CN110551671A - 一株产surfactin基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株产surfactin基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Abstract

本发明公开了一株产surfactin基因工程菌及其构建方法和应用。所述工程菌以枯草芽孢杆菌B.subtilis 168为宿主细胞，通过基因工程手段，强化了surfactin合成前体3‑羟基脂酰CoA的合成途径。获得的基因工程菌分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSFX022，保藏编号为CCTCC NO：M 2019254。将最终所得的工程菌枯草芽孢杆菌BSFX022用于发酵生产surfactin，其产量是对照菌株的2.39倍；此外，通过向培养基中添加10～20mM的L‑leu的方法，可使得surfactin的产量在原来基础上提高20％左右。以木糖为碳源时，该菌株可以高效合成surfactin且有机酸副产物积累量较低；基于此本发明提供了无磷酸缓冲的发酵体系用于合成surfactin的发酵工艺。为进一步降低成本，以富含木糖的玉米芯稀酸水解液和富含氨基酸的味精发酵废液为原料，重组菌的surfactin发酵产量可达2032mg/L。

Description

一株产surfactin基因工程菌及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一株产surfactin基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
由于人们越来越重视绿色化学品和工业过程，低毒、环保和可生物降解的生物表面活性剂引起了研究者极大的兴趣。生物表面活性剂根据其天然化学结构和微生物来源分为糖脂、磷脂、脂肽、脂蛋白、聚合物表面活性剂和颗粒表面活性剂。其中，脂肽是由亲水肽环和疏水脂肪酸部分组成一类抗菌肽。根据其结构特征，脂肽可分为两类：环脂肽(CLPs)和线性脂肽。迄今为止发现的环状脂肽主要由枯草芽孢杆菌B.subtilis产生，包括：fengycin，iturin和surfactin。
生物表面活性素surfactin，是由枯草芽孢杆菌培养液中发现的一种次级代谢产物，是报道最多的具有广谱抗菌活性的脂肽之一。Surfactin的疏水头部由13-16个碳原子的β-羟基脂肪酸链构成，亲水的尾部是一种环状七肽，通常含有L-谷氨酸(L-Glu)，L-天冬氨酸(L-Asp)，L-缬氨酸(L-Val)，L-亮氨酸(L-Leu)和D-亮氨酸(D-Leu))。Surfactin由于其独特的结构，不仅可以将水的表面张力从72mN/m降低到27mN/m，而且还具有高度的热稳定性和耐盐性。因此，Surfactin在提高油采收率方面有很大的潜力。除此之外，surfactin还被广泛地用于环境，医药和食品等利用，
用于surfactin生产的野生型菌株产量都比较低，大约在500mg/L左右，远远不能满足surfactin的工业化应用规模。常用的提高产量的方法就是发酵优化，发酵优化包括许多因素如：溶氧，pH，温度，搅拌速度，培养基组成和反应器等。然而，随着分子技术的发展，构建产surfactin的基因工程菌越来越受到关注。基于surfactin的合成机理和结构研究，我们知道surfactin是由srfA操纵子编码(srfAA，srfAB，srfAC，srfAD)的非核糖体肽合成酶(NRPS)合成的。因此对于surfactin的分子改造策略主要有包括改造srfA的启动子Psrf，增强外排系统，修饰srfA相关表达基因，改造NRPS结构域和组合生物合成的转录调控基因。常用的底盘细胞B.subtilis168由于sfp基因的移码突变，使得其不具有合成surfactin的能力；因此，需要将有功能的sfp基因回补到168菌株中才可以合成并积累surfactin。
surfactin的合成前体主要分为直链的脂酰CoA和支链的脂酰CoA。支链脂酰CoA的合成前体为支链氨基酸，直链脂酰CoA的合成前体来自于脂肪酸的从头合成途径。根据已知文献报道通过强化支链氨基酸L-leu的合成途径可以大大地提高surfactin的产量。此外，由于surfactin的合成受到pH的严格调控，当发酵体系pH低于6.0时，surfactin的合成受到抑制；因此，在surfactin的发酵体系中，培养基中往往要加入大量的磷酸缓冲体系，通常为30mM磷酸二氢钾和30-40mM磷酸氢二钠，用于中和发酵过程中积累的有机酸副产物，维持发酵体系pH近中性。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一株可高产surfactin的枯草芽孢杆菌基因工程菌。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一株产surfactin基因工程菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSFX022，保藏编号为CCTCC NO：M 2019254。
