CN110129306A - 固定化转氨酶及其应用 - Google Patents

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CN110129306A CN201910076744.4A CN201910076744A CN110129306A CN 110129306 A CN110129306 A CN 110129306A CN 201910076744 A CN201910076744 A CN 201910076744A CN 110129306 A CN110129306 A CN 110129306A
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王仲清
刘彬
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    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Abstract

本发明涉及固定化转氨酶及其应用，属于制药技术领域。所述固定化转氨酶是ω‑转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体可以是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。所述固定化转氨酶结合牢固、可重复利用次数多。所述固定化酶可以应用于制备氨基化合物，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。

Description

固定化转氨酶及其应用
技术领域
本发明涉及固定化转氨酶及其应用，属于制药技术领域。
背景技术
贝西沙星(besifloxacin)是一种新的用于治疗结膜炎的第四代喹诺酮类抗菌剂；贝西沙星的制备方法中一般需要中间体化合物III：在已知的方法中，使用酶催化羰基化合物得到氨基化合物是比较经济和环保的方法，但已知的酶催化方法中使用的为液体的酶或酶粉，其存在反应体系中因有蛋白质而难以过滤反应液的现象，且滤液中易含有细胞碎片，在萃取分层时易出现乳化现象，此外，因反应使用有机溶剂，易导致酶失活而不能重复套用，这些问题，导致酶催化方法难以在产业化中应用。
因而，目前关于贝西沙星中间体化合物III的酶催化制备工艺仍有需要进行改进。
发明内容
本发明旨在提供一种酶或方法以解决上述现有技术的问题。
第一方面，本发明提供一种固定化转氨酶，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体可以是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。
所述酶固定化载体可以是树脂的各种型号，如所述环氧树脂可以是LX-1000EP或200EP型号或其它型号，所述氨基载体树脂可以是HAA或1000EPN型号或其它型号，所述吸附载体树脂可以是EP120或EP130型号或其它型号，所述离子交换载体树脂可以是T300或LX-1000Q1A型号或其它型号。
在一些实施方式中，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于氨基载体树脂、吸附载体树脂或离子交换载体树脂上得到的。
在一些实施方式中，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂LX-1000EP或200EP型号、氨基载体树脂HAA或1000EPN型号、吸附载体树脂EP120或EP130型号或者离子交换载体树脂T300或LX-1000Q1A型号。
发明人使用比活力为975.5U/g的游离ω-转氨酶粗粉，经过本发明的方法/方式固定化后得到的固定化转氨酶的比活力约887U/g；所述固定化转氨酶结合牢固、酶活性损失少、分离简单、可重复利用次数多。
本发明中，比活力指每克蛋白质所具有酶的活力单位(U)数；1个活力单位是指在特定条件(温度为25℃，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
酶活回收率＝固定化酶的酶活力/生产固定化酶所用的粗酶粉的酶活力。
另一方面，本发明提供所述固定化转氨酶的制备方法。
一种制备前述固定化转氨酶的方法，包括：ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在15℃-35℃搅拌反应6小时-24小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到所述固定化转氨酶。
在一些实施方式中，ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在20℃-30℃搅拌反应8小时-16小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到固定化转氨酶粗品；所得粗品在pH为8.0-9.5的甘氨酸钠溶液中，在20℃-30℃搅拌8小时-16小时，然后分离，用水洗涤，得到固定化转氨酶产物。
在一些实施方式中，将固定化酶载体进行纯化后再用于制备固定化转氨酶。
在一些实施方式中，将固定化酶载体在pH为7.0-9.0的体系中，搅拌下加入5％的戊二醛水溶液，在15℃-35℃搅拌反应0.5小时-5小时后过滤，用水洗涤，得到固定化酶载体，再用于制备固定化转氨酶。
在一些实施方式中，所述pH为7.0-9.0的体系为磷酸二氢钠-氢氧化钠水溶液体系。在一些实施方式中，所述pH为7.0-9.0的体系为三乙醇胺-盐酸溶液体系。
所述固定化转氨酶的制备过程中，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。
