CN104805069B - 一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种固定化转氨酶，该转氨酶是重组转氨酶固定于海藻酸钠上得到的。本发明的固定化转氨酶结合牢固、酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。

Description

一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化转氨酶，该固定化转氨酶的制备方法，以及该固定化转氨酶作为催化剂在不对称合成西他列汀中间体中的应用。
背景技术
酶是一类由生物体产生的具有催化功能的生物大分子物质，作为一种生物催化剂，酶在常温常压的温和条件下能催化各种有机化学反应。酶催化具有高效性，比一般催化剂的效率高出107～1013倍；酶催化具有很高的专一性，可以减少或避免副反应，得到很高纯度的产物；酶催化反应还具有很高的立体选择性和区域选择性，无需保护与脱保护。酶的这些优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。但是，由于酶绝大多数属于蛋白质，其高级结构对环境十分敏感，各种因素如物理因素(温度、压力、电磁场等)、化学因素(氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH等)和生物因素(酶修饰和酶降解等)均有可能使其丧失生物活性。即使在最适条件下，酶也会逐渐失活，随着反应时间的延长，反应速度会逐渐下降；此外，反应后酶不能回收，只能采用分批法进行生产，这对于现代生物催化工业来说，成本较高。
为了解决以上问题，人们设计了一种固定化酶，就是将酶束缚于某种特殊的介质中，使它与反应体系分开，但仍能与底物进行分子交换。这种固定化酶与一般的固体化学催化剂一样，既具有催化特性，又具有能回收、反复使用等优点，生产工艺也可以实现连续化、自动化。
固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法与共价结合法。其中，吸附法又可以分为物理吸附法与离子吸附法两种，该方法条件温和，酶活损失少，易于再生，但是固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺、尼龙膜或硝酸纤维素微囊包埋，该方法一般较为温和，酶活性损失少，但是传质阻力很大，不利于较大分子或很低溶解度底物的催化。交联法中用的最多的是戊二醛交联，一般操作较为简便，但是反应剧烈，酶活损失大；而且机械性能差，颗粒度细，难以分离。共价结合法常用芳胺载体的重氮化反应、羟基载体的溴化氰-亚胺碳酸盐反应、羧基载体的羰二亚胺反应、巯基载体的二硫键交换反应等，由于其结合牢固、稳定性好等特点，是目前研究与应用最为广泛的一类方法。但是该方法条件苛刻，反应剧烈，酶活损失大(一般残余酶活在30％左右)。
西他列汀磷酸盐由默克公司开发，于2006年8月及10月分别被墨西哥卫生部及美国FDA批准为治疗II型糖尿病的药物，商品名为捷诺维(Januvia)，目前已经在全世界60多个国家批准使用，2012年销售额已达40.86亿美元，同比增长23％。因此，西他列汀磷酸盐是属于国际最新且附加值极高的“重磅炸弹”，其合成的关键是手性胺中心的构建。
美国专利US8293507公开了Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶进行改造得到的生物催化剂来构建手性胺中心，转氨化产物ee值达到99％，底物投料100g/L。但是由于底物水溶性差，需要添加高达50％的DMSO助溶，使得产品的后处理损失较大，DMSO的溶剂残余较高，回收困难，成本较高。
而后默克公司在中国专利申请CN103608355A中公开了利用环氧树脂对该酶进行固定化，使得反应得以在水饱和的乙酸异丙酯中进行反应，但是并未公布该酶进行固定化的酶活回收率。
中国专利申请CN103014081A公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯转化为R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，但是并没有公开具体转氨酶的序列以及克隆方法。
中国专利申请号201410169882.4公开了本公司运用来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的不对称转氨化反应，由于该底物水溶性较高，因此具有较高的时空产率，具有一定的工业化应用价值。但是，游离酶反应使得分离困难，不能重复利用。
发明内容
本发明针对来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶在酶催化过程中分离困难，以及酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，将海藻酸钠与带组氨酸标签的分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1来源的转氨酶进行固定化，并用氯化钙溶液进行处理得到固定化转氨酶。该固定化方法反应温和，酶活基本无损失。运用该固定化酶对底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯进行不对称转氨，可以重复利用20批次，且分离简单。
本发明的第一方面提供了一种固定化转氨酶。
该固定化转氨酶是将将重组转氨酶固定于海藻酸钠上得到的。
在一个特定的实施方案中，所述重组转氨酶是中国专利申请CN201410262154.8中记载的带有组氨酸标签的来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶；其中，所述来源于分支杆菌PYR-1的转氨酶由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码。
本发明的第二方面提供了上述固定化转氨酶的制备方法。
将表达重组转氨酶的工程菌细胞与5倍质量的水高压均质，破胞得到粗酶液；将粗酶液与海藻酸钠混合均匀，加入1％(v/v)的戊二醛，摇床震荡30分钟，然后静置3小时，得到混合溶液；将该混合溶液滴入2％(w/v)的氯化钙溶液中形成凝胶小球，过滤洗涤得到固定化转氨酶。
优选地，在粗酶液中加入1.5％(w/v)的海藻酸钠；所述洗涤步骤为用0.9％(w/v)的氯化钠溶液洗涤2遍。
本发明所述的固定化转氨酶的制备方法的原理如图1所示。
本发明的第三方面是提供了本发明的固定化转氨酶在催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成光学活性手性胺中的应用。
上述应用中，所述的不对称转氨反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：
所述的转氨酶优选本发明的固定化转氨酶。
所述的前手性羰基化合物较佳地为1-(2,4,5-三氟苯基)-4-取代-2,4-丁二酮类化合物，即是式I所示的化合物：
其中，R选自
(1)烷氧基；
(2)芳氧基；或
(3)
其中，
X选自(1)N，和(2)CR2；
R1和R2独立地选自：
(1)H；
(2)CN；
