CN102286563B - 一种采用固定化酶制备l-鸟氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

一种采用固定化酶制备L-鸟氨酸的方法。采用构建的精氨酸酶基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-Arg，将其诱导表达，破碎细胞，收集上清液，对精氨酸酶的最适反应条件和固定化条件进行了研究。将自制的纤维素微球载体加入到细胞裂解液中，通过CBD的特异性吸附，实现精氨酸酶的固定化，采用交联剂交联之后，优化催化反应条件，最佳的催化反应条件为，pH8；反应时间2h；底物L-精氨酸浓度，40g/L；固定化酶浓度，2mL/L；Mn²⁺浓度，1mM。在最适反应条件下，重复使用10次，底物L-精氨酸的转化率均达到90%以上。

Description

一种采用固定化酶制备L-鸟氨酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过固定化酶法制备L-鸟氨酸及D-精氨酸的方法。

背景技术

L-鸟氨酸学名为α，δ-二氨基戊酸，其不参与人体内蛋白质合成，但具备极其重要的生理功能。L-鸟氨酸存在于生物体多种组织和细胞中，在生物体代谢中起到重要作用，是尿素生成的中间产物，参与产尿素的鸟氨酸循环，也是精氨酸、瓜氨酸等多种氨基酸代谢的前体物质，具有解毒作用，对人体肝脏细胞具有重大意义。

L-鸟氨酸的制备方法包括化学合成法、直接发酵法和水解精氨酸法等几种方法。随着鸟氨酸在食品工业和医药工业上的应用日益广泛，对生产鸟氨酸方法的研究就具有重大的理论意义和经济意义。

水解精氨酸法包括碱水解法和酶水解法，其中，酶水解法具有很强的专一性，其反应过程简单，副产物少，反应条件温和，并且避免使用氰化氢等有毒化学品，底物转化率高，生成的L-鸟氨酸纯度高，利于后续分离，因此利用精氨酸作为底物，在精氨酸酶的催化下生成L-鸟氨酸的酶水解方法受到广泛的重视，是目前国内厂家生产L-鸟氨酸的常用方法。

Makryaleas等人研究了精氨酸酶水解精氨酸制备L-鸟氨酸的方法，在pH 8.0～10.0时转化率可高达99％。2005年，焦庆才等对L-精氨酸酶固定化生产L-鸟氨酸进行了研究，L-精氨酸的转化率达到95％，并且采用该种固定化酶法相对于传统酶法水解，在产物与催化剂的分离和工业化生产的连续控制等方面具有明显的优势。张鹏等利用粪肠球菌产生的精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸，产量可高达112g/L，转化率高达99.5％。

现有的生物酶法转化尽管可达到一定高的转化率，但采用可溶性酶催发反应，产物回收难度大、成本较高；而采用现有固定化方法，大多参入大量的化学试剂，对酶活力影响较大，且污染相对严重，本研究开发的固定化方法微生物偶联方式，可避免酶活力损失严重、成本高、污染重等缺点。

D-精氨酸是一种非蛋白质氨基酸，天然原料人工合成，研究表明D-精氨酸具有抗高血压的功效；D-精氨酸的重要生理功能还表现在可抑制癌症扩散，治疗生长激素过多释放造成的紊乱等方面。

发明内容

本发明的目的是为L-鸟氨酸及D-精氨酸的绿色生产提供一种固定化酶法合成方法。

本实验室构建了融合表达精氨酸酶的重组表达载体pET21a(+)-Arg1和pET35b-Arg1并转化至E.coli BL21(DE3)，进行高效表达，获得高活力的精氨酸酶和纤维素结合域-精氨酸酶(CBD-ARG)。通过CBD特异性识别纤维素的特性，对精氨酸酶进行了固定化，并优化交联剂及其浓度，随后对固定化的精氨酸酶反应条件进行了初步研究，为固定化酶法制备L-精氨酸和D-精氨酸的生产工艺奠定了基础。

本发明涉及基因工程菌大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-Arg1和BL21(DE3)-pET21(+)-Arg1，以底物L-精氨酸出发，经表达的精氨酸酶或者固定化的基因工程菌表达的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制备L-鸟氨酸；或者以底物DL-精氨酸出发，经固定化的基因工程菌表达的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制备L-鸟氨酸，同时保留D-精氨酸。