另一方面，本发明提供一种用所述固定化转氨酶制备氨基化合物的方法。
所述固定化转氨酶用于制备氨基化合物过程中，反应条件温和，对环境友好，操作简便，酶活性损失少，酶可多次重复利用，提供的制备方法具有较好的工业应用前景。
一种制备化合物II的方法，包括：化合物I在前述固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，与氨基供体接触反应，得到化合物II，
其中，R为氨基的保护基。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基可为选自叔丁氧羰基、苄基、苄氧羰基、乙酰基、对甲基苯磺酰基、笏甲氧羰基中的任意一种。在一些实施方式中，所述氨基保护基为叔丁氧羰基。在一些实施方式中，所述氨基保护基为苄基或苄氧羰基。
所述反应的反应温度为5℃-60℃。在一些实施方式中，所述反应的反应温度为20℃-60℃，有利于反应进行和控制。
所述反应的反应时间为8小时-30小时。在一些实施方式中，所述反应的反应时间为10小时-16小时，有利于反应控制。
一些实施方式中，在pH值9.0-10.5或9.0-10.0条件下，有利于化合物I与氨基供体接触反应，有利于制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在35℃-60℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在35℃-55℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在45℃-60℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在45℃-55℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，化合物I与氨基供体接触，在50℃-60℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值9.0-10.5条件下，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值9.0-10.5条件下，化合物I与氨基供体接触，在35℃-60℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值9.0-10.5条件下，化合物I与氨基供体接触，在20℃-40℃反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在5℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-30小时，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在10℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-24小时，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在15℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-20小时，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在15℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-16小时，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在20℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-16小时，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在25℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应10小时-16小时，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在25℃-60℃、pH值9.0-11条件下反应8小时-16小时，制得化合物II。
在一些实施方式中，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，化合物I与氨基供体接触，在25℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应8小时-16小时，制得化合物II；有利于操作和控制，所得产物纯度高和收率高。
所述固定化转氨酶与化合物I的质量比可为0.1:1-10:1。在一些实施方式中，所述固定化转氨酶与化合物I的质量比为0.5:1-10:1。在一些实施方式中，所述固定化转氨酶与化合物I的质量比为1:1-5:1，更有利于获得目标产物。
所述磷酸吡哆醛与化合物I的质量比可为0.01:1-1:1。在一些实施方式中，所述磷酸吡哆醛与化合物I的质量比可为0.01:1-0.5:1。在一些实施方式中，所述磷酸吡哆醛与化合物I的质量比可为0.01:1-0.1:1，更有利于反应进行和获得目标产物。
所述磷酸吡哆醛可和5-磷酸吡哆醛可互换使用，其可以被吡哆醛、吡哆胺和/或其磷酸化的对应物替代，也可以被磷酸吡哆素或磷酸吡哆胺替代，也可以被维生素B6家族的其他成员替代。
