CN105219745B - 一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用 - Google Patents

一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种固定化转氨酶，该转氨酶是带有组氨酸标签的来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR‑1的转氨酶固定于酶固定化载体上得到的，所述酶固定化载体是环氧树脂依次经亚胺基二乙酸(IDA)和氯化钴进行衍生化，或者离子螯合树脂经氯化钴进行衍生化得到的。本发明的固定化转氨酶结合牢固、酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，具有很好的工业应用前景。

Description

一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种固定化转氨酶，该固定化转氨酶的制备方法，以及该固定化转氨酶作为催化剂在不对称合成西他列汀中间体中的应用。
背景技术
酶是一类由生物体产生的具有催化功能的生物大分子物质，作为一种生物催化剂，酶在常温常压的温和条件下能催化各种有机化学反应。酶催化具有高效性，比一般催化剂的效率高出107～1013倍；酶催化具有很高的专一性，可以减少或避免副反应，得到很高纯度的产物；酶催化反应还具有很高的立体选择性和区域选择性，无需保护与脱保护。酶的这些优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。但是，由于酶绝大多数属于蛋白质，其高级结构对环境十分敏感，各种因素如物理因素(温度、压力、电磁场等)、化学因素(氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH等)和生物因素(酶修饰和酶降解等)均有可能使其丧失生物活性。即使在最适条件下，酶也会逐渐失活，随着反应时间的延长，反应速度会逐渐下降；此外，反应后酶不能回收，只能采用分批法进行生产，这对于现代生物催化工业来说，成本较高。
为了解决以上问题，人们设计了一种固定化酶，就是将酶束缚于某种特殊的介质中，使它与反应体系分开，但仍能与底物进行分子交换。这种固定化酶与一般的固体化学催化剂一样，既具有催化特性，又具有能回收、反复使用等优点，生产工艺也可以实现连续化、自动化。
固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交联法与共价结合法。其中，吸附法又可以分为物理吸附法与离子吸附法两种，该方法条件温和，酶活损失少，易于再生，但是固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺、尼龙膜或硝酸纤维素微囊包埋，该方法一般较为温和，酶活性损失少，但是传质阻力很大，不利于较大分子或很低溶解度底物的催化。交联法中用的最多的是戊二醛交联，一般操作较为简便，但是反应剧烈，酶活损失大；而且机械性能差，颗粒度细，难以分离。共价结合法常用芳胺载体的重氮化反应、羟基载体的溴化氰-亚胺碳酸盐反应、羧基载体的羰二亚胺反应、巯基载体的二硫键交换反应等，由于其结合牢固、稳定性好等特点，是目前研究与应用最为广泛的一类方法。但是该方法条件苛刻，反应剧烈，酶活损失大(一般残余酶活在30％左右)。
西他列汀磷酸盐由默克公司开发，于2006年8月及10月分别被墨西哥卫生部及美国FDA批准为治疗II型糖尿病的药物，商品名为捷诺维(Januvia)，目前已经在全世界60多个国家批准使用，2012年销售额已达40.86亿美元，同比增长23％。因此，西他列汀磷酸盐是属于国际最新且附加值极高的“重磅炸弹”，其合成的关键是手性胺中心的构建。
美国专利US8293507公开了Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶进行改造得到的生物催化剂来构建手性胺中心，转氨化产物ee值达到99％，底物投料100g/L。但是由于底物水溶性差，需要添加高达50％的DMSO助溶，使得产品的后处理损失较大，DMSO的溶剂残余较高，回收困难，成本较高。
而后默克公司在中国专利申请CN103608355A中公开了利用环氧树脂对该酶进行固定化，使得反应得以在水饱和的乙酸异丙酯中进行反应，但是并未公布该酶进行固定化的酶活回收率。
中国专利申请CN103014081A公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯转化为R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，但是并没有公开具体转氨酶的序列以及克隆方法。
中国专利申请号201410169882.4公开了本公司运用来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶对3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的不对称转氨化反应，由于该底物水溶性较高，因此具有较高的时空产率，具有一定的工业化应用价值。但是，游离酶反应使得分离困难，不能重复利用。
发明内容