本发明的另一目的是提供上述枯草芽孢杆菌BSFX022的构建方法。
本发明的上述枯草芽孢杆菌BSFX022的构建方法，包括以下步骤：
将含有P43启动子和编码磷酸泛酰巯基转移酶的sfp基因整合到出发菌株B.subtilis168中得到重组菌，记作BSFX01；
将加州月桂树(UmbellulariaCalifornica)的酰基载体蛋白硫酯酶(acyl-acylcarrier protein(ACP)thioesterase)编码基因bte置于启动子P43的调控下，P43-bte整合到枯草芽孢杆菌BSFX01中cydBC(编码细胞色素醌醇氧化酶)位点，得到重组菌，记作BSFX02；
向所述重组菌BSFX02中，引入在启动子P43调控下的来自贝莱斯芽孢杆菌BS-37(B.velezensis BS-37)的脂酰CoA连接酶(fatty acyl CoA ligase)编码基因yhfl(P43-yhfl)，P43-yhfl整合到枯草芽孢杆菌BSFX02中解淀粉酶编码基因amyE位点，得到重组菌BSFX021。
在重组菌BSFX021中敲除基因fadE，得到重组菌BSFX022。
本发明的再一目的是提供上述枯草芽孢杆菌BSFX022在发酵产surfactin中的应用。
本发明提供了一种具体的应用方式，包括如下步骤：
种子培养：将菌株BSFX022在种子培养基中培养；
发酵培养：将种子培养的培养液接种至发酵培养基进行发酵培养；
分离纯化：取发酵培养的发酵液离心后，取上清液加入无水乙醇，离心分离。
种子培养基组份为：蛋白胨10g/L，酵母粉提取物5g/L，氯化钠10g/L。
发酵培养基组分为：碳源20g/L,蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L。所述碳源为蔗糖、葡萄糖、甘油或木糖。
作为本发明的进一步改进，所述发酵培养体系为无磷酸缓冲体系；发酵培养基组分为：碳源20g/L，氮源5g/L，磷酸氢二钠0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L；所述碳源为木糖或含木糖的玉米芯水解液；所述氮源为蛋白胨，或味精废液和蛋白胨复合氮源。
作为本发明的进一步改进，在发酵培养基中添加支链氨基酸L-leu；进一步的，支链氨基酸L-leu添加浓度为0～20mM，优选10～20mM。
本发明从提高前体3-羟基脂酰CoA胞内供给的角度设计了强化代谢合成surfactin途径，以B.subtilis 168为底盘细胞，将含sfp基因的游离质粒pHYp43-sfp导入，在此基础上将外源bte基因(加州月桂Umbellularia californica的酰基载体蛋白硫酯酶编码基因)，yhfl基因(贝莱斯芽孢杆菌BS-37的脂酰CoA连接酶编码基因)置于启动子P43的调控下整合入B.subtilis 168染色体，最后将导致脂酰基CoA进入β-脂肪酸氧化途径的fadE基因(编码乙酰CoA脱氢酶)敲除，构建了一株高产surfactin的B.subtilis168工程菌。该基因工程菌株可以利用蔗糖、葡萄糖、甘油以及木糖等碳源发酵产surfactin；特别的是以木糖为碳源时，该发酵体系中有机酸副产物含量低；可实现无磷酸缓冲的surfactin发酵体系的开发，大幅降低了磷酸盐用量，降低了发酵成本。以富含木糖的玉米芯稀酸水解液和富含氨基酸的味精废液为原料，利用重组菌发酵产surfactin的产量可到2032mg/L，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为反向筛选标记敲除方法，该技术手段由南京农业大学闫新教授提供；其中LF代表敲除基因上游片段800bp，RF代表敲除基因自身800bp，DR代表基因下游500bp，PCcassette由南农提供的质粒pTPC扩增出来。
图2为基因整合方法，该方法在敲除方法上稍微进行改动，IG表示想插入基因组的目标片段。
图3为基因工程菌BSFX01，BSFX02，BSFX03，BSFX04，BSFX021，BSFX022发酵生产surfactin。
图4为不同浓度L-leu对菌株BSFX022产surfactin的影响，以添加0mM的L-Leu的BSFX022的发酵数据作为对照。
图5为基因工程菌BSFX022利用不同碳源时的有机酸积累量，灰色和白色分别为乙酸浓度和乳酸浓度。
图6为基因工程菌BSFX022利用玉米芯水解液和味精发酵废液的surfactin产量。
