CN104178536A - 一种r-3-氨基哌啶的生物制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，按照SEQIDNO：1所示的序列进行全基因合成，克隆入表达载体pET22a制备重组表达载体，将该载体转入大肠杆菌制备出重组D-转氨酶的基因工程菌；对该菌进行培养制备出重组D-转氨酶基因工程菌；反应溶液中加入加入终浓度为10-300mmol/L的3-酮基哌啶、质量浓度为2-15%的二甲基亚砜或乙腈、终浓度为0.1-1mmol/L的磷酸吡哆醛、终浓度为0.02-1mol/L的异丙胺或D-丙氨酸，和质量浓度为0.2-0.4%的重组D-转氨酶组成反应体系进行反应；反应结束后提取反应液中的R-3-氨基哌啶；本发明成本低，转化率达到97%以上，产物得率大于85%，没有副产物，更适合工业应用。
Description
技术领域
本发明涉及R-3-氨基哌啶的制备方法，具体的说是一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法。
背景技术
生物催化具有反应条件温和、效率高、立体和区域选择性强、环境友好等特点 , 因此生物催化在新药的研究和开发中得到了广泛的应用。此外,利用理性设计和定向进化对生物催化剂进行改造优化，如提高催化剂的稳定性和底物选择性, 将使其能够更好地应用于生产工艺。转氨酶作为生物催化剂主要是用于合成手性氨，手性氨基酸以及手性氨醇。
R-3-氨基哌啶在有机合成和药物生产中有着广泛的用途，结构式如下：
目前有用化学方法，在HCl，H2和催化剂钯的催化下，在甲醇和水存在的情况下合成R-3-氨基哌啶（US2010/105917）。也有用L-转氨酶催化拆分消旋3-氨基哌啶，通过降解S-3-氨基哌啶获得R-3-氨基哌啶的酶催化法（Adv. Synth. Catal. 2008, 350, 807-812）,这种方法转化率不会超过50%。目前尚没有用D-转氨酶直接催化3-酮基哌啶合成R-3-氨基哌啶的报道。
发明内容
本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，，该方法与化学法相比，具有环境友好，光学选择性高等优点，原料成本低廉，操作简便，更适用于工业化大量生产。
一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一、重组D-转氨酶基因工程菌的制备
选择来源于Arthrobacter.sp.的D-转氨酶野生序列，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQ ID NO：1所示；将该序列通过全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌；
步骤二、重组D-转氨酶的制备
将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷或终质量浓度为0.5%的D-乳糖，置于25-28℃继续培养20-24h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用；
所述超声破碎的具体方法为：将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为工作5s，间歇15s, 循环数30。
步骤三、R-3-氨基哌啶的制备
在反应溶液中依次加入终浓度为10-300mmol/L的底物、质量浓度为2-15%的助溶剂、终浓度为0.1-1mmol/L的辅因子、终浓度为0.02-1mol/L的氨基供体和质量浓度为0.2-0.4%的重组D-转氨酶组成反应体系；将该反应体系在25-30℃的条件下反应24-26h；反应结束后，检测反应液中R-3-氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反应液中的R-3-氨基丁醇，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基丁醇；反应体系的反应过程，取样并采用高效液相或毛细管电泳进行检测样品中R-3-氨基哌啶光学纯度（ee值）和转化率，以监控其反应过程。
所述底物为3-酮基哌啶；所述的反应溶液为pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L Tirs缓冲液或pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜或乙腈；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺或D-丙氨酸。
有益效果是：
本发明提供的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，初始原料为3-酮基哌啶，价格便宜。反应结束后，生成的氨、水、氧气易于除去，对产品的分离纯化没有干扰，水相体系中只剩下R-3-氨基哌啶，易于分离，有助于提高产品纯度和收率，降低分离成本。所需的D-氨基酸酶可通过构建大肠杆菌基因工程菌，然后通过发酵大量制备，相对易得和廉价。所述反应为“一锅煮”式，底物和所有酶同时加入开始反应，直接得到终产物R-3-氨基哌啶，中间无需分离提纯。工艺成本低，转化率达到97%以上和产物得率大于85%，并且没有副产物影响，该工艺方法适合工业应用。
附图说明
图1是本发明R-3-氨基哌啶的生物制备方法的反应原理图。
具体实施方式
一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一、重组D-转氨酶基因工程菌的制备
选择来源于Arthrobacter.sp.的D-转氨酶野生序列，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQ ID NO：1所示；将该序列通过全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌；
步骤二、重组D-转氨酶的制备
将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷或终质量浓度为0.5%的D-乳糖，置于25-28℃继续培养20-24h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用；
所述超声破碎的具体方法为：将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为工作5s，间歇15s, 循环数30。
步骤三、R-3-氨基哌啶的制备
