CN104774830B - 一种转氨酶的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种转氨酶的固定化方法。将聚乙烯醇海绵上的羟基氧化为羰基，加入转氨酶将羰基转化为氨基，絮凝后，再用多元醛交联固定化，得固定化转氨酶。该固定化方法，具有酶活单位为高，可纯化酶等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种转氨酶的固定化方法。
背景技术
转氨酶可将化合物中的羰基转化为氨基。可以高效生产手性胺，因其底物相对廉价、产物纯度高、反应条件温和的特点，应用价值巨大。
固定化酶易于与产品分离并可回收重复使用，比游离酶具有更好的稳定性以及更长的操作周期。酶或细胞的固定化方法很多，如物理吸附、亲和联结、共价交联、凝絮包埋等。
CN201280031237使用树脂为载体固定转氨酶，但以树脂为载体，存在树脂价格昂贵，载酶量低的缺点。以该专利实施例1～5为例，1克树脂载体仅能固载0.125克转氨酶，固定化转氨酶酶活单位低；且现有固定化方法无纯化过程，会将游离酶中的杂质蛋白也固定于载体。
聚乙烯醇海绵是由聚乙烯醇缩醛化而得，具有优异的吸水和力学性能，比表面积大，有作为转氨酶固定化载体的潜质，但聚乙烯醇海绵仅含有羟基活性基团，不利于采用化学键固定转氨酶。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种经济可行的，载酶量高、固定化酶酶活高、有纯化作用的转氨酶的固定化方法。
本发明提供了一种转氨酶的固定化方法，其特征包括如下步骤：
a、氧化：取聚乙烯醇海绵，在双氧水溶液中，加入铁盐为催化剂，将聚乙烯醇海绵上部分羟基氧化为羰基；氧化后的聚乙烯醇海绵离心或挤压去除氧化溶液，加水，再离心或挤压脱水。
b、转氨：将脱水海绵与转氨酶水溶液混合，加入辅酶、氨基供体，将海绵上的羰基转化氨基；再离心或挤压去除海绵中溶液。
c、交联固定：加入絮凝剂使酶沉淀于海绵孔壁内，再离心或挤压去除海绵中溶液；再将海绵与多元醛混合交联转氨酶，离心或挤压去除海绵中溶液。
d、视需要重复步骤b至c数次，以增加酶或细胞在载体上的载量。水洗涤固定化酶。
其中，a步骤所述的双氧水溶液体积浓度为0.01～0.1％，双氧水溶液与聚乙烯醇海绵重量比为20～100:1。
其中，a步骤所述的铁盐选自硫酸亚铁、硫酸铁、氯化亚铁、氯化铁的一种或多种。
其中，a步骤所述的氧化反应温度为20℃～70℃，进一步优选为55℃～65℃。
其中，b步骤所述的氨基供体为2-丙胺。
其中，b步骤所述的辅酶为B族维生素，进一步优选为吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛的一种或多种。
其中，b步骤所述的转氨反应温度为20℃～60℃。
其中，c步骤所述的絮凝剂选自壳聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、羧甲基聚乙烯亚胺(CMPEI)。
其中，c步骤所述的多元醛为戊二醛。
本发明的有益技术效果：
1、使用聚乙烯醇海绵为载体，聚乙烯醇海绵具有孔洞丰富，比较面积大，载酶量大的特点；2、聚乙烯醇海绵中部分羟基氧化为羰基，羰基经转氨酶转化为氨基，氨基通过戊二醛与转氨酶化学交联，化学键连接酶与载体更牢固，酶不易脱落，稳定性好；3、转氨过程中，转氨酶进入海绵孔洞，催化海绵上的羰基转化为氨基，从而转氨酶“富集”于海绵中，加入絮凝剂，转氨酶则沉淀于海绵孔壁内，其他杂质则无该“富集”现象，杂质在“离心或挤压去除海绵中溶液”步骤中随溶液被除去，本发明对转氨酶有纯化作用，可在固定化酶应用过程中消除部分杂酶引起的副反应。
具体实施方式
实施例1
本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
a、将聚乙烯醇海绵切成27mm3，取10.0克海绵颗粒加入烧杯中，加入1000ml水，机械搅拌，加入0.010g硫酸亚铁，加入1.00ml 30％双氧水，升温至60℃，反应4小时。将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干，在将布袋浸泡于纯化水中5分钟，再将布袋中的海绵颗粒挤压干脱水，得氧化聚乙烯醇海绵。
b、将氧化聚乙烯醇海绵，加入烧杯中，加入1000ml水，机械搅拌，加入10克ATA-113转氨酶加入1克异丙胺盐酸盐，加入0.50克磷酸吡哆醛，用异丙胺调节pH至7.5,加热至40℃反应6小时，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干，得氨基化聚乙烯醇海绵。
c、将氨基化聚乙烯醇海绵倒入烧杯中，加入0.1％壳聚糖溶液100ml，混合10分钟，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干；将所得海绵倒入烧杯中，加入0.1％戊二醛溶液100ml，混合，静置5分钟，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干，得固定化酶。
将所得固定化酶重复步骤b至c5次，以增加酶在载体上的载量。
纯化水浸泡固定化酶，挤压脱水，40℃真空干燥8小时，得31.7克固定化转氨酶。
