬを加えて、溶解主原料１又は２ ０．１ｇを溶解し、イソプロピルアミン塩酸塩４ｅｑとＰＬＰ（５’－ピリドキサールリン酸）１．０ｍｇを加え、０．１Ｍ ＰＢ
７．０を反応液の最終体積が１ｍＬとなるまで補充し、固定化トランスアミナーゼ０．１ｇ（湿ったもので、含水量が７０％～８０％である。）をさらに加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。系についてＨＰＬＣにより転化率を検出し、反応データを下記の表に示す。
表７
ＰＥＧ６０００を沈殿剤した以外、残りの製造工程は実施例１と同様であり、ＰＥＩ濃度、架橋剤濃度、酵素及びＰＥＩの割合を異なるものとして、対応する固定化酵素を製造した。
１０ｍＬ反応フラスコに、ＤＭＳＯ
０．３ｍＬを加えて、主原料１又は２ ０．１ｇを溶解し、イソプロピルアミン塩酸塩４ｅｑとＰＬＰ（５’－ピリドキサールリン酸）１．０ｍｇを加え、０．１Ｍ ＰＢ ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬとなるまで補充し、固定化トランスアミナーゼ（湿ったもので、含水量が７０％～８０％である。）０．１ｇをさらに加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。系についてＨＰＬＣによって転化率を検出し、結果を以下の表に示す。
表８
０．３ｍＬを加えて、主原料１又は２ ０．１ｇを溶解し、イソプロピルアミン塩酸塩４ｅｑとＰＬＰ（５’－ピリドキサールリン酸）１．０ｍｇを加え、０．１Ｍ ＰＢ ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬとなるまで補充し、固定化トランスアミナーゼ（湿ったもので、含水量が７０％～８０％である。）０．１ｇをさらに加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。系についてＨＰＬＣによって転化率を検出し、結果を以下の表に示す。
表８
実施例５：トランスアミナーゼ－補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例３と同様な水相反応によって活性を検証し、結果を以下の表に示す。以下の結果から明らかなように、ＰＥＩ濃度は１％～５％が比較的に適当で、補因子濃度＞５ｍｇ／ｍＬでは、ほぼ違いがなく、節約のために、５～１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、架橋剤の濃度は０．５～１％が最も適宜である。ＰＥＧで修飾された架橋剤で製造された固定化酵素は活性がわずかに向上した。
表９ トランスアミナーゼ補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
実施例３と同様な水相反応によって活性を検証し、結果を以下の表に示す。以下の結果から明らかなように、ＰＥＩ濃度は１％～５％が比較的に適当で、補因子濃度＞５ｍｇ／ｍＬでは、ほぼ違いがなく、節約のために、５～１０ｍｇ／ｍＬが好ましく、架橋剤の濃度は０．５～１％が最も適宜である。ＰＥＧで修飾された架橋剤で製造された固定化酵素は活性がわずかに向上した。
表９ トランスアミナーゼ補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
実施例１の方法に従って、ケトレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
０．１ｇを溶解し、０．１Ｍ ＰＢ ７．０ ０．５ｍＬとＮＡＤ＋ １～１０ｍｇを加え、さらに固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）０．１ｇを加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。系についてＧＣにより転化率を検出し、反応データを以下の表に示す。
表１０：ケトレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
実施例２の方法と同様にケトレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
実施例６と同様に固定化酵素の酵素活性や安定性を検出した。検出結果を以下の表に示す。
表１１
ケトレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
表１１
ケトレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例１の方法に従って、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
固定化酵素の活性について以下の基質５を用いて反応を行うことで検出した。
５００ｍｇ、５ｍｇ ＮＡＤＰ＋を含む０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ８．０）３ｍＬを加え、次に、アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ－Ｔｂ遊離酵素５０ｍｇ及びＣＨＭＯ固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）０．１ｇを加えた。３０℃で１６～２０時間反応し、転化率をテストし、反応が終了するたびに固定化酵素を分離し、次の反応に繰り返して使用し、繰り返し使用回数を調べた。結果を以下の表に示す。
表１２