所述氨基供体为有机胺，或有机胺的盐如有机胺的盐酸盐，或有机胺的水溶液，或有机胺的盐酸盐的水溶液，或它们的任意组合。所述有机胺为异丙胺、丙氨酸、正丙胺、1-苯乙胺、甘氨酸或它们的盐酸盐中的至少一种。在一些实施方式中，所述氨基供体为异丙胺盐酸盐、丙氨酸盐酸盐、正丙胺盐酸盐、1-苯乙胺盐酸盐、甘氨酸盐酸盐中的至少一种。在一些实施方式中，所述氨基供体为丙氨酸盐酸盐。在一些实施方式中，所述氨基供体为异丙胺、异丙胺盐酸盐、异丙胺水溶液、异丙胺盐酸盐水溶液中的至少一种，有利于反应控制，进行和有利于获得目标产物。在一些实施方式中，所述氨基供体为异丙胺和/或其盐酸盐水溶液。在一些实施方式中，所述氨基供体为异丙胺盐酸盐水溶液。
所述氨基供体为有机胺或其盐的水溶液时，其浓度以有机胺计算，可为0.1mol/L-6mol/L。在一些实施方式中，其浓度以有机胺计算，为1mol/L-5mol/L。在一些实施方式中，其浓度以有机胺计算，为1mol/L-4mol/L，有利于反应控制和处理。
所述缓冲溶液可为磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钾溶液、甘氨酸-氢氧化钠溶液、硼砂-氢氧化钠溶液、柠檬酸-氢氧化钠溶液、三乙醇胺-盐酸溶液、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液、巴比妥钠-盐酸溶液、硼砂-硼酸溶液中的至少一种。所述缓冲溶液的浓度以非酸组分或非碱组分计算，可为0.05mol/L-2mol/L，比如，缓冲溶液为磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液时，其浓度以缓冲溶液为磷酸二氢钠计算，缓冲溶液为硼砂-硼酸溶液时，以硼砂计算，缓冲溶液为三乙醇胺-盐酸溶液时以三乙醇胺计算；所述缓冲溶液的pH为8.5-11。
在一些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液，有利于反应进行和反应控制。在一些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液，其pH值为9.0-10.5，有利于反应进行。在一些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液，其pH值为9.0-10.5，浓度为0.2mol/L-2mol/L或0.2mol/L-1mol/L。
在一些实施方式中，所述缓冲溶液为三乙醇胺-盐酸溶液，有利于目标产物的获得。
在一些实施方式中，所述氨基供体的水溶液与缓冲溶液的体积比为10:1-0.5:1。在一些实施方式中，所述氨基供体的水溶液与缓冲溶液的体积比为5:1-0.5:1。在一些实施方式中，所述氨基供体的水溶液与缓冲溶液的体积比为5:1-1:1，有利于反应控制和目标产物的获得。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在缓冲溶液中，化合物I与异丙基胺或其盐酸盐的水溶液接触，在5℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-20小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，化合物I与异丙基胺或其盐酸盐的水溶液接触，在5℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应8小时-20小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，在一些实施方式中，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，化合物I与异丙基胺和/或其盐酸盐的水溶液接触，在15℃-60℃、pH值8.5-11条件下反应10小时-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，在一些实施方式中，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，化合物I与异丙基胺盐酸盐水溶液接触，在15℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应8小时-20小时，得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，在一些实施方式中，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在三乙醇胺-盐酸溶液中，化合物I与异丙基胺盐酸盐水溶液接触，在15℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应8小时-20小时，得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，在一些实施方式中，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，化合物I与异丙基胺盐酸盐水溶液接触，在20℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应8小时-16小时，得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，在一些实施方式中，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，化合物I与异丙基胺盐酸盐水溶液接触，在25℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应10小时-14小时，得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，在一些实施方式中，所述氨基保护基团为叔丁氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，