本发明首先自行构建了高效融合表达纤维素结合域-精氨酸酶的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-Arg1，即以小鼠肝脏mRNA反转录制备的cDNA为模板进行PCR扩增精氨酸酶基因，构建pET21(+)-Arg1表达载体，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，随后将确认的Arg1基因转入pET35b，构建BL21(DE3)-pET35b-Arg1，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，其中大肠杆菌BL21(DE3)以及对应的表达载体pET21a(+)、pET35b均为文献报道和商业化可利用的表达体系。

本发明提供的固定化酶法制备L-鸟氨酸的方法，具体包括：

以固定化的重组表达的精氨酸酶为酶源，酶促反应过程中，以L-精氨酸为底物，在25至50℃下，pH值为6至11，经酶法转化反应1至5h，在0.1至10mM Mn2+存在的条件下，在每升催化反应液中底物L-精氨酸加入量为10至50g，固定化酶0.5mL至5mL，产生L-鸟氨酸，进一步分离获得L-鸟氨酸；分离纯化方法是，过滤去除固定化酶后重结晶，沉淀获得L-鸟氨酸。经酶法转化反应0.5h至5h，

或在相同条件下，以DL-精氨酸为底物，拆分80g/L的DL-精氨酸制备D-精氨酸和L-鸟氨酸。纯化方法是大孔吸附树脂001×7层析方法。

本发明优选转化温度为37℃；优选转化pH值为8.0；优选转化时间为2h；底物L-精氨酸的用量优选为40g/L；Mn²⁺浓度为1mM；固定化酶优选用量为2mL/L。

固定化酶源可重复使用15次以上，且在最佳的反应条件和体系下，前10次使用，其催化底物转化率均达到90％以上。

所述用于固定化的重组表达的精氨酸酶来自以上构建的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-Arg1的细胞裂解液，重组菌株中的表达载体为pET35b-Arg1重组表达载体，重组菌体细胞中表达有高活性的融合蛋白纤维素结合域-精氨酸酶，该重组菌株具备表达精氨酸酶、并能进行L-精氨酸转化为L-鸟氨酸的反应，及以DL-精氨酸为底物拆分制备D-精氨酸和L-鸟氨酸。

所述的固定化的重组表达的精氨酸酶是以上述的重组菌株的细胞裂解液为起始酶源，经过纤维素磁球吸附，实现吸附和固定化。

固定化酶载体为纤维素载体，交联剂为戊二醛或DMP。纤维素载体的材料为纤维素，粒径大小为5～100微米，蛋白吸附能力为20mg/mL，优选的交联剂为DMP，最佳浓度为0.1％。

纤维素载体包含自制的微球载体或非可溶性纤维素材料。

在本发明实施例中，采用柱前衍生化HPLC法来测定DL-精氨酸及L-鸟氨酸，衍生化试剂为Marfey试剂，即1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(FDAA)。柱前衍生化方法如下：以100μL 10mmol/L Na₂C0₃溶液(pH 9)溶解氨基酸，使其终浓度为10～40mmol/L，随后加入到1％的FDAA 200μL丙酮溶液中，40℃孵育1h后，加入2N HCl 20μL终止反应，20μL进样分析。色谱柱：C₁₈色谱柱(Phenomenex Luna 5μ，100A，250×4.6mm)；进样体积：20μL。流动相：水(含0.1％TFA)：乙腈(含0.1％TFA)＝45：55为流动相；室温；流速为1mL/min；检测波长340nm。

本发明的有益效果：

本发明以L-精氨酸或DL-精氨酸为底物，利用固定化的高效融合表达的CBD-ARG1为酶源，酶法制备L-鸟氨酸或D-精氨酸。由于采用固定化酶直接进行酶法合成，方便易行，催化效率高，发酵成本低，产物容易分离，因此本发明在L-鸟氨酸和D-精氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化前景。