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ－補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例２と同様に、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ－補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体を製造した。
実施例８と同様に、固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数を検出し、結果を以下の表に示す。
表１３
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ－補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
表１３
シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ－補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
エンレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例１の方法に従って、エンレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数については、以下の基質６を用いて反応を行うことで検出した。
ＰＢ（ｐＨ７．０～８．０）３ｍＬを１０ｍｌ反応フラスコに投入し、次に、基質６ １００ｍｇを加え、次に、ＮＡＤ（Ｐ）＋ １０ｍｇ、ギ酸アンモニウム８０ｍｇ、ＦＤＨ
２０ｍｇ及びＥＲＥＤ固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である）１００ｍｇを加えた。３０℃で１６～２０時間反応させ、転化率をテストし、反応が終了するたびに固定化酵素を分離し、次の反応に繰り返して使用し、繰り返し使用回数を調べた。テスト結果を以下の表に示す。
表１４
エンレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
エンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例２の方法と同様に、エンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
実施例１０と同様に、固定化酵素の酵素活性や安定性を検出し、結果を以下の表に示す。
表１５
エンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
表１５
エンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
ニトリラーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例１の方法に従って、ニトリラーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数について、以下の基質７を用いて反応を行うことで検出した。
ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０～８．０）２ｍＬを１０ｍＬ反応フラスコに投入し、上記の基質９ １００ｍｇを加え、次に、ＮＩＴ含有固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）２００ｍｇを加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、反応が終了するたびに固定化酵素を分離し、次の反応に繰り返して使用し、繰り返し使用回数を調べた。テスト結果を以下の表に示す。
表１６
ニトリラーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
ニトリラーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例２の方法と同様に、ニトリラーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
実施例１２と同様に、固定化酵素の酵素活性や安定性を検出し、結果を以下の表に示す。
表１７
ニトリラーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
表１７
ニトリラーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
イミンレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例１の方法にしたがって、イミンレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
固定化酵素の活性については、以下の基質８を用いて反応を行うことで検出した。
ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０～８．０）２ｍＬを１０ｍＬ反応球に投入し、次に、上記の基質８ １００ｍｇ、ＮＡＤ＋ １０ｍｇ、ギ酸アンモニウム６０ｍｇ、ＦＤＨ
１０ｍｇ及びＩＲＥＤ固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）１００ｍｇを加えた。３０℃で２０時間反応させた後、転化率を検出し、反応が終了するたびに固定化酵素を分離し、次の反応に繰り返して使用し、繰り返し使用回数を調べた。テスト結果を以下の表に示す。
表１８
イミンレダクターゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
イミンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例２の方法と同様に、イミンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
実施例１４と同様に、固定化酵素の酵素活性や安定性を検出し、結果を以下の表に示す。
表１９
イミンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
表１９
イミンレダクターゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
アンモニアリアーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例１の方法にしたがって、アンモニアリアーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数については、以下の基質９を用いて反応を行うことで検出した。
１００ｍｇを加え、次に、アンモニアリアーゼ含有固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）２００ｍｇを加えた。３０℃で１６～２０時間反応させた後、転化率を検出し、反応が終了するたびに固定化酵素を分離し、次の反応に繰り返して使用し、繰り返し使用回数を調べた。テスト結果を以下の表に示す。
表２０
アンモニアリアーゼ－グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
アンモニアリアーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例２の方法と同様に、アンモニアリアーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
実施例１６と同様に、固定化酵素の酵素活性や安定性を検出し、結果を以下の表に示す。
表２１
アンモニアリアーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
表２１
アンモニアリアーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数
アミノ酸デヒドロゲナーゼグルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例１の方法に従って、アミノ酸デヒドロゲナーゼグルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数については、以下の基質１０、１１又は１２を用いて反応することで検出した。
Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０～９．０）５ｍＬを加え、主原料１０、１１又は１２ １００ｍｇを溶解させ、塩化アンモニウム１０８ｍｇを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋１０～５０ｍｇ、ＧＤＨ
５０ｍｇ及び固定化ＡＡＤＨ湿酵素１００ｍｇを加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。系についてＨＰＬＣによって転化率を検出し、反応データを以下に示す。
表２２
アミノ酸デヒドロゲナーゼグルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素集合体の水相反応の活性試験
実施例２の方法と同様に、アンモニアリアーゼ補因子－ＰＥＩ共有結合固定化酵素を製造した。
実施例１８と同様に、固定化酵素の酵素活性や安定性を検出し、結果を以下の表に示す。
表２３
アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
表２３
アミノ酸デヒドロゲナーゼ補因子活性化ＰＥＩ共有結合固定化酵素の水相反応の概要
共固定化されたＴＡ、ＬＤＨ及びＦＤＨの３種類の酵素と、グルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩとの共有結合固定化
固定化：
酵素（ＴＡ：ＬＤＨ：ＦＤＨ）１０ｍＬを所定の割合で混合し、丸底揺れフラスコに投入し、５～１０℃に冷却した後、１０分混合した。沈殿剤例えば硫酸アンモニウム（４５％～６５％）、又はＰＥＧ（２０％～６０％）を緩やかに加えて、３０～６０分混合し、沈殿酵素を得た。沈殿酵素に活性化ＰＥＩ溶液１５ｍＬを滴下し、１０～３０分混合して、１～２時間静置した後、遠心分離した。不溶性沈殿物を収集して、３０メッシュの篩にかけた。自然環境で乾燥させた後、０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨが７．５で、０．５Ｍ ＮａＣｌが含有された。）で３時間浸漬し、次に、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ７．５）でリンスした。
得た共固定化酵素について、以下の方法によって酵素活性をテストした。
１０ｍＬ反応フラスコに、０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、溶解主原料１２ １００ｍｇ、メチオニン８０ｍｇ及びＰＬＰ（５’－ピリドキサールリン酸）５ｍｇを加え、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋５ｍｇ、共固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）１００ｍｇを加えた。３０℃で１６～２０時間撹拌した。系についてＨＰＬＣによって転化率を検出し、反応データを以下の表に示す。