(3)直链或支链且未被取代或被1～5个卤素原子取代的C1-C10烷基。
较佳地，R为碳链长度为1～8的烷氧基、苄基或
更佳地，R为-O-CH3、-O-CH2CH3或
上述应用中，所述的不对称转氨反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述的应用包括下述步骤：在pH7.0～10.0的磷酸-磷酸钠缓冲溶液中，在5％(v/v)～50％(v/v)乙醇、20～100g/L的异丙胺和0.1～1.0mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)的存在下，在50～300g/L本发明所述的固定化转氨酶的催化下，10～60g/L的上述前手性羰基化合物进行不对称转氨反应，形成光学活性手性胺。反应完成后通过过滤回收固定化转氨酶，水洗后投入下一批反应使用。重复利用20次未见转化率的显著下降。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
针对来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1来源的转氨酶在酶催化过程中分离困难，以及已报导的酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，提供了一种结合牢固、酶活损失少的固定化酶，并用于酶催化合成R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酮衍生物。相对于其它方法，本发明制备所得的固定化酶结合牢固、酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1本发明所述固定化转氨酶的制备方法的原理图。
图2分枝杆菌PYR-1转氨酶重组表达转化体的菌落PCR图。M为分子量标准，A为E.coli DH5α/pET21a-MvAT，B为E.coli BL21(DE3)/pET28a-MvAT。
图3重组表达的分枝杆菌PYR-1转氨酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
M为分子量标准，A为诱导前，B为诱导后。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下列实施例中的材料来源为：
pET21a-MvAT由本公司构建(构建方法见中国专利申请号201410169882.4)。
海藻酸钠购自上海生工。
实施例1重组转氨酶表达转化体的制备
根据中国专利申请号201410169882.4构建包含SEQ ID No.1的重组表达载体pET21a-MvAT，在37℃用限制性内切酶Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的质粒pET28a，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-MvAT。将重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，转化条件45℃，热击90秒，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(见图2A)。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-MvAT，菌落PCR验证阳性克隆(见图2B)。
实施例2重组转氨酶的表达
将实施例3所得的重组E.coli BL21(DE3)接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，35℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。
将所得的静息细胞1g用5mL水重悬，高压均质，破胞得到粗酶液。用Bradford法测粗酶液蛋白质含量为400mg/g。粗酶液与沉淀一起经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(见图3)，重组蛋白质以可溶的形式存在。将粗酶液用冷冻干燥机冻干，即为冻干粗酶粉。
实施例3固定化酶的制备
将1.5％(w/v)海藻酸钠与实施例2所得粗酶液混合，在37℃水浴中融化；充分混匀后，加入1％(v/v)戊二醛，放入摇床摇30min，并于4℃冰箱中静置3h得到混合液。然后将混合液逐滴注入2％(w/v)的氯化钙溶液中，形成凝胶小球；过滤，用0.9％(w/v)氯化钠溶液洗涤两遍，得到固定化酶。
实施例4游离转氨酶与固定化酶酶活力的测定
在10ml乙醇-磷酸钠-异丙胺缓冲液(乙醇浓度为50％(v/v)，磷酸钠和异丙胺均为100mmol/L，pH8.5)中加入0.1g实施例2所得冻干粗酶粉，或1g实施例3制备的固定化酶，加入终浓度为5g/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，50℃磁力搅拌下反应20min。取0.05mL反应液加入0.450mL乙腈，混匀，离心，取20μL用HPLC检测产物峰面积，根据峰面积计算出产物浓度，乘以10即为酶活力，如表1所示。
表1游离酶与固定化酶的酶活力
编号 酶 酶活收率(％) 比酶活(U/g)
1 游离酶 100 434
2 固定化酶 87.4 757
HPLC测定方法为：反应液用乙腈稀释100倍，离心后取20μL在Agilent1200HPLC上分析转化率，分析柱为Agilent Eclipse XAD-C18反相硅胶柱，流动相为水:乙腈＝40:60，另加10mM甲酸铵，流速为1mL每分钟，检测波长为210nm和260nm，转氨产物的保留时间为4.6min，底物的保留时间为7.4min。
实施例5固定化酶不对称转氨
在100ml乙醇-磷酸钠-异丙胺缓冲液(乙醇浓度为50％(v/v)，磷酸钠和异丙胺均为100mmol/L，pH8.5)中加入20g根据实施例3制备的固定化转氨酶，加入终浓度为200mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(4.9g)以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，在50℃磁力搅拌下反应。反应过程中用HPLC测定转化率至99％或反应48小时后停止反应。反应结束后用纱布进行过滤，滤渣用10mL80％(v/v)的乙醇洗涤三次，过滤，滤渣回收即得固定化酶，测定残余活性并用于下一批次反应。滤液合并，用50mL乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后按实施例4测定底物转化率(如表2所示)。
表2不同批次固定化酶催化不对称转氨转化率与残余酶活
批次 反应时间(h) 转化率 残余酶活
1 24 >99％ 98％
5 24 >99％ 97％
10 24 >98％ 96％
15 24 >98％ 95％
20 24 >97％ 92％
实施例6～9固定化酶不对称转氨
基本按照实施例5所述的方法，测试不同批次的固定化酶催化各种底物不对称转氨转化率与残余酶活(如表3所示)。
表3不同批次固定化酶催化多种底物不对称转氨转化率与残余酶活