化合物I与2mol/L的异丙基胺盐酸盐水溶液接触，在25℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应10小时-14小时，得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为苄基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，使所述化合物I与异丙基胺和/或其盐酸盐的水溶液在40℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应10小时-14小时，得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为苄基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在的条件下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，使所述化合物I与异丙基胺盐酸盐在35℃-55℃、pH值9.0-10.5条件下反应10-14小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为苄氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在的条件下，在缓冲溶液中，使所述化合物I与异丙基胺盐酸盐在40℃-60℃、pH值9.0-10.5下反应10-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为苄氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，使所述化合物I与异丙基胺和/或其盐酸盐的水溶液在40℃-60℃、pH值9-10.5下反应10小时-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为乙酰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在的条件下，在缓冲溶液中，使所述化合物I与异丙基胺或其盐酸盐水溶液在30℃-60℃、pH值9-10.5下反应10小时-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为乙酰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，使所述化合物I与异丙基胺和/或其盐酸盐的水溶液在30℃-60℃、pH值9.0-10.5条件下反应8小时-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为对甲基苯磺酰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在的条件下，在缓冲溶液中，使所述化合物I与异丙基胺或其盐酸盐水溶液在20℃-60℃、pH值9.0-10.5下反应8小时-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为对甲基苯磺酰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，使所述化合物I与异丙基胺和/或其盐酸盐的水溶液在20℃-60℃、pH值9-10.5下反应8小时-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为笏甲氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在的条件下，在缓冲溶液中，使所述化合物I与异丙基胺或其盐酸盐在20℃-60℃、pH值9-10.5下反应8小时-16小时；得到式II所示化合物。
根据本发明的实施例，所述氨基保护基团为笏甲氧羰基，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液中，使所述化合物I与异丙基胺和/或其盐酸盐的水溶液在30℃-60℃、pH值9-10.5下反应10小时-14小时；得到式II所示化合物。
上述制备化合物II的方法中，可以加入助溶剂也可以不加入助溶剂，不加入助溶剂，有利于成本控制。所述助溶剂可为二甲基亚砜、甲醇、乙醇或其组合。
所得式II所示化合物经过脱保护基反应后，即可得到化合物III，所述脱保护基反应可在酸或碱存在条件下进行。
本发明的制备贝西沙星中间体化合物II的方法，与相关技术相比，在固定化转氨酶的催化下，化合物II的ee值可达99％，产率可达90％以上，反应操作简单，且固定化酶活性受影响程度较低，可以多次套用，有利于成本控制，本发明的方法有望用于大规模生产。
附图说明
图1示实施例12中固定化酶使用时间与化合物(02)的转化率的图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明中，g：克；mL：毫升；mol：摩尔；℃：摄氏度；h：小时；min：分钟。
实施例1制备环氧树脂固定化酶：
反应器中加入7.50gω-转氨酶粉和150mL的0.5mol/L pH＝8.0的磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液，搅拌溶解后加入30.0g环氧树脂(LX-1000EP型号)，室温反应12小时后过滤，用纯化水洗涤2次，得到粗品；
上述粗品加入2.0mol/L pH＝9.5甘氨酸钠溶液150mL，室温搅拌12h后过滤，用纯化水洗涤2次，制得35.03g环氧基树脂固定化酶。
实施例2制备氨基载体树脂固定化酶：
