CN112481180A

CN112481180A - 强化nC14-surfactin组分的基因工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN112481180A
Application number: CN202011390286.0A
Authority: CN
Inventors: 李霜; 胡仿香; 余定华; 黄和
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN112481180B

Abstract

本发明涉及强化nC₁₄‑surfactin组分的基因工程菌及其构建方法和应用，所述基因工程菌分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BSFX026，保藏编号：CCTCC NO：M 2020727。所述菌株发酵产物surfactin中nC₁₄组分高，且发酵液中乙偶姻积累少，具有更好的ex‑situ MEOR应用潜力。

Description

强化nC14-surfactin组分的基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一株强化nC₁₄-surfactin组分的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

微生物采油技术(MEOR)由于绿色、环保及可降解等优点被越来越广泛地应用于原油开采领域。MEOR根据操作方式的不同，可分为原位和非原位两类。在非原位微生物采油技术(ex-situ MEOR)体系中，将地面发酵获得的高浓度驱油功能产物如生物表活剂、生物聚合物等作为采油助剂注入油层提高采收率。相比原位微生物采油技术(in-situ MEOR)，ex-situ MEOR技术应用了高产菌株并使其在人工优化的发酵体系中快速生长代谢，获得了更高浓度的生物表面活性剂等功能产物，可在较短的时间内获得更高的效率。在所报道的生物表面活性剂中，脂肽类表活剂——生物表面活性素surfactin被证明是最具油田应用潜力的生物表面活性剂之一。

Surafctin是由芽胞菌属产生的一种次级代谢产物，是迄今报道的表面活性最强的表面活性剂种类之一，可以在1×10^-5mol/L(10mg/L)浓度下将水的表面张力由72mN/m降低到27mN/m。Surfactin具有耐高温121℃、耐高矿化度10⁵mg/L、pH适应范围宽泛、超低的CMC值和超高的界面活性等优点，多项研究已表明surfactin提取物在强化采油应用方面具有较好的前景。目前通过基因工程的手段，工程菌株的surfactin的产量已经达到了10-20g/L，产量不再是限制surfactin工业化应用的因素。但是，生物表活剂surfactin在ex-situ MEOR中的应用，与其在日化产品领域应用的最大区别在于：为降低成本，surfactin产物是以未进行分离提取的发酵液或者与水的混配液直接注入油藏。已有的surfactin用于驱油增效性能的研究案例中，研究对象均为发酵液中经过分离提取的surfactin产物而不是发酵液体系。因此，基于ex-situ MEOR应用角度，我们有必要重点关注surfactin的两个显著特点：surfactin的结构多样性和surfactin发酵体系的产物多样性。

针对surfactin自身是多种结构的混合产物这一特性，应该更专注于研究surfactin结构对于其功能活性的影响，使得surfactin更好地应用于微生物采油领域(MEOR)。Surfactin的结构主要是由13-15个碳原子链长的脂酰基和7个氨基酸组成的肽段(L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu)连接而成。肽段部分结构的研究表明，位置1、3、5和6上的Glu，Leu，Asp和Leu通常是保守的，而且位置2、4和7上的氨基酸是可替换的。而脂酰基部分由于枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis对于支链型脂肪酸的偏爱性，使得支链脂肪酸构型在surfactin的脂酰基结构中占主要成分。目前报道脂酰基的构型主要包含iso,anteiso和straight(n)三种构型，其中链长为C₁₄和C₁₅的组份占比最多。这种脂肪酸链及肽段上氨基酸的可变性使得surfactin产生了很多同系物(variants)或异构体(isoforms)。脂酰基的结构与surfactin的功能活性密切相关，Youssef等分析了8种surfactin异构体的表面活性与脂酰基结构的关系，结果表明脂酰基结构的差异可以显著影响surfactin的比表面活性，iso-奇数脂酰基异构体比n-偶数脂酰基异构体具有更高的排油圈活力；牟伯中团队研究发现随着surfactin脂酰基链长(C₁₂-C₁₆)的增加，CMC值更低，表面/界面活性加强，更有助于胶束的形成，溶液中趋向于形成更大的聚集体。