在反应溶液中依次加入终浓度为10-300mmol/L的底物、质量浓度为2-15%的助溶剂、终浓度为0.1-1mmol/L的辅因子、终浓度为0.02-1mol/L的氨基供体和质量浓度为0.2-0.4%的重组D-转氨酶组成反应体系；将该反应体系在25-30℃的条件下反应24-26h；反应结束后，检测反应液中R-3-氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反应液中的R-3-氨基丁醇，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基丁醇；反应体系的反应过程，取样并采用高效液相或毛细管电泳进行检测样品中R-3-氨基哌啶光学纯度（ee值）和转化率，以监控其反应过程。
所述底物为3-酮基哌啶；所述的反应溶液为pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L Tirs缓冲液或pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜或乙腈；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺或D-丙氨酸。
实施例1
一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一、重组D-转氨酶基因工程菌的制备
选择来源于Arthrobacter.sp.的D-转氨酶野生序列，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQ ID NO：1所示；将该序列通过全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌；
步骤二、重组D-转氨酶的制备
将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.6，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷或终质量浓度为0.5%的D-乳糖，置于25℃继续培养20h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用；
所述超声破碎的具体方法为：将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为工作5s，间歇15s, 循环数30。
步骤三、R-3-氨基哌啶的制备
在反应溶液中依次加入终浓度为300mmol/L的底物、终质量百分比浓度为2%助溶剂、终浓度为0.1mmol/L的辅因子，终浓度为0.02mol/L的氨基供体和终质量百分比浓度为0.2%的重组D-转氨酶组成反应体系；将该反应体系在25℃的条件下反应24h；反应体系的反应过程，取样并采用毛细管电泳检测样品中R-3-氨基哌啶光学纯度（ee值）为99%和转化率99%；反应结束后，用乙酸乙酯或二氯甲烷剂提取反应液中的R-3-氨基哌啶，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷剂剂，即得到R-3-氨基哌啶，得率90%；
所述底物为3-酮基哌啶；所述的反应溶液为pH为8.0、50mmol/L磷酸盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺。
实施例2
一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一、重组D-转氨酶基因工程菌的制备
选择来源于Arthrobacter.sp.的D-转氨酶野生序列，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQ ID NO：1所示；将该序列通过全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌；
步骤二、重组D-转氨酶的制备
将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷或终质量浓度为0.5%的D-乳糖，置于28℃继续培养24h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用；
所述超声破碎的具体方法为：将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为工作5s，间歇15s, 循环数30。
步骤三、R-3-氨基哌啶的制备
在反应溶液中依次加入终浓度为300mmol/L的底物、终质量百分比浓度为2-15%助溶剂、终浓度为1mmol/L的辅因子，终浓度为1mol/L的氨基供体和终质量百分比浓度为0.4%的重组D-转氨酶组成反应体系；将该反应体系在30℃的条件下反应26h；反应体系的反应过程，取样并采用高效液相检测样品中R-3-氨基哌啶光学纯度（ee值）为99%和转化率98%；反应结束后，用乙酸乙酯或二氯甲烷剂提取反应液中的R-3-氨基哌啶，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷剂剂，即得到R-3-氨基哌啶，得率89%；
所述底物为3-酮基哌啶；所述的反应溶液为pH为11.0的100mmol/L Tirs缓冲液；所述的助溶剂为二乙腈；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为D-丙氨酸。
实施例3
一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一、重组D-转氨酶基因工程菌的制备
选择来源于Arthrobacter.sp.的D-转氨酶野生序列，进行人工设计，设计后的基因序列如SEQ ID NO：1所示；将该序列通过全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌；
步骤二、重组D-转氨酶的制备
将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.7，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷或终质量浓度为0.5%的D-乳糖，置于25-28℃继续培养20-24h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用；
所述超声破碎的具体方法为：将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为工作5s，间歇15s, 循环数30。