表２４
ＰＢ（ｐＨ８．０）５ｍＬを加え、溶解主原料１２ １００ｍｇ、メチオニン８０ｍｇ及びＰＬＰ（５’－ピリドキサールリン酸）５ｍｇを加え、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋５ｍｇ、共固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）１００ｍｇを加えた。３０℃で１６～２０時間撹拌した。系についてＨＰＬＣによって転化率を検出し、反応データを以下の表に示す。
表２４
トランスアミナーゼグルタルアルデヒド修飾ＰＥＩ共有結合固定化酵素の充填層連続反応における使用
実施例３におけるトランスアミナーゼＴＡ－Ｃｖ－グルタルアルデヒド修飾ＰＥＩ共有結合固定化酵素をカラム体積１２０ｍＬのカラム反応器に充填し、固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）の使用量は９０ｇとした。
基質１
５００ｇをメタノール１．５Ｌで溶解し、イソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩水溶液１．８Ｌ）４ｅｑとＰＬＰ ５ｇを加え、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）を加えずに、５Ｌに定容した。
５００ｇをメタノール１．５Ｌで溶解し、イソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍイソプロピルアミン塩酸塩水溶液１．８Ｌ）４ｅｑとＰＬＰ ５ｇを加え、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）を加えずに、５Ｌに定容した。
流速０．６ｍＬ／分、即ち、保留時間を２００分にして、連続反応を行い、出口端からの流出液について転化率を検出した結果、転化率＞９２％であり、運行を５００時間持続しても、転化率の低下が認められなかった。
実施例２２
トランスアミナーゼ－補因子修飾ＰＥＩ固定化酵素の連続撹拌タンクによる反応における使用
実施例２の方法と同様に製造されたトランスアミナーゼ－補因子修飾ＰＥＩ固定化酵素６０ｇを、２００ｍＬ反応器に加えて、リン酸緩衝液１５０ｍＬを加えた。
トランスアミナーゼ－補因子修飾ＰＥＩ固定化酵素の連続撹拌タンクによる反応における使用
実施例２の方法と同様に製造されたトランスアミナーゼ－補因子修飾ＰＥＩ固定化酵素６０ｇを、２００ｍＬ反応器に加えて、リン酸緩衝液１５０ｍＬを加えた。
基質１
５００ｇに、ＰＢ（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）３．２Ｌ、イソプロピルアミン塩酸塩水溶液（６Ｍ）１．８Ｌ、及びＰＬＰ ５ｇを加えて、スラリー化して懸濁液とした。
５００ｇに、ＰＢ（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）３．２Ｌ、イソプロピルアミン塩酸塩水溶液（６Ｍ）１．８Ｌ、及びＰＬＰ ５ｇを加えて、スラリー化して懸濁液とした。
反応フラスコに基質懸濁液を０．４ｍＬ／分の速度で連続して添加しながら（即ち保留時間が５００分である。）、同様な流速で出口から反応系（固定化酵素の抽出をしないように、管路の末端にはフィルタが増設された。）を抽出した。この条件では、転化率は９０％以上に達し、そして、６００時間連続して運行しても、転化率にはほぼ低下が認められなかった。
実施例２３
ＴＡ、ＬＤＨ及びＦＤＨの３種類の酵素とグルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩとの共有結合固定化酵素の連続撹拌タンクによる反応における使用
実施例２０と同様な共固定化酵素を２００ｍＬ反応器に投入し、トランスアミナーゼＴＡ－Ｂｔ、副酵素ＬＤＨ及びＦＤＨの共固定化酵素７０ｇを加え、リン酸緩衝液１５０ｍＬを加えた。
ＴＡ、ＬＤＨ及びＦＤＨの３種類の酵素とグルタルアルデヒドで活性化されたＰＥＩとの共有結合固定化酵素の連続撹拌タンクによる反応における使用
実施例２０と同様な共固定化酵素を２００ｍＬ反応器に投入し、トランスアミナーゼＴＡ－Ｂｔ、副酵素ＬＤＨ及びＦＤＨの共固定化酵素７０ｇを加え、リン酸緩衝液１５０ｍＬを加えた。
基質１２
５００ｇ、塩化アンモニウム１０８ｍｇを、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）４．５Ｌで溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨをｐＨ７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋
１０～５０ｍｇ、ギ酸アンモニウム８０ｍｇを加え、最後に、ＰＢ緩衝液で５Ｌに定容した。
５００ｇ、塩化アンモニウム１０８ｍｇを、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）４．５Ｌで溶解し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨをｐＨ７．５～８．０に調整し、次に、ＮＡＤ＋
１０～５０ｍｇ、ギ酸アンモニウム８０ｍｇを加え、最後に、ＰＢ緩衝液で５Ｌに定容した。