Surfactin发酵体系的产物多样性体现在，surfactin发酵体系对底物的转化率都很低，即使在各种高产工程菌株的发酵体系中，产物surfactin对底物碳源的转化率也仅为10-20％左右。通过对surfactin合成途径中的主要前体合成模块(脂酰基前体、支链氨基酸前体)做了进一步分析可以发现surfactin的前体合成与细胞初级代谢中的2,3-丁二醇代谢途径及有机酸代谢途径(乙酸、乳酸)相关联，从而构成了初级代谢/次级代谢的核心代谢网络。

目前，针对surfactin的结构组份改造策略已有报道。在发酵体系中外源添加支链氨基酸已被证实可以显著改变surfactin产物的结构组分分布，如向培养基中添加L-Val可以增加C₁₄和C₁₆-surfactin组分，而添加L-Leu和L-Ile可以增加C₁₃和C₁₅-surfactin组分。此外通过基因工程的手段敲除支链氨基酸合成和降解调控基因cody和lpdv也表明可以影响surafctin的组份分布，Coutte等发现在敲除了负责支链氨基酸最后一步降解的基因lpdV后，直链C₁₄-surfactin的比例提高了2.5倍。

本发明在已报导的结构组份改造策略基础上提出了一种强化直链nC₁₄-surfactin组份的新策略。通过在已报道专利菌株基础上，再次强化表达一个来源于植物加州月桂Umbellularia californica中的偏爱中链长C₁₄酰基的-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶BTE，使其增加一个拷贝从而使得nC₁₄-surfactin的占比提高了6.4倍。进一步分析它的表界面活性、乳化活性、润湿性及油砂洗涤能力发现，具有更多nC₁₄-surfactin的产物具有更好的乳化能、润湿性及具有更好的驱油应用潜力。我们对surfactin发酵体系中的其他共产物进行了分析，发现乙偶姻和2,3-丁二醇的积累量可以达到将近30g/L；进一步分析了两种主要共产物对surfactin清洗油砂能力、乳化能力及润湿性等驱油性能评价参数的影响，发现乙偶姻会大大地抑制surfactin的驱油活性。在此基础上，我们获得了减少乙偶姻积累的有效办法，通过启动子替换策略强化表达了乙偶姻脱氢酶编码基因，使得发酵体系中乙偶姻的积累量从18.2g/L下降到了3g/L左右，并进一步分析了发酵液的生物活性发现，降低乙偶姻含量后的surfactin发酵液的乳化活性、洗油能力及润湿性等驱油参数得到显著改善。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株强化nC14-surfactin组分的基因工程菌。

所述产surfactin基因工程菌分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSFX026，保藏编号：CCTCC NO：M 2020727。

所述基因工程菌所产surfactin产物中nC₁₄-surfactin组分占比55～60％。

本发明的第二目的是提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明的上述强化nC₁₄-surfactin组分的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

敲除菌株BSFX022中的pps和pks基因簇，得到重组菌，记作BSFX024；所述菌株BSFX022保藏编号为CCTCC NO：M 2019254；

在原有基础上，将硫酯酶BTE蛋白编码bte基因增加一个拷贝，将其置于强启动子P_veg的调控下整合在BSFX024菌株的乙酸激酶编码基因ackA位点上，得到重组菌，记作BSFX025；

在BSFX025菌株中，用不含RBS的强启动子P_veg替换乙偶姻脱氢酶的编码基因acoABCL的原始启动子P_aco，获取重组菌，即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSFX026。

本发明的第三目的是提供上述基因工程菌在产nC₁₄-surfactin中的应用。

包括：种子培养：将菌株BSFX026在种子培养基中培养；

发酵培养：将种子培养的培养液接种至发酵培养基进行发酵培养；

分离纯化：将发酵培养的发酵液离心后，取上清液加入无水乙醇，离心分离。

本发明在实施例中应用了特定成分的发酵培养基，培养基成分影响surfactin产量，但不影响产物surfactin的结构组分。

所述种子培养基成分为蛋白胨10g/L，酵母粉提取物5g/L，氯化钠10g/L。

所述发酵培养基组分为：蔗糖60g/L，蛋白胨10g/L，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L。

本发明的第四目的在于提供利用基因工程菌发酵获取的产物surfactin。本发明的基因工程菌获取的产物surfactin中，nC₁₄-surfactin组分占比55～60％。