反应器中加入30.0g氨基载体树脂(HAA型号)和150mL的0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液，搅拌下加入30mL 5％的戊二醛水溶液，室温反应2小时后过滤，用纯化水洗涤2次，得到树脂湿品；
上述树脂湿品加入150mL的0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液和7.50gω-转氨酶粉，室温反应12小时后过滤，用纯化水洗涤2次，制得34.26g氨基载体树脂固定化酶。
实施例3制备吸附载体树脂固定化酶：
反应器中加入7.50g转氨酶粉和150mL的0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液，搅拌溶解后加入30.0g吸附载体树脂(EP120型号)，室温反应12小时后过滤，用纯化水洗涤2次，制得36.17g吸附载体树脂固定化酶。
实施例4制备离子交换载体树脂固定化酶：
反应器中加入7.50gω-转氨酶粉和150mL的0.05mol/L的pH＝8.0的磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液，搅拌溶解后加入30.0g离子交换载体树脂(LX-1000Q1A型号)，室温反应12小时后过滤，用纯化水洗涤2次，制得35.88g离子交换载体树脂固定化酶。
实施例5制备化合物(02)：
反应器中加入1000mL 2mol/L的异丙基胺盐酸盐水溶液、6.00g磷酸吡哆醛和300.0g按照上述方法制得的环氧树脂固定化酶(固定化酶制备时，树脂与ω-转氨酶粉的质量比按照4:1计)，搅拌，升温至55℃，加入100.00g化合物(01)，使用异丙基胺控制pH＝9.0～10.0，保温50℃-60℃反应12小时；
反应完毕，降至室温，过滤，加入乙酸乙酯和水萃取和洗涤；有机层减压蒸干，得到化合物(02)：淡黄色油状物95.68g，纯度99.76％，收率95.22％；检测：
ee值：99.17％；
质谱：M+H＝215.1；
核磁氢谱：1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ3.74-3.37(m,2H)，3.29-3.13(m,1H)，3.11-2.97(m,1H)，2.96-2.81(m,1H)，1.89-1.54(m,6H)，1.51-1.43(m,9H)，1.42-1.39(m,2H)。
实施例6制备化合物(02)：
反应器中加入500mL4mol/L的异丙基胺盐酸盐水溶液、500mL 0.1mol/L的磷酸二氢钠-氢氧化钠、6.00g磷酸吡哆醛和参照上述方法制得的300.0g吸附载体树脂固定化酶(在固定化酶制备时，树脂与ω-转氨酶酶粉的质量比按照4:1计)，搅拌升温至55℃，加入100.00g化合物(01)，用异丙基胺盐酸盐水溶液控制pH＝9.0～10.0，保温45℃-55℃反应12小时；
反应完毕，降至室温，过滤，加入乙酸乙酯和水萃取和洗涤。有机层减压蒸干，得到化合物(02)：淡黄色油状物94.70g，纯度99.52％，ee值99.20％，收率94.25％。
实施例7制备化合物(02)
反应器中加入500mL 2mol/L的异丙基胺盐酸盐水溶液、500mL的二甲基亚砜、6.00g磷酸吡哆醛和参照上述方法制得的300.0g氨基载体树脂固定化酶(在固定化酶制备时，树脂与ω-转氨酶酶粉的质量比按照4:1计)，搅拌升温至55℃-60℃，加入100.00g化合物(01)，用异丙基胺盐酸盐水溶液控制pH＝9.0～10.0，保温55℃-60℃反应12小时；
反应完毕，降至室温，过滤，加入乙酸乙酯和水萃取和洗涤。有机层减压蒸干，得到化合物(02)：淡黄色油状物91.52g，纯度99.83％，ee值99.22％，收率91.08％。
实施例8制备化合物(02)
反应器中加入250mL 4mol/L的异丙基胺盐酸盐水溶液、250mL 0.1mol/L的三乙醇胺-盐酸水溶液、500mL二甲基亚砜、6.00g磷酸吡哆醛和参照上述方法制得的300.0g离子交换载体树脂固定化酶(在固定化酶制备时，树脂与ω-转氨酶酶粉的质量比按照3:1计)，搅拌升温至50℃-55℃，加入100.00g化合物(01)，用异丙基胺控制pH＝9.0～10.0，保温50℃-55℃反应12小时；
反应完毕，降至室温，过滤，加入乙酸乙酯和水萃取和洗涤。有机层减压蒸干，得到化合物(02)：淡黄色油状物92.85g，纯度99.71％，ee值99.02％，收率92.40％。
实施例9制备化合物(02)
反应器中加入1000mL 4mol/L的异丙基胺盐酸盐水溶液、250mL 0.5mol/L的三乙醇胺-盐酸水溶液、6.00g磷酸吡哆醛和参照上述方法制得的300.0g环氧树脂固定化酶(在固定化酶制备时，树脂与ω-转氨酶酶粉的质量比按照5:1计)，搅拌升温至45℃-50℃，加入100.00g化合物(01)，用异丙基胺控制pH＝9.0～10.0，保温45℃-50℃反应15小时；
反应完毕，降至室温，过滤，加入乙酸乙酯和水萃取和洗涤。有机层减压蒸干，得到化合物(02)：淡黄色油状物89.93g，纯度99.68％，ee值99.12％，收率89.50％。
实施例10制备化合物(02)
反应器中加入1000mL 4mol/L的异丙基胺盐酸盐水溶液、300mL甲醇、6.00g磷酸吡哆醛和参照上述方法制得的300.0g吸附载体树脂固定化酶(在固定化酶制备时，树脂与ω-转氨酶酶粉的质量比按照5:1计)，搅拌升温至55℃，加入100.00g化合物(01)，用异丙基胺控制pH＝9.0～10.0，保温55℃反应18小时；
反应完毕，降至室温，过滤，滤液减压蒸去甲醇，加入乙酸乙酯和水萃取和洗涤。有机层减压蒸干，得到化合物(02)：淡黄色油状物92.65g，纯度99.18％，ee值99.31％，收率92.20％。
实施例11制备化合物III：