本发明所述的生物材料，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSFX022，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2019254，保藏时间：2019年4月15日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
限制性内切酶，T4连接酶购自大连宝生物工程公司，Taq酶购自诺维赞生物有限公司。其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。
出发菌株枯草杆菌为现有的枯草芽孢杆菌168。基因敲除方法反向筛选标记法，流程如图1所示；基因整合方法为在基因敲除方法基础上稍微改动的方法，流程如图2所示。
重组基因的获得与重组质粒的构建
加州月桂树(Umbellularia Californica)的酰基载体蛋白硫酯酶(acyl-acylcarrier protein(ACP)thioesterase)编码基因bte是由泓迅生物科技有限公司合成，基因全序列如SEQ ID NO.1所示，合成好的基因构建在质粒pUC18上，构成重组质粒pUCBTE。yhfL基因和sfp基因都是以贝莱斯芽孢杆菌BS-37(Bacillus velezensis BS-37)为模板进行扩增的，B.velezensis BS-37的全基因组在GenBank中的编号为CP023414.1。。基因的整合表达都是根据图2的方式整合到枯草芽孢杆菌168全基因组上，调控基因sfp，bte和yhfl表达的启动子为P43，其基因全序列为SEQ ID NO.2。枯草芽孢杆菌168基因组上的基因fadE的敲除是根据图1所述的方式进行的。
PCR扩增：95℃预变性3min，95℃变性15s，Tm退火15s，72℃延伸30s/1kb，30个循环后72℃延伸5min。
枯草芽孢杆菌感受态制备和转化方法
根据GM I-GM II法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备并进行转化，转化后涂布相应的抗性平板筛选重组枯草芽孢杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR进行验证，接着送测序公司测序验证。
发酵产物的分离和检测
取1mL发酵液在转速12000rpm，离心5分钟。然后取300uL上清加入1200uL分析纯乙醇混合均与后12000rpm，离心5分钟后取后上清过膜后用于HPLC检测。在214nm波长下，以0.8mL/min的流速，流动相为90％(v/v)甲醇用岛津LC-20，Venusil XBP C18-P(4.6×150mm,5μm)s色谱柱进行检测。
实施例1枯草芽孢杆菌BSFX01的构建
第一步：按照图2所示，构建打靶片段P43-sfp。基因整合位点为4’磷酸泛酰巯基转移酶sfp，然后利用引物对P43-sfp-LF-F/P43-sfp-LF-R和P43-sfp-DR-F/P43-bte-DR-R及P43-sfp-RF-F/P43-sfp-RF-R，以B.subtilis168的全基因组为模板，分别扩增出sfp的LF，DR和RF。以江南大学刘龙课题组提供P43启动子和B.velezensis基因组为模板，分别用引物对P43-sfp-F1/P43-sfp-R1，P43-bte-F2/P43-bte-R2扩增出片段P43’和sfp’；以南农提供的pTPC质粒为模板，以PC-F/PC-R引物扩增出PC cassette。随后用引物P43-sfp-LF-F/P43-bte-RF-R，以LF，P43’，sfp’，DR，PC cassette，RF为模板扩增出打靶片段LF-P43-sfp-DR-PC-RF。
PC-F:ATTTTTAAAGTATGTATACAAATGA
PC-R:TTATAAAAGCCAGTCATTAGGCCTA
P43-sfp-LF-F:CTAAAATCTATTATTAATCTGTTCAGCA
P43-sfp-LF-R:ATCGCCATTGAACAGCCGGGCTACC
P43-sfp-F1:GGTAGCCCGGCTGTTCAATGGCGATTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGA
P43-sfp-R1:CCATATATACTCCGTAAATCTTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAA
P43-sfp-F2:ATGAAGATTTACGGAGTATATATGG
P43-sfp-R2:TTATAACAGCTCTTCATACGTTTTC
P43-sfp-DR-F:GAAAACGTATGAAGAGCTGTTATAATTCCTTTTCAGTGCGCCTGCACCAG
P43-sfp-DR-R:TCATTTGTATACATACTTTAAAAATCAGATTATCCGAAAGAAAATCTATT