步骤三、R-3-氨基哌啶的制备
在反应溶液中依次加入终浓度为100mmol/L的底物、终质量百分比浓度为10%的助溶剂、终浓度为0.2mmol/L的辅因子，终浓度为0.05mol/L的氨基供体和终质量百分比浓度为0.3%的重组D-转氨酶组成反应体系；将该反应体系在28℃的条件下反应25h；反应体系的反应过程，取样并采用高效液相检测样品中R-3-氨基哌啶光学纯度（ee值）为99%和转化率97%；反应结束后，用乙酸乙酯或二氯甲烷剂提取反应液中的R-3-氨基哌啶，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷剂剂，即得到R-3-氨基哌啶，得率87%；
所述底物为3-酮基哌啶；所述的反应溶液为pH为10.0的80mmol/L碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为乙腈；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为D-丙氨酸。
本发明中所述的试剂均为常用试剂，可从市场购买得到；所述大肠杆菌BL21（DE3）为常用菌种，可通过市场购买得到。
所述的LB液体培养基的组成成份：按重量百分比LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、3%的氯化钠，余量为水。
所述TB培养基的组成成份：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，磷酸二氢钾17mmol/L，磷酸氢二钾72mmol/L，余量为水。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳华荣生物技术有限公司
<120> 一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtggcattca gcgccgatac ctccgagatc gtctacacgc acgacaccgg cctcgactac 60
atcacttata gcgactacga actcgatcct gctaacccgc tcgcgggagg tgcggcatgg 120
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ggggttcccg gccccatcac ccagtcgatc atccgtcgtt actgggagct gaatgtcgag 960
agctcgtcgt tgcttacgcc tgtgcagtac tga 993
Claims (5)
1.一种R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
步骤一、重组D-转氨酶基因工程菌的制备
按照人工设计如SEQ ID NO：1所示的序列进行全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位点；转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导表达重组D-转氨酶的重组D-转氨酶基因工程菌；
步骤二、重组D-转氨酶的制备
将重组D-转氨酶基因工程菌接种到含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃培养16h，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素抗性的TB液体培养基中，接种量为含卡那霉素抗性的TB液体培养基体积的1%；然后置于37℃下培养至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为0.01mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷或终质量浓度为0.5%的D-乳糖，置于25-28℃继续培养20-24h后，离心收集菌体；采用磷酸盐缓冲液将收集后的菌体，洗一次之后重悬，将悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组D-转氨酶，检测其中的蛋白含量，备用；
步骤三、R-3-氨基哌啶的制备
在反应溶液中依次加入终浓度为10-300mmol/L的底物、终质量百分比浓度为2-15%的助溶剂、终浓度为0.1-1mmol/L的辅因子、终浓度为0.02-1mol/L的氨基供体和终质量百分比浓度为0.2-0.4%的重组D-转氨酶组成反应体系；将该反应体系在25-30℃的条件下反应24-26h；反应结束后，检测反应液中R-3-氨基哌啶的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反应液中的R-3-氨基哌啶，用旋转蒸发除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基哌啶；
所述底物为3-酮基哌啶；所述的反应溶液为pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L磷酸盐缓冲液、pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L Tirs缓冲液或pH值为8.0-11.0的50-100mmol/L碳酸氢盐缓冲液；所述的助溶剂为二甲基亚砜或乙腈；所述的辅因子为磷酸吡哆醛；所述的氨基供体为异丙胺或D-丙氨酸。
2.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：步骤二中所述超声破碎的具体方法为：将悬浮液置于冰浴中采用超声波破碎，参数为工作5s，间歇15s, 循环数30。
3.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：步骤二所述检测上清液中蛋白含量的方法为Bradford法。
4.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：步骤三中反应体系的反应过程，取样并采用高效液相进行检测样品中R-3-氨基哌啶光学纯度和转化率，以监控其反应过程。
5.如权利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制备方法，其特征在于：步骤三中反应体系的反应过程，取样并采用毛细管电泳测定样品中R-3-氨基哌啶的光学纯度和转化率，以监控其反应过程。
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