連続撹拌タンクに基質を０．８ｍＬ／分の速度で連続して添加しながら（即ち保留時間が２５０分である。）、同様な流速で出口から反応系（固定化酵素を抽出しないように、管路の末端にフィルタが増設された。）を抽出した。この条件では、転化率は９２％以上に達し、６００時間連続して運行しても、転化率にはほぼ低下が認められなかった。
実施例２４
実施例２の方法と同様に、製造されたケトレダクターゼＫＲＥＤ－Ａｃ固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）８ｇを１０ｍＬカラム反応器に充填した。
実施例２の方法と同様に、製造されたケトレダクターゼＫＲＥＤ－Ａｃ固定化酵素（湿ったもので、含水量が７０～８０％である。）８ｇを１０ｍＬカラム反応器に充填した。
基質３
１００ｇを、イソプロピルアルコール０．３Ｌで溶解し、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）０．７Ｌを加えて溶解し、次に、ＮＡＤ＋０．１ｇを加えた。
１００ｇを、イソプロピルアルコール０．３Ｌで溶解し、ＰＢ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．０）０．７Ｌを加えて溶解し、次に、ＮＡＤ＋０．１ｇを加えた。
流速を０．０５ｍＬ／分、即ち保留時間を２００分として、連続反応を行い、出口端からの流出液について転化率を検出した結果、転化率が＞９０％であり、運行を５００時間持続しても、転化率には低下が認められなかった。
以上から分かるように、本発明の上記の実施例は以下の技術的効果を達成させる。酵素とＰＥＩとを固定化し、酵素をＰＥＩからなる重合網状構造の間に固定化することで、機械的安定性を向上させ、酵素の固定化を実現し、固定化中に酵素がグルタルアルデヒドなどの架橋剤と直接共有結合することによる活性低下を回避する。
以上は本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明ではさまざまな変更や変化が可能である。本発明の主旨や範囲を逸脱することなく行われる修正、等同置換や改良であれば、本発明の特許範囲に含まれるものとする。
Claims (50)
- 活性化されたカチオン性ポリマーと、活性化された前記カチオン性ポリマーに共有結合された酵素とからなり、
前記活性化されたカチオン性ポリマーは、補因子又は架橋剤で活性化されたＰＥＩであり、前記架橋剤は、ポリオールで処理された又は処理されていない架橋剤であり、
前記酵素は、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、エンレダクターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びニトリラーゼから選ばれるいずれか１種である、固定化酵素。 - 前記トランスアミナーゼは、バチルス・チューリンゲンシス、アルスロバクター・シトレウス又はクロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ３０１９１に由来し、
前記ケトレダクターゼは、アセトバクター属ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１又はキャンディダ・マセドニエンシスＡＫＵ４５８８に由来し、
前記モノオキシゲナーゼは、ブラキモナス・ペトロレオボランス又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、
前記アンモニアリアーゼは、フォトラブダス・ルミネッセンス又はソレノステモン・スクテラリオイデスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、
前記エンレダクターゼは、サッカロミケス・セレビシエ又はクリセオバクテリウム属ＣＡ４９に由来し、
前記イミンレダクターゼは、ストレプトマイセス属又はバチルス・セレウスに由来し、前記アミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス・セレウスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼ又はバチルス・スフェリカスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、
前記ニトリラーゼは、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ ５１３．８８又はアカパンカビＯＲ７４Ａに由来する、請求項１に記載の固定化酵素。 - 前記ＰＥＩの分子量が３ＫＤａ～６００ＫＤａである、請求項１又は２に記載の固定化酵素。
- 前記酵素と前記ＰＥＩとの質量比が０．１～１．５：１である、請求項１又は２に記載の固定化酵素。
- 前記補因子はＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰであり、前記架橋剤はグルタルアルデヒドである、請求項１又は２に記載の固定化酵素。
- 前記ポリオールはＰＥＧである、請求項１又は２に記載の固定化酵素。
- 前記ＰＥＧはＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００である、請求項６に記載の固定化酵素。
- 前記酵素は１種又は複数種であり、前記補因子は１種又は複数種であり、１種又は複数種の前記補因子は１種又は複数種の前記酵素に対応する、請求項５に記載の固定化酵素。
- 前記補因子と前記ＰＥＩとの質量比が１～８０：１２０である、請求項５に記載の固定化酵素。
- 前記補因子と前記ＰＥＩとの質量比が１～６０：１００である、請求項５に記載の固定化酵素。