本发明针对来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1的转氨酶在酶催化过程中分离困难，以及酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，将商品化的环氧树脂依次用亚胺基二乙酸(IDA)、氯化钴进行衍生化，得到酶固定化载体，而后用带组氨酸标签的分支杆菌(Mycobacteriumvanbaalenii)PYR-1来源的转氨酶进行固定化，并用H2O2进行处理以提高酶的结合能力。该固定化方法反应温和，酶活基本无损失。运用该固定化酶对底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯进行不对称转氨，可以重复利用20批次，且分离简单。
本发明的内容之一是提供了一种带组氨酸标签的转氨酶。其可以通过本领域常规方法将包括SEQ No.1的转氨酶基因的质粒(构建方法见中国专利申请号201410169882.4)，用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，形成互补的粘性末端，与同样双酶切的pET28a载体经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的转氨酶基因的重组表达质粒pET28a-MvAT表达质粒。将该表达质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，即可获得本发明的基因工程菌株，即E.coliBL21(DE3)/pET28a-MvAT。将该重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7(更佳地为0.6)时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L(更佳地为0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～40℃(更佳地为25℃)，即可高效表达本发明所述的带组氨酸标签的重组转氨酶。
本发明的内容之二是提供了一种酶固定化载体。
将氨基树脂加到乙二醇二缩水甘油醚中形成环氧树脂，而后置于20mM亚胺基二乙酸(IDA)，pH7.0-10.0(更佳地为pH9.0)的10mM三乙醇胺溶液中，20-80℃(更佳地为65℃)反应3小时后，先后用水、2mM CoCl2、水进行洗涤，或直接用离子螯合树脂先后用水、2mMCoCl2、水进行洗涤，即得到酶固定化载体。
在一个特定的实施方案中，本发明所述的氨基树脂是上海华震公司的氨基树脂，特别是型号为D301的氨基树脂；在另一个特定的实施方案中，本发明所述的离子螯合树脂是上海华震公司的离子螯合树脂，特别是型号为HZ401的离子螯合树脂。
本发明的内容之三是提供了一种固定化转氨酶。
该固定化转氨酶是将本发明的重组转氨酶固定于本发明的酶固定化载体上得到的。
将上述所得的带组氨酸标签的重组转氨酶的pH为8.5的20mM的三乙醇胺溶液，加入5-20倍重量(更佳地为10倍重量)的固定化载体，25℃搅拌1小时，过滤洗涤后加到10mM的双氧水溶液中，25℃搅拌1小时后过滤洗涤即得固定化酶。所得的固定化酶酶活力达到1543U/g，回收率为50％。
本发明的内容之四是提供了本发明的转氨酶或固定化转氨酶在催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成光学活性手性胺中的应用。
上述应用中，所述的不对称转氨反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：
所述的转氨酶优选本发明的固定化转氨酶。
所述的前手性羰基化合物较佳地为1-(2,4,5-三氟苯基)-4-取代-2，4-丁二酮类化合物，即是式I所示的化合物：
其中，R选自
(4)烷氧基；
(5)芳氧基；或
(6)
其中，
X选自(1)N，和(2)CR2；
R1和R2独立地选自：
(1)H,
(2)CN,
(3)直链或支链且未被取代或被1～5个卤素原子取代的C1-10烷基。
较佳地，R为碳链长度为1～8的烷氧基、苄基、或
更佳地，R为-CH3、-CH2CH3、或
上述应用中，所述的不对称转氨反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述的应用包括下述步骤：在pH7.0～10.0的磷酸-磷酸钠缓冲溶液中，在5-50％乙醇、20～100g/L的异丙胺和0.1～1.0mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)的存在下，在50～300g/L的本发明所述的重组转氨酶或固定化转氨酶的催化下，10～60g/L的上述前手性羰基化合物进行不对称转氨反应，形成光学活性手性胺。反应完成后通过过滤回收固定化转氨酶，水洗后投入下一批反应使用。重复利用20次未见转化率的下降。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
针对来源于分支杆菌(Mycobacterium vanbaalenii)PYR-1来源的转氨酶在酶催化过程中分离困难，以及已报导的酶固定化过程中存在的酶活性损失大或传质困难等问题，提供了一种结合牢固、酶活损失少的固定化酶，并用于酶催化合成R-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酮衍生物。相对于其它方法，本发明制备所得的固定化酶结合牢固、酶活损失少、分离简单、重复利用次数多，不对称转化过程成本低廉，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1分枝杆菌PYR-1转氨酶重组表达转化体的菌落PCR图。M为分子量标准，A为E.coli DH5α/pET21a–MvAT，B为E.coli BL21(DE3)/pET28a–MvAT。