附图说明

图1是氨基酸的HPLC检测；

图2是交联剂的优化，

■为DMP；●为戊二醛；

图3是催化条件的优化，分别是：

反应温度与L-精氨酸转化率的关系；pH与L-精氨酸转化率的关系；反应时间与L-精氨酸转化率的关系；底物L-精氨酸对L-精氨酸转化率的关系；固定化酶与L-精氨酸转化率的关系；Mn²⁺与L-精氨酸转化率的关系；

图4是固定化酶稳定性考察。

具体实施方式

实施例1

精氨酸酶基因的克隆及表达

麻醉小鼠，取肝脏100mg，提取mRNA后进行反转录PCR，1％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带后，连接pET21a(+)载体，构建pET21a(+)-Arg1，并转入BL21(DE3)，获得基因工程菌BL21(DE3)-pET21a(+)-Arg1，取一个精氨酸酶工程菌单菌落接种于LB培养基，37℃培养过夜以获得饱和培养物，将饱和培养物以1％接种于含Amp(100μg/ml)的LB培养基中，37℃继续培养OD₆₀₀达到0.5时，添加IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃诱导2h诱导表达精氨酸酶。确认表达产物具备催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸活性后，将Arg1连接至pET35b，构建pET35b-Arg1载体，并转入BL21(DE3)，获得基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-Arg1，诱导表达后确认表达产物具备催化L-精氨酸转化为L-鸟氨酸活性。

实施例2

反应液中L-鸟氨酸及DL-精氨酸的高效液相色谱法检测

以100μL 10mmol/L Na₂CO₃溶液(pH 9)溶解DL-精氨酸及L-鸟氨酸，使其终浓度为10～40mmol/L，随后加入到1％的FDAA 200 μL丙酮溶液中，40℃孵育1h后，加入2N HCl 20μL终止反应，20μL进样分析。色谱柱：C₁₈色谱柱(Phenomenex Luna 5μ，100A，250×4.6mm)；进样体积：20μL。流动相：水∶乙腈(含0.1％TFA)＝1∶1为流动相；室温；流速为1mL/min；检测波长340nm。

反应液离心取上清液，按上述方法衍生后进行HPLC分析，与鸟氨酸标准曲线比对，计算底物溶液中L-精氨酸的摩尔转化率。

实施例3

纤维素载体的制备

取10g脱脂棉，浸泡于200mL 19％的NaOH，室温静置2h，去除碱液，分散后，室温避光静置3d，加8mL CS₂，立即密闭震动，210rpm室温振荡过夜，向其中加入50mL6％的NaOH，充分溶解纤维素胶后，210rpm室温振荡直至得到均一的纤维素黄胶液。取20mL纤维素黄胶液，加入50mL有机相(氯苯∶四氯化碳＝9∶2)。13000rpm匀浆2min，随后将匀浆液加入400mL有机相中，75℃300rpm机械搅拌2h，冷却后洗涤获得纤维素载体(产品的粒径分布主要在5～100微米)。

实施例4

精氨酸酶的固定化

分别取10mL纤维素微球载体，加入到50mL实施例1构建的基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-Arg1的裂解液中，4℃振荡过夜。磷酸钠缓冲液洗涤后，加入不同浓度的戊二醛或DMP交联，随后以1M Gly封闭10h，磷酸钠缓冲液洗涤，确认最佳的交联剂为DMP，浓度为0.1％，4℃保存备用。

将纤维素磁性微球替换为棉花等纤维素材料，具备相同的固定化结果。

实施例5

固定化精氨酸酶反应条件优化

以上述实例4中固定化酶为酶源，分别在每升反应体系中加入底物L-精氨酸为10～50g；Mn²⁺为0.1mM～10mM；转化温度为25～50℃；转化pH值为6～11；转化时间为0.5～4h，固定化酶为0.5～5mL/L。(以上各参数具体取值如图3中各点所示，此处略)考察不同的转化条件对L-精氨酸转化率的影响，并采用实施例2中的方法检测L-鸟氨酸的含量，计算L-精氨酸的转化率。