本发明的第五目的在于提供所述基因工程菌在MEOR中的应用。

本发明基于ex-situ MEOR应用角度，对surfactin的结构及发酵液体系进行了分析。首先，从改变surfactin的脂酰基结构组份的角度，以B.subtilis 168衍生菌株BSFX022为出发菌株，敲除pps和pks基因簇，得到菌株BSFX024，之后将来源于植物加州月桂Umbellularia californica中的偏爱中链长C₁₄的酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶BTE的编码基因bte在原有基础上增加一个拷贝，将其在启动子P_veg的控制下整合入BSFX024的染色体上，获得了一株高产nC₁₄-surfactin的枯草芽孢杆菌基因工程菌株BSFX025；并进一步分析了发酵液体系中的主要代谢共产物，找出了对驱油应用具有抑制作用的代谢共产物乙偶姻，通过替换P_veg启动子来强化乙偶姻脱氢酶acoABCL，减少了发酵液中乙偶姻的积累，获得了重组菌株BSFX026。并通过油砂清洗实验、乳化实验及接触角实验，证明了降低乙偶姻含量的BSFX026菌株发酵液具有更好的ex-situ MEOR应用潜力。

附图说明

图1菌株BSFX022和BSFX025的细胞生长和surfactin积累情况。

图2菌株BSFX022和BSFX025发酵所得的两种surfactin的HPLC图比较。

图3surfactin粗提物中包含的几种组份的HPLC-MS图。

图4菌株BSFX022和BSFX025的surfactin样品提取质荷比为233时的GC-MS离子流图。

图5surfactin的脂酰基经过衍生化后各组分的质谱图。

图6两种surfactin粗提物的临界胶束浓度曲线。

图7两种surfactin粗提物的乳化活性测定图。

图8两种surfactin粗提物对油膜的浸润性分析。

图9两种surfactin粗提物的油砂清洗效率。

图10菌株BSFX025发酵液中的共产物定量分析。

图11乙偶姻及2，3-丁二醇对200mg/L surfactin乳化活性的影响(柴油为有机相)。

图12乙偶姻及2，3-丁二醇对200mg/L surfactin润湿活性的影响(原油油膜)。

图13乙偶姻及2，3-丁二醇对200mg/L surfactin清洗油砂效率的影响。

图14启动子强度验证结果。

图15菌株BSFX026的发酵结果。

图16菌株BSFX026发酵液的乳化能力。

图17菌株BSFX026发酵液的润湿能力。

本发明所述的生物材料，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BSFX026，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2020727，保藏时间：2020年11月12日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

菌株BSFX022已在申请人在先申请的专利CN110551671A中公开，保藏编号为CCTCCNO：M 2019254。

乙偶姻脱氢酶的编码基因acoABCL的GenBank登录号NP_388687.1，NP_388688.1，NP_388689.1，NP_388690.1。

基因敲除与插入方法为反向筛选标记法，之前已有报道。

重组基因的获得

加州月桂树(Umbellularia Californica)的酰基载体蛋白硫酯酶(acyl-acylcarrier protein(ACP)thioesterase)编码基因bte是从NCBI数据库中获得(Accession:Q41635.1)，经过密码子优化后由泓迅生物科技有限公司合成，基因全序列已在先申请的专利CN110551671A中公开。与先前专利不同的是，本发明中强化了该基因的表达，将bte基因在强启动子P_veg的调控下整合在枯草芽孢杆菌168基因组ackA基因位点，使其在基因组上增多一个拷贝。P_veg的基因全序列为SEQ ID NO：1。枯草芽孢杆菌168基因组上的基因簇pps和pks的敲除方法为反向筛选标记法。

PCR扩增：95℃预变性3min，95℃变性15s，Tm退火15s，72℃延伸30s/1kb，30个循环后72℃延伸5min。

扩增体系：

ddH₂0：20μL

高保真酶混合物：25μL

引物1：2μL

引物2：2μL

模板：1μL

枯草芽孢杆菌感受态制备和转化方法

根据GM I-GM II法制备枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备并进行转化，转化后涂布相应的抗性平板筛选重组枯草芽孢杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR进行验证，接着送测序公司测序验证。