图2重组表达的分枝杆菌PYR-1转氨酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
M为分子量标准，A为诱导前，B为诱导后。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下列实施例中的材料来源为：
pET21a–MvAT由本公司构建(构建方法见中国专利申请号201410169882.4)。
氨基树脂D301以及离子螯合树脂HZD401均购自上海华震科技有限公司。
表达质粒pET28a、E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCRMasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
实施例1固定化载体A的制备
在搅拌下将100克上海华震公司型号为D301的氨基树脂，缓慢加到200mL的5％(v/v)的乙二醇二甘油醚的甲苯溶液中，60℃搅拌反应1小时，先后用甲苯与水洗涤，而后置于350mL的100mM亚氨基二乙酸(IDA)、10mM三乙醇胺，pH9.0的水溶液中，60℃反应2小时，过滤用水洗涤，再用200mL的10mM氯化钴溶液重悬，室温搅拌30min，过滤后用水洗涤，即得固定化载体A。
实施例2固定化载体B的制备
在搅拌下将100克上海华震公司型号为HZD401的离子螯合树脂，加到200mL的10mM氯化钴溶液重悬，室温搅拌30min，过滤后用水洗涤，即得固定化载体B。
实施例3重组转氨酶表达转化体的制备
根据中国专利申请号201410169882.4构建包含SEQ No.1的重组表达载体pET21a-MvAT，在37℃用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后的质粒pET28a，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-MvAT。将重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，转化条件45℃，热击90秒，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(见图1A)。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体E.coliBL21(DE3)/pET28a–MvAT，菌落PCR验证阳性克隆(见图1B)。
实施例4重组转氨酶的表达
将实施例3所得的重组E.coli BL21(DE3)，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，35℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH8.5的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组转氨酶的粗酶液。用Bradford法测定蛋白浓度。粗酶液与沉淀一起经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(见图2)，重组蛋白以可溶的形式存在。将粗酶液用冷冻干燥机冻干，即为冻干粗酶粉。
实施例5固定化酶的制备
将10g实施例4中所得的重组转氨酶的冻干粗酶粉用200mL的pH8.5、20mM的三乙醇胺溶液重悬，加入100g实施例1所得的固定化载体A，或实施例2所得的固定化载体B，室温搅拌1小时，过滤，用水洗涤，重悬于10mM的H2O2溶液中，室温搅拌1小时，过滤，用水洗涤，即得固定化酶。
实施例6游离转氨酶与固定化酶酶活力的测定
在10ml乙醇-磷酸钠-异丙胺缓冲液(乙醇浓度为50％，磷酸钠和异丙胺均为100mmol/L，pH8.5)中加入0.1g实施例4制备的重组转氨酶的冻干粗酶粉，或1g实施例5制备的转氨酶固定化酶，加入终浓度为5g/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，50℃磁力搅拌下反应20min。取0.05mL反应液加入0.450mL乙腈，混匀，离心，取20微升用HPLC检测产物峰面积，根据峰面积计算出产物浓度，乘以10即为酶活力，如表1所示。
表1游离酶与固定化酶的酶活力
编号 酶 酶活收率(％) 比酶活(U/g)
1 游离酶 100 3086
2 固定化载体A制得的固定化酶 50 1543
3 固定化载体B制得的固定化酶 27 833
HPLC测定方法为：反应液用乙腈稀释100倍，离心后取20μL在Agilent1200HPLC上分析转化率，分析柱为Agilent Eclipse XAD-C18反相硅胶柱，流动相为水:乙腈＝40:60，另加10mM甲酸铵，流速为1mL每分钟，检测波长为210nm和260nm，转氨产物的保留时间为4.6min，底物的保留时间为7.4min。
实施例7固定化酶不对称转氨
在100ml乙醇-磷酸钠-异丙胺缓冲液(乙醇浓度为50％，磷酸钠和异丙胺均为100mmol/L，pH8.5)中加入20g根据实施例5制备的固定化转氨酶(载体为由实施例1所制备的固定化载体A)，加入终浓度为200mmol/L的3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(4.9g)以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛，在50℃磁力搅拌下反应。反应过程中用HPLC测定转化率至99％或反应48小时后停止反应。反应结束后用纱布进行过滤，滤渣用10mL80％的乙醇洗涤三次，过滤，滤渣回收即得固定化酶，测定残余活性并用于下一批次反应。滤液合并，用50mL乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后按实施例5测定底物转化率(如表2所示)。