Claims (9)

1.一种固定化转氨酶，其特征是将重组转氨酶固定于海藻酸钠上得到的；其中所述重组转氨酶是带有组氨酸标签的来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶，所述来源于分支杆菌PYR-1的转氨酶由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码。
2.权利要求1所述的固定化转氨酶的制备方法，其特征在于：将表达所述重组转氨酶的工程菌细胞与5倍质量的水高压均质，破胞得到粗酶液；将粗酶液与海藻酸钠混合均匀，加入1％(v/v)的戊二醛，摇床震荡30分钟，然后静置3小时，得到混合溶液；将该混合溶液滴入2％(w/v)的氯化钙溶液中形成凝胶小球，过滤洗涤得到固定化转氨酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，在粗酶液中加入1.5％(w/v)的海藻酸钠。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，所述洗涤步骤为用0.9％(w/v)的氯化钠溶液洗涤2遍。
5.权利要求1所述的固定化转氨酶在催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成光学活性手性胺中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述的前手性羰基化合物选自以下化合物：
其中，R选自
(1)烷氧基；
(2)芳氧基；或
(3)其中，
X选自(1)N，和(2)CR2；
R1和R2独立地选自：
(1)H；
(2)CN；
(3)直链或支链且未被取代或被1～5个卤素原子取代的C1-C10烷基。
7.根据权利要求6所述的应用，其中R为碳链长度为1～8的烷氧基、苄基或
8.根据权利要求7所述的应用，其中R为-O-CH3、-O-CH2CH3或
9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其包括在pH 7.0～10.0的磷酸-磷酸钠缓冲溶液中，在5％(v/v)～50％(v/v)乙醇、20～100g/L的异丙胺和0.1～1.0mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)的存在下，50～300g/L所述固定化转氨酶催化10～60g/L的所述前手性羰基化合物进行不对称转氨反应，形成光学活性手性胺。
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Applicant after: ABIOCHEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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Applicant before: NANJING ABIOCHEM BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

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Patentee after: Ecolab Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

Address before: 200120 China (Shanghai) free trade zone, Pudong South Road, No. 2, building C110, room

Patentee before: ABIOCHEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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Patentee after: Yikelai Biotechnology (Group) Co.,Ltd.

Address before: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200241

Patentee before: Ecolab Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

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