- 固定化酵素の製造方法であって、
カチオン性ポリマーＰＥＩを活性化剤で活性化させて、活性化されたカチオン性ポリマーを得るステップと、
酵素と前記活性化されたカチオン性ポリマーとを固定化し、前記活性化されたカチオン性ポリマーと前記酵素とからなる前記固定化酵素を得るステップとを含み、
前記活性化剤はポリオールで修飾されていない架橋剤、ポリオールで修飾された架橋剤又は補因子であり、
前記酵素は、トランスアミナーゼ、ケトレダクターゼ、モノオキシゲナーゼ、アンモニアリアーゼ、エンレダクターゼ、イミンレダクターゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びニトリラーゼから選ばれるいずれか１種である、製造方法。 - 前記ＰＥＩを前記活性化剤で活性化させる前に、前記ＰＥＩを前処理するステップをさらに含む、請求項１１に記載の製造方法、
- 前記前処理は、
ＰＥＩを純水で最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～８ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、希釈ＰＥＩを得ることと、
前記希釈ＰＥＩのｐＨを５～１１に調整して、前処理後のＰＥＩを得ることとを含む、請求項１２に記載の製造方法。 - 前記前処理は、
ＰＥＩを純水で最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～５ｇ／１００ｍＬとなるまで希釈し、希釈ＰＥＩを得ることと、
前記希釈ＰＥＩのｐＨを５～１１に調整して、前処理後のＰＥＩを得ることとを含む、請求項１２に記載の製造方法。 - 前記前処理は、
ＰＥＩを純水で最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～８ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、希釈ＰＥＩを得ることと、
前記希釈ＰＥＩのｐＨを７～１０に調整して、前処理後のＰＥＩを得ることとを含む、請求項１２に記載の製造方法。 - 前記前処理は、
ＰＥＩを純水で最終濃度が１ｇ／１００ｍＬ～５ｇ／１００ｍＬとなるように希釈し、希釈ＰＥＩを得ることと、
前記希釈ＰＥＩのｐＨを７．０～１０．０に調整して、前処理後のＰＥＩを得ることとを含む、請求項１２に記載の製造方法。 - 前記酵素は沈殿酵素であり、前記架橋剤はグルタルアルデヒドであり、前記活性化剤はグルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドである、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の製造方法・
- 前記前処理のステップにおいて、前記希釈ＰＥＩのｐＨを５．０～１１．０に調整して、前処理後の前記ＰＥＩを得る、請求項１７に記載の製造方法。
- 前記希釈ＰＥＩのｐＨを７．０～１０．０に調整する、請求項１７に記載の製造方法。
- 前記ＰＥＩを前記活性化剤で活性化させて、活性化ＰＥＩを得るステップは、
前処理後の前記ＰＥＩに前記グルタルアルデヒド又は前記ＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドを滴下し、系中の前記グルタルアルデヒド又は前記ＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドの最終濃度を０．１ｇ／１００ｍＬ～４ｇ／１００ｍＬに制御し、前記活性化ＰＥＩを得ることを含む、請求項１７に記載の製造方法。 - 前記ＰＥＩを前記活性化剤で活性化させて、活性化ＰＥＩを得るステップは、
前処理後の前記ＰＥＩに前記グルタルアルデヒド又は前記ＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドを滴下し、系中の前記グルタルアルデヒド又は前記ＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドの最終濃度を０．３ｇ／１００ｍＬ～２ｇ／１００ｍＬに制御し、前記活性化ＰＥＩを得ることを含む、請求項１７に記載の製造方法。 - 前記沈殿酵素は沈殿剤を用いて酵素を沈殿させたものであり、前記沈殿剤は有機溶媒、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００又は分子量３ＫＤａ～７０ＫＤａのＰＥＩから選ばれる、請求項１７に記載の製造方法。
- 前処理後の前記ＰＥＩに前記グルタルアルデヒド又は前記ＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドを滴下する過程において、前記グルタルアルデヒド又は前記ＰＥＧで修飾されたグルタルアルデヒドの滴下速度が１０ｍＬ／分～５０ｍＬ／分に制御される、請求項２０又は２１に記載の製造方法。
- 前記滴下において、撹拌ステップをさらに含み、前記撹拌の温度が４℃～２５℃、前記撹拌の速度が５０ｒｐｍ～４００ｒｐｍ、前記撹拌の時間が１～１２時間である、請求項２３に記載の製造方法、
- 前記撹拌の速度が１００ｒｐｍ～３００ｒｐｍである、請求項２４に記載の製造方法。
- 前記撹拌の時間が２時間～１０時間である、請求項２４に記載の製造方法。
- 前記酵素と活性化ＰＥＩとを固定して、前記固定化酵素を得るステップは、
前記沈殿酵素に前記活性化ＰＥＩを滴下して、混合物を得ることと、
前記混合物に対して静置、遠心分離、篩分け及び乾燥処理を順次行い、前記固定化酵素を得ることとを含む、請求項１７に記載の製造方法。 - 前記沈殿酵素と前記活性化ＰＥＩとの質量比が０．２～１：１である、請求項２７に記載の製造方法。