表2不同批次固定化酶催化不对称转氨转化率与残余酶活
批次 反应时间(h) 转化率 残余酶活
1 19 >99％ 99％
2 19 >99％ 99％
3 19 >99％ 99％
4 19 >99％ 99％
5 19 >99％ 98％
6 19 >99％ 97％
7 19 >99％ 98％
8 20 >99％ 97％
9 20 >99％ 97％
10 20 >99％ 96％
11 20 >99％ 95％
12 20 >99％ 96％
13 20 >99％ 95％
14 21 >99％ 95％
15 21 >99％ 94％
16 21 >99％ 94％
17 22 >99％ 93％
18 22 >99％ 92％
19 24 >99％ 91％
20 25 99％ 89％
21 28 97％ 87％
实施例8～10固定化酶不对称转氨
基本按照实施例7所述的方法，测试不同批次的固定化酶催化各种底物不对称转氨转化率与残余酶活(如表3所示)。
表3不同批次固定化酶催化多种底物不对称转氨转化率与残余酶活

Claims (14)

1.一种重组转氨酶，其是带有组氨酸标签的来源于分支杆菌(Mycobacteriumvanbaalenii)PYR-1的转氨酶，其中，所述来源于分支杆菌PYR-1的转氨酶由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码。
2.一种制备权利要求1所述的重组转氨酶的方法，包括如下步骤：
(1)将包括SEQ No.1所示的转氨酶基因的质粒和pET28a载体用同样的限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收双酶切片段，经T4 DNA连接酶连接，形成重组表达质粒pET28a-MvAT；
(2)将步骤(1)得到的重组表达质粒pET28a-MvAT转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，即可获得基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-MvAT；
(3)将步骤(2)得到的基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-MvAT接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度10～40℃，即可表达所述的带组氨酸标签的重组转氨酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(3)中培养液的光密度OD600达到0.6时加入IPTG进行诱导。
4.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(3)中加入的IPTG终浓度为0.2mmol/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(3)中诱导温度为25℃。
6.一种固定化转氨酶，其是权利要求1所述的重组转氨酶固定于一种酶固定化载体上得到的。
7.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于所述的酶固定化载体是环氧树脂依次经亚氨基二乙酸(IDA)和氯化钴进行衍生化得到的。
8.根据权利要求7所述的固定化转氨酶，其特征在于所述环氧树脂是将氨基树脂加到乙二醇二缩水甘油醚中制备得到的。
9.根据权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于所述的酶固定化载体是离子螯合树脂经氯化钴进行衍生化得到的。
10.一种制备权利要求6所述的固定化转氨酶的方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的重组转氨酶的pH为8.5的20mM的三乙醇胺溶液，加入5-20倍重量的权利要求6-9任一项中定义的酶固定化载体，25℃搅拌1小时；
(2)过滤洗涤步骤(1)反应后的固定化载体，加到10mM的双氧水溶液中，25℃搅拌1小时；
(3)过滤洗涤步骤(2)反应后的固定化载体，即为固定化转氨酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(1)中加入10倍重量的酶固定化载体。
12.权利要求1所述的重组转氨酶或权利要求6-9任一项所述固定化转氨酶在催化前手性羰基化合物进行不对称转氨反应形成光学活性手性胺中的应用，其特征在于所述的前手性羰基化合物选自以下化合物：
其中，R选自为碳链长度为1～8的烷氧基；苄氧基；或
13.根据权利要求12所述的应用，其中R为-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCH2C6H5或
14.根据权利要求12-13任一项所述的应用，其包括在pH 7.0～10.0的磷酸-磷酸钠缓冲溶液中，在5～50％乙醇、20～100g/L的异丙胺和0.1～1.0mmol/L磷酸吡哆醛(PLP)的存在下，50～300g/L所述重组转氨酶或固定化转氨酶催化10～60g/L的所述前手性羰基化合物进行不对称转氨反应，形成光学活性手性胺。
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