P43-sfp-RF-F:TAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAAATGAAGATTTACGGAATTTATATGG
P43-sfp-RF-R:TCTCCTTGAGGCGATAGACCGTCAT
扩增体系：
ddH2O 20μL
高保真酶混合物25μL
引物1 2μL
引物2 2μL
模板1μL
PCR程序：95℃预变性，5min，(95摄氏度变性，15s，退火Tm温度，15s，72℃延伸，30s/kb)30个循环，72℃，5min。
第二步：利用芽孢杆菌天然感受态的形成原理，采用GM I-GM II转接培养的方法制备高效B.subtilis168感受态细胞，具体过程为：a)划线B.subtilis168至LB平板；b)取单菌落接种于5mL的GM I培养基，30℃，100rpm过夜培养；c)取2mL培养液转接至18mL GM I培养基,37℃，200rpm，培养3.5h；d)取10mL培养液转接至90mL GM II培养基，37℃，100rpm,培养1.5h；e)4℃，8000rpm，离心10min；f)取0.5mL离心上清重悬的离心细胞作为感受态，记作感受态I。
第三步：转化打靶片段LF-P43-sfp-DR-PC-RF，构建重组菌BSFX01。a)先向制备好的0.5mL的感受态中加入1ug的DNA片段，37℃，100rpm培养1h。b)涂布氯霉素抗性平板，37℃，培养12h。然后菌落PCR验证转化子。挑取阳性克隆子接种于加了无抗性的LB，培养4h使得菌株自身发生如图2所示的DR之间同源重组。然后稀释10倍，取200μL涂布含四环素的MGY-Cl平板上，37℃培养12h，菌落PCR验证出整合了P43-sfp，且无氯霉素抗性标记的阳性克隆子，测序正确的克隆子记作BSFX01，将菌株按照上述感受态制备方法，最终感受态记作感受态Ⅱ。
MGY-Cl培养基配方：葡萄糖5g/L，酵母粉提取物4g/L，硝酸铵1g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.2g/L，DL-4-氯-苯丙氨酸5Mm。
实施例2枯草芽孢杆菌BSFX02的构建
第一步：利用图2的片段整合原理，构建P43-bte打靶片段。首先整合位点为细胞色素泛醇氧化酶cydBC位点，然后利用引物对P43-bte-LF-F/P43-bte-LF-R和P43-bte-DR-F/P43-bte-DR-R及P43-bte-RF-F/P43-bte-RF-R，以B.subtilis168的全基因组为模板，分别扩增出cydBC的LF，DR和RF。以江南大学刘龙课题组提供P43启动子和为质粒pUCBTE为模板，分别用引物对P43-bte-F1/P43-bte-R1，P43-bte-F2/P43-bte-R2扩增出片段P43”和bte，PCcassette为实施例1中的得到的，随后用引物P43-bte-LF-F/P43-bte-RF-R，以LF，P43”，bte，DR，PC cassette，RF为模板扩增出打靶片段LF-P43-bte-DR-PC-RF。
P43-bte-LF-F:CGGAGTGAGTGCTTTTAAACTGCTG
P43-bte-LF-R:GGTATACCTCCTGACTAAATGGATC
P43-bte-F1:GATCCATTTAGTCAGGAGGTATACCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGA
P43-bte-R1:CAGAAGCAAGAGATGTTGTAGCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAA
P43-bte-F2:ATGGCTACAACATCTCTTGCTTCTG
P43-bte-R2:TTATATCGAAACAGGTCTTTTCCCATTAAACACGAGGTTCAGCAGGGATA
P43-bte-DR-F:TGGGAAAAGACCTGTTTCGATATAA
P43-bte-DR-R:TCATTTGTATACATACTTTAAAAATGCTGACCATTTTCGGCAGAAACAGC
P43-bte-RF-F:TAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAAATGGCATCTCTTCATGATCTTTGGT
P43-bte-RF-R:GGTCAGCGCCAGACCAGCGCCTGTC