如图3所示，分别：

考察反应温度与L-精氨酸转化率的关系；固定化酶1mL；底物L-精氨酸用量为20g；Mn²⁺为2mM；转化pH值为7；转化时间为1h。

考察pH与L-精氨酸转化率的关系；固定化酶1mL；底物L-精氨酸用量为20g；Mn²⁺为2mM；转化时间为1h；转化温度为37℃。

考察反应时间与L-精氨酸转化率的关系；固定化酶1mL；底物L-精氨酸用量为20；Mn²⁺为2mM；转化pH值为8；转化温度为37℃。

考察底物与L-精氨酸转化率的关系；固定化酶1mL；Mn²⁺为2mM；转化温度为37℃；转化pH值为8；转化时间为2h。

考察固定化酶与L-精氨酸转化率的关系；底物L-精氨酸用量为40g；Mn²⁺为2mM；转化pH值为8；转化时间为2h；转化温度为37℃。

考察Mn²⁺与L-精氨酸转化率的关系；固定化酶2mL；底物L-精氨酸用量为40g；转化温度为37℃；转化pH值为8；转化时间为2h。

确认最佳转化条件：反应温度，37℃；反应体系pH，8；反应时间，2h；底物浓度，40g/L L-精氨酸；固定化酶用量，2mL/L；Mn²⁺浓度，1mM。

在最适酶促反应条件下，L-精氨酸的转化率约为97.3％。

实施例6

酶的稳定性考察

单次催化反应结束后过滤分离固定化酶和产物L-鸟氨酸，回收的固定化酶重复用于下一次催化反应。反复使用20次，固定化酶的重复实验结果表明，L-精氨酸转化率可达80％以上，且前15次底物L-精氨酸的转化率均在85％以上，前10次底物L-精氨酸的转化率均在90％以上(图4)。

实施例7

L-鸟氨酸的制备及分离

以实施例5确定的最佳条件，以固定化酶为酶原酶法制备L-鸟氨酸，随后过滤，收集上清液，采用重结晶方法制备L-鸟氨酸，100mL体系中加入0.2mL固定化酶，经10次连续反应，可制备L-鸟氨酸白色粉末28.24g，采用HPLC检测，产物纯度达到98.9％。

实施例8

DL-精氨酸的拆分

以实施例5确定的最佳条件，以固定化酶为酶原酶法拆分DL-精氨酸，随后过滤，收集上清液，采用大孔吸附树脂001×7层析分离，制备L-鸟氨酸和D-精氨酸，100mL体系中加入0.2mL固定化酶，经10次连续反应，可制备L-鸟氨酸白色粉末24.65g，D-精氨酸35.44g，采用HPLC检测，产物纯度均达到98.1％以上。

Claims (3)

1.一种采用固定化酶制备L-鸟氨酸的方法，其特征在于该方法包括：

以固定化的重组表达的精氨酸酶为酶源，以L-精氨酸为底物，在25至50℃下，pH值为6至11，经酶法转化反应0.5至5h，在0.1至10mM Mn²⁺存在的条件下，在每升催化反应液中底物L-精氨酸加入量为10至50g，固定化酶0.5mL至5mL，产生L-鸟氨酸，进一步分离获得L-鸟氨酸；或在相同条件下，以DL-精氨酸为底物，拆分20至80g/L的DL-精氨酸制备D-精氨酸和L-鸟氨酸；

所述重组表达的精氨酸酶来自构建的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-Arg1的细胞裂解液，重组菌株中的表达载体为pET35b-Arg1重组表达载体，具体构建方法是：以小鼠肝脏mRNA反转录制备的cDNA为模板PCR扩增精氨酸酶Arg1基因，连接入pET21a(+)中构建pET21(+)-Arg1表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)中后诱导表达确认Arg1活性，随后将该基因酶切后连接入pET35b中构建pET35b-Arg1载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达确认Arg1活性后，命名BL21(DE3)-pET35b-Arg1；

重组菌体细胞中表达有融合蛋白纤维素结合域-精氨酸酶；

所述的固定化重组表达的精氨酸酶是以基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)-pET35b-Arg1的细胞裂解液为起始酶源，经过粒径大小为5～100微米的纤维素微球吸附，完成固定化，得到固定化的重组表达的精氨酸酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于固定化时使用的交联剂为戊二醛或DMP，浓度为0.01～1%。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述纤维素微球蛋白吸附能力为20mg/mL，优选的交联剂为DMP，最佳浓度为0.1%。

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