反应器中加入200g乙醇氯化氢溶液，搅拌降温至5℃～10℃，滴加入90.0g化合物(02)，加料完毕，保温反应1小时；反应完毕，过滤，滤饼用200g乙醇溶解，降温至5℃～10℃，加入33.6g氢氧化钠粉末调节pH>10，保温搅拌5h，过滤，滤液蒸干，得到化合物III：无色油状物47.10g，纯度99.57％，ee值99.32％，收率98.21％；检测：
质谱：M+H＝115.2；
核磁氢谱：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ5.19(s,2H)，3.55-3.33(m,2H)，3.22-3.07(m,2H)，3.06-2.90(m,1H)，2.11-1.47(m,6H)。
实施例12固定化酶在连续套用中酶活性情况：
反应器中加入100mL异丙基胺盐酸盐水溶液、0.6g磷酸吡哆醛和按照前述方法得到的参照上述方法制得的30.0g环氧树脂固定化酶(固定化酶制备时，树脂与ω-转氨酶酶粉的质量比按照4:1计)，搅拌，升温至55℃，加入10.0g化合物(01)，每1～2h用6mol/L异丙基胺盐酸盐水溶液控制pH＝10.0，保温55℃反应，反应4h、8h和12h后取样进行气相色谱检测，计算化合物(02)的转化率。反应完毕，降至室温，过滤，固定化酶用30mL纯化水洗涤2次，得到的固定化酶直接套用于下一批反应；固定化酶连续使用15次，根据固定化酶使用时间和化合物(02)转化率数据作图，结果见附图1。
根据数据，固定化酶套用15次，使用了180h，反应过程中每批反应12h后化合物(02)转化率都在90％以上，原料的剩余量可控在5％以内；可见，所述固定化酶可以连续使用15次，且酶活性下降幅度较少，反应12h可以使原料剩余量控制在5％以内；也即本发明所述的固定化酶具有较好的酶活性，可以多次反复套用。
实施例13酶活性检测方法
在三乙醇胺-盐酸盐缓冲盐(0.1mol/L，pH 9.0，5mL)和异丙基胺盐酸盐(4mol/L，pH 9.5，5mL)的体系中加入磷酸吡哆醛20mg，用异丙胺水溶液将体系pH值调至10，加入前述的化合物(01)0.5g，冻干ω-转氨酶粉0.2g或依据本发明方法制备的固定化酶(载体：环氧树脂LX-1000EP型号)1.0g，50℃摇床震荡下反应2小时。然后取0.05mL反应液加入1.45mL乙腈，混均，离心；取上层清液20μL进行气相色谱检测，检测产物峰面积，根据峰面积计算出产物比例，得到酶活收率和酶比活力结果(单位：U/g)。
酶 酶活收率(％) 比活力(U/g)
游离ω-转氨酶粉 50.1％ 975.5
固定化酶 45.6％ 887.85
使用不同载体的固定化酶的酶活收率略有不同，本发明提供的固定化酶的酶活收率约为40％-50％，比活力约为850-1000U/g。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。

Claims (10)

1.一种固定化转氨酶，所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。
2.权利要求1所述的固定化转氨酶，其制备方法包括：ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在15℃-35℃搅拌反应6小时-24小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到固定化转氨酶。
3.一种制备权利要求1所述的固定化转氨酶的方法，包括：ω-转氨酶、酶固定化载体在pH为7.0-9.0的体系中，在15℃-35℃搅拌反应6小时-24小时，然后分离、水洗涤所得固体，得到固定化转氨酶；任选将所得到的固定化转氨酶在pH为8.0-9.5的甘氨酸钠溶液中，在20℃-30℃搅拌8小时-16小时，然后分离，用水洗涤，得到固定化转氨酶产物。
4.一种制备化合物II的方法，包括：化合物I在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，与氨基供体接触反应，得到化合物II，
其中，R为氨基的保护基；所述固定化转氨酶是ω-转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂或者离子交换载体树脂。
5.根据权利要求4所述的方法，在固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在下，在pH值8.5-11条件下，式I所示化合物与氨基供体接触，在5℃-60℃反应一段时间，制得化合物II。
6.根据权利要求4所述的方法，固定化转氨酶和磷酸吡哆醛存在条件下，在缓冲溶液中，在pH值8.5-11条件下，式I所示化合物与氨基供体接触，在5℃-60℃反应8小时-30小时，制得化合物II；其中，缓冲溶液为磷酸二氢钠-氢氧化钠溶液、磷酸二氢钾-氢氧化钾溶液、甘氨酸-氢氧化钠溶液、硼砂-氢氧化钠溶液、柠檬酸-氢氧化钠溶液、三乙醇胺-盐酸溶液、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液、巴比妥钠-盐酸溶液、硼砂-硼酸溶液中的至少一种。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，所述氨基供体为异丙胺、丙氨酸、正丙胺、1-苯乙胺、甘氨酸或它们的盐酸盐中的至少一种。
8.根据权利要求4-6任一所述的方法，任选加入助溶剂，所述助溶剂为二甲亚砜、甲醇、乙醇或其组合。
9.根据权利要求4-6任一所述的方法，化合物I与固定化转氨酶的质量比为1:0.1-1:10。
10.根据权利要求4-9任一所述的方法，其中，R为叔丁氧羰基、苄基、苄氧羰基、乙酰基、对甲基苯磺酰基、笏甲氧羰基中的任意一种。
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