第二步：转化第一步中的打靶片段进感受态Ⅱ，并删除抗性筛选标记。和实施例1中的转化方法相同，将1μg的打靶片段加入0.5mL的重组菌BSFX01的感受态Ⅱ中，37℃，100rpm培养1h后涂布氯霉素抗性平板，37℃，培养12h。然后菌落PCR验证转化子。挑取阳性克隆子接种于加了无抗性的LB，培养4h使得菌株自身发生如图2所示的DR之间同源重组。然后稀释10倍，取200μL涂布含四环素的MGY-Cl平板上，37℃培养12h，菌落PCR验证出整合了P43-bte，且无氯霉素抗性标记的阳性克隆子，测序正确的克隆子记作BSFX02，将菌株按照实施例1中的感受态制备方法，最终感受态记作感受态III。
实施例3基因工程菌BSFX03和BSFX021的构建
第一步：构建P43-yhfl的整合打靶片段。片段构建方法和实施例2相同，先从NCBI数据库中找到B.velezensis BS-37和B.subtilis168的全基因组序列。P43-yhfl的整合位点为解淀粉amyE位点。根据序列设计引物。然后利用引物对P43-yhfl-LF-F/P43-yhfl-LF-R和P43-yhfl-DR-F/P43-yhfl-DR-R，P43-yhfl-RF-F/P43-yhfl-RF-R及P43-yhfl-F2/P43-yhfl-R2，以Bacillus velezensisBS-37的全基因组为模板，分别扩增出amyE的LF*，DR*，RF*和yhfl*片段。用P43-yhfl-F1/P43-yhfl-R1引物，以P43启动子为模板，扩增出P43*片段。PCcassette为实施例1所扩增。最后以引物P43-yhfl-LF-F/P43-yhfl-RF扩增出打靶片段LF*-P43*-yhfl*-DR*-PCcassette-RF*
P43-yhfl-LF-F:ACCCGACATCCGGCGTTCTCATGGCGGTGCTTGCC
P43-yhfl-LF-R:TCTTGACACTCCTTATTTGATTTTT
P43-yhfl-F1:AAAAATCAAATAAGGAGTGTCAAGATGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGA
P43-yhfl-R1:CTTCCAATTTTGAAACAAGATTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAA
P43-yhfl-F2:ATGAATCTTGTTTCAAAATTGGAAG
P43-yhfl-R2:TTATGAACGTACCGCTTGTTTG
P43-yhfl-DR-F:CAAACAAGCGGTACGTTCATAAGGGCAAGGCTAGACGGGACTTACCG
P43-yhfl-DR-R:TCATTTGTATACATACTTTAAAAATCTTTTGGCAGGCCGCTGAATTTCCA
P43-yhfl-RF-F:TAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAAATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCT
P43-yhfl-RF-R:TCACCGCCCAGCCTAAACGGATATC
第二步：转化第一步中的打靶片段LF*-P43*-yhfl*-DR*-PC cassette-RF*进入实施例1和2中的感受态II和感受态III，并删除抗性筛选标记。和实施例2相同，利用相同的转化方法，向新做的BSFX02感受态中加入1μg的打靶片段LF*-P43*-yhfl*-DR*-PC，37℃，100rpm培养1h后涂氯霉素抗性平板，37℃，培养12h。然后菌落PCR验证转化子。挑取阳性克隆子接种于无抗性LB，培养4h使得菌株自身发生如图2所示的DR之间同源重组。然后稀释10倍，取200ul涂布含MGY-Cl平板上，37℃培养12h，菌落PCR验证出在amyE位点整合了p43-yhfl，且无抗性标记的阳性克隆子分别命名为BSFX03和BSFX021。
第三步：把上述BSFX021的阳性克隆子利用实施例1的方式制备感受态IV。
实施例4基因工程菌BSFX04和BSFX022菌株的构建
第一步：构建利用图1的片段敲除原理，构建敲除fadE打靶片段。从NCBI数据中找到枯草芽孢杆菌168全基因组中fadE基因序列及上下游基因序列，设计如下引物。利用fadE-LF-F/fadE-LF-R，fadE-DR-F/fadE-DR-R和fadE-RF-F/fadE-RF-A以Bacillusvelezensis BS-37的全基因组为模板，分别扩增出fadE的LF’，DR’和RF’。随后用引物fadE-LF-F/fadE-RF-A，以LF’，DR’，PC cassette，RF’为模板扩增出打靶片段LF’-DR’-PC-RF’。
fadE-LF-F:GTTACCCGTCCGAACCTTGCTTTGG
fadE-LF-R:TCAGACAGTATATTTCTCAGCCTCA
fadE-DR-F:TGAGGCTGAGAAATATACTGTCTGATTGGCCATGAGCTCCGCATGCGCGG