每1克聚乙烯醇海绵载体固载约2克转氨酶，远远优于CN2012800312371克树脂载体仅能固载0.125克转氨酶的水平；酶活收率高达96％，说明未固载损失的重量为去除的杂质的重量。
实施例2
本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
a、将聚乙烯醇海绵切成27mm3。2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入10.00千克海绵颗粒，加入加入10克硫酸亚铁，加入1.00升30％双氧水，升温至55℃，反应5小时。将反应液使用三足式离心机过滤，加入纯化水洗涤，离心脱水，得氧化聚乙烯醇海绵。
b、2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入氧化聚乙烯醇海绵，加入20千克ATA-117转氨酶加入2.00千克异丙胺盐酸盐，加入0.75千克磷酸吡哆醛，用异丙胺调节pH至8.0,加热至37℃反应8小时，将反应液离心过滤，脱除溶液，得氨基化聚乙烯醇海绵。
c、将氨基化聚乙烯醇海绵倒入100升0.3％壳聚糖溶液中，混合10分钟，将混合液离心过滤，脱除溶液；将所得海绵倒入烧杯中，加入100升0.2％戊二醛溶液中，混合，静置10分钟，将将混合液离心过滤，脱除溶液，得固定化酶。
将所得固定化酶重复步骤b至c3次，以增加酶在载体上的载量。
纯化水洗涤，离心脱水，40℃真空干燥12小时，得35.32千克固定化转氨酶。
实施例3
本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
a、将聚乙烯醇海绵切成27mm3。2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入10.00千克海绵颗粒，加入加入10克氯化铁和5千克氯化亚铁，加入4.00升10％双氧水，升温至60℃，反应5小时。将反应液使用三足式离心机过滤，加入纯化水洗涤，离心脱水，得氧化聚乙烯醇海绵。
b、2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入氧化聚乙烯醇海绵，加入5千克ATA-117转氨酶加入2.00千克异丙胺盐酸盐，加入0.5千克磷酸吡哆醇和0.5千克磷酸吡哆胺，用异丙胺调节pH至8.0,加热至30℃反应8小时，将反应液离心过滤，脱除溶液，得氨基化聚乙烯醇海绵。
c、将氨基化聚乙烯醇海绵倒入100升0.4％聚乙烯亚胺溶液中，混合10分钟，将混合液离心过滤，脱除溶液；将所得海绵倒入烧杯中，加入100升0.3％戊二醛溶液中，混合，静置8分钟，将将混合液离心过滤，脱除溶液，得固定化酶。
将所得固定化酶重复步骤b至c 12次，以增加酶在载体上的载量。
纯化水洗涤，离心脱水，40℃真空干燥14小时，得35.87千克固定化转氨酶。
Claims (10)
1.一种转氨酶的固定化方法，其特征包括如下步骤：
a、氧化：取聚乙烯醇海绵，在双氧水溶液中，加入铁盐为催化剂，20℃～70℃反应,将聚乙烯醇海绵上部分羟基氧化为羰基；氧化后的聚乙烯醇海绵离心或挤压去除氧化溶液，加水，再离心或挤压脱水；
b、转氨：将脱水海绵与转氨酶水溶液混合，加入辅酶、氨基供体，将海绵上的羰基转化氨基；再离心或挤压去除海绵中溶液；
c、交联固定：加入絮凝剂使酶沉淀于海绵孔壁内，再离心或挤压去除海绵中溶液；再将海绵与多元醛混合交联转氨酶，离心或挤压去除海绵中溶液；
d、视需要重复步骤b至c步0～20次，以增加酶或细胞在载体上的载量，水洗涤固定化酶。
2.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述的双氧水溶液体积浓度为0.01～0.1％，双氧水溶液与聚乙烯醇海绵重量比为20～100:1。
3.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述的铁盐为硫酸亚铁、硫酸铁、氯化亚铁、氯化铁中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述反应温度为55℃～65℃。
5.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的氨基供体为2-丙胺。
6.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的辅酶为B族维生素。
7.根据权利要求6所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的B族维生素为吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的转氨反应温度为20℃～60℃。
9.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步骤所述的絮凝剂选自壳聚糖、聚乙烯亚胺、羧甲基聚乙烯亚胺中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步骤所述的多元醛为戊二醛。
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