- 前記静置の時間が１時間～５時間である、請求項２７に記載の製造方法。
- 前記篩分けは２０メッシュ～５０メッシュの篩にかけることである、請求項２７に記載の製造方法。
- 前記乾燥は自然乾燥である、請求項２７に記載の製造方法。
- 前記乾燥は一晩乾燥である、請求項２７に記載の製造方法。
- 前記混合物を乾燥させた後かつＰＥＩ固定化酵素を得る前に、
ｐＨ７．０～８．０のリン酸塩緩衝液、水及び前記リン酸塩緩衝液を用いて乾燥後の前記混合物を順次３～５回ずつ洗浄するステップをさらに含む、請求項２７に記載の製造方法。 - 前記酵素は遊離酵素であり、前記活性化剤は補因子であり、前記補因子はＰＬＰ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰである、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の製造方法。
- 前記前処理のステップにおいて、前記希釈ＰＥＩの濃度を精製水で１ｇ／１００ｍＬ～８ｇ／１００ｍＬに調整して、ｐＨを６～１１とし、前処理後の前記ＰＥＩを得る、請求項３４に記載の製造方法。
- 前記希釈ＰＥＩの濃度を精製水で１ｇ／１００ｍＬ～３ｇ／１００ｍＬに調整する、請求項３５に記載の製造方法。
- 前記希釈ＰＥＩのｐＨを８．０～１１．０に調整する、請求項３５に記載の製造方法。
- ＰＥＩを前記活性化剤で活性化させて、活性化ＰＥＩを得るステップは、
前処理後の前記ＰＥＩに前記補因子を加え、前記補因子の最終濃度を０．３ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬに制御し、次に、１０分～６００分撹拌して、前記活性化ＰＥＩを得ることを含む、請求項３５に記載の製造方法。 - 前記補因子の最終濃度を１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬに制御する、請求項３８に記載の製造方法。
- ３０分～１８０分撹拌する、請求項３８に記載の製造方法。
- 前記遊離酵素は１種の酵素の酵素液又は複数種の酵素の混合液であり、１種又は複数種の前記補因子は１種又は複数種の前記酵素に対応する、請求項３４に記載の製造方法。
- 前記酵素と前記活性化ＰＥＩとを結合して、前記固定化酵素を得るステップは、
４℃～２５℃で、前記遊離酵素の酵素液に前記活性化ＰＥＩを滴下して、ＰＥＩ吸着酵素を得ることと、
前記ＰＥＩ吸着酵素に架橋剤を滴下して固定化し、ＰＥＩ固定化酵素を得ることとを含む、請求項３８に記載の製造方法。 - 前記遊離酵素の濃度が０．０５ｇ／ｍＬ～０．３ｇ／ｍＬである、請求項４２に記載の製造方法。
- 前記ＰＥＩと前記遊離酵素との質量比が０．２～１：１である、請求項４２に記載の製造方法。
- 前記ＰＥＩ吸着酵素に前記架橋剤を滴下して固定化し、前記ＰＥＩ固定化酵素を得るステップは、
前記ＰＥＩ吸着酵素に前記架橋剤を滴下し、前記架橋剤の最終濃度を０．２ｇ／１００ｍＬ～１ｇ／１００ｍＬに制御し、固定化対象物を得ることと、
前記固定化対象物に対して静置、遠心分離及び乾燥を順次行い、乾燥酵素を得ることと、
前記乾燥酵素を洗浄して、前記固定化酵素を得ることとを含む、請求項４２に記載の製造方法。 - 前記静置の時間は１０分～３００分であり、前記乾燥は自然乾燥であり、前記洗浄は、順次、リン酸塩緩衝液で３回～５回洗浄し、水で３回～５回洗浄し、及びリン酸塩緩衝液で３回～５回洗浄することであり、前記リン酸塩緩衝液はＮａＣｌを含み、ＮａＣｌの濃度が０．５Ｍ～１Ｍである、請求項４５に記載の製造方法。
- 前記静置の時間が３０分～１２０分である、請求項４５に記載の製造方法。
- 前記トランスアミナーゼは、バチルス・チューリンゲンシス、アルスロバクター・シトレウス又はクロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ３０１９１に由来し、
前記ケトレダクターゼは、アセトバクター属ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１又はキャンディダ・マセドニエンシスＡＫＵ４５８８に由来し、
前記モノオキシゲナーゼは、ブラキモナス・ペトロレオボランス又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、
前記アンモニアリアーゼは、フォトラブダス・ルミネッセンス又はソレノステモン・スクテラリオイデスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼであり、
前記エンレダクターゼは、サッカロミケス・セレビシエ又はクリセオバクテリウム属ＣＡ４９に由来し、
前記イミンレダクターゼは、ストレプトマイセス属又はバチルス・セレウスに由来し、
前記アミノ酸デヒドロゲナーゼは、バチルス・セレウスに由来するロイシンデヒドロゲナーゼ又はバチルス・スフェリカスに由来するフェニルアラニンデヒドロゲナーゼであり、
前記ニトリラーゼは、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ ５１３．８８又はアカパンカビＯＲ７４Ａに由来する、請求項１１に記載の製造方法。 - 請求項１～１０のいずれか１項に記載の固定化酵素又は請求項１１～４８のいずれか１項の製造方法によって製造される固定化酵素の生体触媒反応における使用。
- 前記生体触媒反応は、バッチ反応又は連続反応である、請求項４９に記載の使用。
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