fadE-DR-R:TCATTTGTATACATACTTTAAAAATGCCAAAGCAAGGTTCGGACGGGTAA
fadE-RF-F:TAGGCCTAATGACTGGCTTTTATAAATGGCAAAAAAAGCGGCTGACGTAC
fadE-RF-R:GACGCGTTTAGATGCGCCGATTGTG
第二步：转化第一步中的打靶片段LF’-DR’-PC’-RF’进实施例1和实施例3中制备的枯草芽孢杆菌感受态II和IV，并删除抗性筛选标记。如例3相同，利用相同的转化方法，向枯草芽孢杆菌感受态IV中加入10ug的打靶片段LF’-DR’-PC-RF’。37℃，100rpm培养1h后涂氯霉素抗性和四环素抗性平板，37℃，培养12h。然后菌落PCR验证转化子。挑取阳性克隆子接种于只含四环素抗性的LB中，培养4h使得菌株自身发生如图2所示的DR之间同源重组。然后稀释10倍，取200uL涂布含MGY-Cl和四环素抗性的平板上，37℃培养12h，菌落PCR验证出敲除了fadE，且无氯霉素抗性标记的阳性克隆子，分别记作BSFX04和BSFX022。
实施例5对比枯草芽孢基因工程菌BSFX01，BSFX02，BSFX03，BSFX04，BSFX021，BSFX022生产surfactin的效果
种子培养基和发酵培养基组份：
种子培养基组份为：蛋白胨10g/L，酵母粉提取物5g/L，氯化钠10g/L。
发酵培养基组份为：蔗糖20g/L,蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L。
以枯草芽孢基因工程菌BSFX01，BSFX02，BSFX03，BSFX04，BSFX021，BSFX022生产surfactin步骤：
(1)种子培养基：在250mL锥形瓶中加入50mL种子培养基，于121℃，高温灭菌20min。冷却后挑取BSFX01，BSFX02，BSFX03，BSFX04，BSFX021，BSFX022单菌落于种子培养基中，37℃，200rpm，培养12h。
(2)发酵培养：在250mL锥形瓶中加入50mL发酵培养基，于121℃，高温灭菌20min。冷却后按4％(v/v)的接种量将上述(1)在的BSFX01，BSFX02，BSFX03，BSFX04，BSFX021，BSFX022种子液转接到发酵培养基中，37℃，200rpm，培养36h。
(3)产物分离纯化：将36h后的BSFX01，BSFX02，BSFX03，BSFX04，BSFX021，BSFX022发酵液各取1mL，在转速12000rpm下离心5min。取上清液300μL加入到1500μL的无水乙醇中，混匀后，12000rpm，离心5min。
(4)分析检测：利用高效液相色谱岛津LC-20，在214nm波长下，以0.8mL/min的流速，流动相为90％(v/v)甲醇，10％水，Venusil XBP C18-P(4.6×150mm,5μm)色谱柱进行检测。
(5)细胞干重(DCW)测定：取1mL发酵液稀释12倍，用分光光度计测在波长600下的生物量，记作OD600。OD600和细胞干重的转换关系为：1OD600＝0.352DCW(g/L)。
根据图4可以看出，BSFX01菌株为对照菌，产量在982mg/L左右，通过单独过表达bte和yhfl得到的菌株BSFX02和BSFX03的产量分别是是对照的1.23倍和1.4倍，而同时过表达两个基因得到的菌株BSFX021的产量是对照的1.82倍，说明同时强化脂酰CoA的合成途径可以促进surfactin的生产。
同时，通过BSFX04和BSFX022菌株的数据可以看出，BSFX04和BSFX022的产量分别是对照的1.15和2.39倍，由此可以说明减少脂酰CoA的降解对于surfactin的生产也是有利的。
实施例6考察添加支链氨基酸L-leu对枯草芽孢基因工程菌BSFX022产surfactin的影响
第一步，优化支链氨基酸L-leu添加量，向发酵培养基中添加不同浓度的L-leu，浓度分别为0mM，0.5mM，1mM，5mM，10mM，15mM，20mM，121℃，灭菌20min。向添加了不同浓度的L-leu发酵培养基中接种4％的BSFX022种子液。培养36h后，按实施例5中的分离纯化和检测方法进行检测，结果如图4所示。
从图5可以看出，添加L-leu不会影响菌株的生长，且有利于surfactin的生产。添加10mM，15mM，20mM浓度的L-leu对surfactin的产量影响几乎相同，所以从经济角度考虑，选取10mML-leu作为最适添加量。
第二步，对菌株BSFX022在不添加和添加10mM L-leu两种情况下进行生长曲线监测。将BSFX022种子培养液按4％的转接量分别转接到发酵培养基和添加了10mM L-leu的发酵培养基中，每组设置3个平行样，每隔3h进行取样检测surfactin产量和OD，结果如图6所示，不加L-leu的发酵培养结果作为对照。从图4可以看出基因工程菌BSFX022可以稳定地进行surfactin的生产，且添加L-leu可以适当的提高生物量，并且可使得surfactin的产量在原来基础上提高20.5％左右，产量在2850mg/L左右。
实施例7考察上述枯草芽孢杆菌BSFX022在不同碳源中的surfactin发酵情况
第一步：将实施例5中的发酵培养的碳源分别换为蔗糖，葡萄糖，甘油和木糖，氮源换为氯化铵和蛋白胨，考察重组菌BSFX022在不同碳源和氮源下的生长和生产情况，培养36h后，取样分析surfactin的浓度和细胞干重，结果如表1所示：
表1菌株BSFX022在不同碳源和氮源下的surfactins生长和细胞生物量(DCW)
从表1可以看出重组菌BSFX022不能很好地利用无机氮，但是，在以有机氮为碳源的情况下，重组菌BSFX022能很好地利用木糖发酵产surfactin。
进一步考察重组菌BSFX022利用不同碳源时的有机酸积累情况。将BSFX022菌株的种子液接种到以木糖为碳源，分别以氯化铵和蛋白胨为氮源的发酵培养基中，于37℃，200转速下培养，每隔4h取样，到36h为止，结果如图5所示。从图5可以看出当以木糖为碳源时，有机酸的积累很少；当以蔗糖，葡萄糖和甘油为碳源时，乳酸和乙酸的积累量分别为557-823mg/L和302-512mg/L，而木糖为碳源时的乳酸积累量只有88mg/L。
实施例8考察上述枯草芽孢杆菌BSFX022在无磷酸缓冲体系中的surfactin生产情况
无磷酸缓冲体系是将发酵培养基中的磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠10g/L替换为0.5g/L的磷酸氢二钠。发酵到48h结束，24h和48小时取样测定DCW，surfactin浓度和pH。结果如表2所示：
表2在无缓冲体系下的细胞干重，surfactin产量和pH情况
可以看出在不加磷酸缓冲条件下，以蔗糖、葡萄糖和甘油为碳源时，由于pH的严重下降，不能很好地维持surfactin的生产(<100mg/L左右)；而以木糖为碳源时，却依然可以很好地进行surfactin生产，产量可达到2074mg/L。
实施例9考察利用廉价废弃物玉米芯水解液为碳源和味精废液为氮源时的surfactin生产情况
在无缓冲发酵体系中，将碳氮源分别替换为富含木糖的玉米芯水解液和富含氨基酸的味精废液。玉米芯总糖浓度为20g/L，包含以下组份(g/L)：木糖，13.62±0.31；葡萄糖，1.24±0.11；阿拉伯糖，4.92±0.29；甘油，0.27±0.07和乙酸，4.45±0.47。以玉米芯水解液和味精废液为碳氮源的发酵结果如图6所示，从图中可以看出以味精废液为单一氮源时，surfactin产量并不理想；但是，在此基础上添加1g/L的蛋白胨后，surfactin的产量可以达到2032mg/L，大大地节约了生产成本。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一株产surfactin基因工程菌及其构建方法和应用
<130> xb19092501
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctacaa catctcttgc ttctgctttc tgctctatga aagctgttat gcttgctcgt 60
gatggccgtg gcatgaaacc tcgttcttct gatcttcaac ttcgtgctgg caacgctcct 120
acatctctta aaatgatcaa cggcacaaaa ttctcttaca cagaatctct taaacgtctt 180
cctgattggt ctatgctttt cgctgttatc acaacaatct tctctgctgc tgaaaaacaa 240
tggacaaacc ttgaatggaa acctaaacct aaacttcctc aacttcttga tgatcatttc 300
ggccttcatg gccttgtttt ccgtcgtaca ttcgctatcc gttcttacga agttggccct 360
gatcgttcta catctatcct tgctgttatg aaccatatgc aagaagctac acttaaccat 420
gctaaatctg ttggcatcct tggcgatggc ttcggcacaa cacttgaaat gtctaaacgt 480
gatcttatgt gggttgttcg tcgtacacat gttgctgttg aacgttaccc tacatggggc 540
gatacagttg aagttgaatg ctggatcggc gcttctggca acaacggcat gcgtcgtgat 600
ttccttgttc gtgattgcaa aacaggcgaa atccttacac gttgcacatc tctttctgtt 660
cttatgaaca cacgtacacg tcgtctttct acaatccctg atgaagttcg tggcgaaatc 720
ggccctgctt tcatcgataa cgttgctgtt aaagatgatg aaatcaaaaa acttcaaaaa 780
cttaacgatt ctacagctga ttacatccaa ggcggcctta cacctcgttg gaacgatctt 840
gatgttaatc aacatgttaa taaccttaaa tacgttgctt gggttttcga aacagttcct 900
gattctatct tcgaatctca tcatatctct tctttcacac ttgaataccg tcgtgaatgc 960
acacgtgatt ctgttcttcg ttctcttaca acagtttctg gcggctcttc tgaagctggc 1020
cttgtttgcg atcatcttct tcaacttgaa ggcggctctg aagttcttcg tgctcgtaca 1080
gaatggcgtc ctaaacttac agattctttc cgtggcatct ctgttatccc tgctgaacct 1140
cgtgtttaa 1149
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgccgcc gccggggctg 120
tttgcgttct tgccgtgatt tcgtgtacca ttggtttact tatttttttg ccaaggctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

Claims (10)

1.一株产surfactin基因工程菌，其特征在于，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BSFX022，保藏编号为CCTCC NO：M 2019254。
2.权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将含有P43启动子和编码磷酸泛酰巯基转移酶的sfp基因整合到出发菌株B.subtilis168的sfp位点得到重组菌，记作BSFX01；
将加州月桂Umbellularia californica的酰基载体蛋白硫酯酶编码基因bte置于启动子P43的调控下，P43-bte整合到重组菌BSFX01中，得到重组菌，记作BSFX02；
向所述重组菌BSFX02中引入在启动子P43调控下的来自贝莱斯芽孢杆菌BS-37的脂酰CoA连接酶编码基因yhfl，即P43-yhfl，得到重组菌BSFX021；
在重组菌BSFX021中敲除基因fadE，得到重组菌BSFX022。
3.权利要求1所述基因工程菌在发酵产surfactin中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括：
种子培养：将菌株BSFX022在种子培养基中培养；
发酵培养：将种子培养的培养液接种至发酵培养基进行发酵培养；
分离纯化：取发酵培养的发酵液离心后，取上清液加入无水乙醇，离心分离。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述种子培养基成分为蛋白胨10g/L，酵母粉提取物5g/L，氯化钠10g/L。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基组分为：碳源20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L；
所述碳源为蔗糖、葡萄糖、甘油或木糖；优选木糖。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养体系为无磷酸缓冲体系。
8.根据权利要求4或7所述的应用，其特征在于，发酵培养基组分为：碳源20g/L，氮源5g/L，磷酸氢二钠0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L；
所述碳源为木糖或含木糖的玉米芯水解液；所述氮源为蛋白胨，或味精废液和蛋白胨复合氮源。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在发酵培养基中添加支链氨基酸L-leu。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，支链氨基酸L-leu添加浓度为0～20mM；优选10～20mM。
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