发酵液中Surfactin产物检测

取1mL发酵液在转速12000rpm，离心5min。然后取300μL上清加入1200μL分析纯乙醇混合均匀与后12000rpm，离心5min后取后上清过膜后用于HPLC检测。在214nm波长下，以0.8mL/min的流速，流动相为90％(v/v)甲醇用岛津LC-20，Venusil XBP C18-P(4.6×150mm,5μm)s色谱柱进行检测。

发酵液中共产物的检测

取1mL发酵液在转速12000rpm，离心5min。然后取300μL上清加入1200μL水混合均匀与后12000rpm，离心5min取后上清过膜后用于HPLC检测。然后在示差检测器下以0.6mL/min的流速，流动相为5mM的硫酸，用岛津LC-20，HPX-87H column(Bio-Rad,USA)色谱柱进行检测。

实施例1枯草芽孢杆菌BSFX024和BSFX025菌株的构建

第一步：按反向筛选标记法，构建敲除打靶片段△pps’和△pks’。基于同源重组原理，通过如下引物构建打靶片段pps’和pks’，将pps’片段转化入BSFX022的感受态中，得到重组菌株BSFX023；紧接着将pks基因敲除片段pks’转化入菌株BSFX023的感受态中，得到重组菌株BSFX024；然后，将P_veg-bte片段整合在ackA基因位点，通过bte系列引物重叠PCR融合出bte基因的插入片段bte’，并将重叠片段bte’转入菌株BSFX024，得到重组菌株BSFX025。

pps-LF-F:TTTATTTGAAAGGGAAAGGCGATCC

pps-LF-R:AATGGCCTCTGTCCGCTAATCCGCTCGGATTCCCTCCAGTTCTCATAATA

pps-DR-F:TATTATGAGAACTGGAGGGAATCCGAGCGGATTAGCGGACAGAGGCCATT

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pks-LF-F:AGCGTATGTGATGCCAAGTATGGAG

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bte-RF-F:AAATAACAGATTAAAAAAATTATAA ATGTCCAAAATTATTGCAATTAACG

bte-RF-R:TGTTTTCACCGATACCGGCAGTAAA

实施例2枯草芽孢基因工程菌BSFX022和BSFX025菌株生产surfactin的效果

种子培养基和发酵培养基组份：

种子培养基组份为：蛋白胨10g/L，酵母粉提取物5g/L，氯化钠10g/L。

发酵培养基组份为：蔗糖60g/L，蛋白胨10g/L，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾3g/L，磷酸氢二钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.02g/L。

以枯草芽孢基因工程菌BSFX022和BSFX025生产surfactin步骤：

(1)种子培养基：在250mL锥形瓶中加入50mL种子培养基，于121，℃高温灭菌20min。冷却后挑取BSFX022和BSFX025单菌落于种子培养基中，37，℃200rpm，培养12h。

(2)发酵培养：在在250mL锥形瓶中加入50mL发酵培养基，于121，℃高温灭菌20min。冷却后按2％(v/v)的接种量将上述(1)在的BSFX022，BSFX025种子液转接到发酵培养基中，37℃，200rpm，培养36h。

(3)surfactin产物的分析检测：每隔4h取的1mL发酵液样品后，在转速12000rpm下离心5min。取上清液300μL加入到1500μL的无水乙醇中，混匀后，12000rpm，离心5min，取上清为待检测样品。利用高效液相色谱岛津LC-20，在214nm波长下，以0.8mL/min的流速，流动相为90％(v/v)甲醇，10％水，Venusil XBP C18-P(4.6×150mm,5μm)色谱柱进行检测。

(4)细胞干重(DCW)测定：取1mL发酵液稀释12倍，用分光光度计测在波长600下的生物量，记作OD600。

根据图1可以看出，BSFX025菌株的surfactin产量在24h达到了最高为4.21g/L，生产速率为0.175g/L/h，而对照菌株BSFX022菌株的最高surfactin积累量在36h达到最高3.15g/L，生产速率为0.088g/L/h。过表达bte基因的菌株BSFX025的生长量要低于BSFX022菌株。

实施例3鉴定菌株BSFX022和BSFX025所产surfactin粗提物的HPLC及HPLC-MS图谱

首先粗提取BSFX022和BSFX025菌株中的surfactin，提取步骤为：

第一步，进行surfactin粗提：将发酵液在8000r/min条件下离心10min，获得上清液；然后使用6mol/L的HCl调节上清液pH为2.0，在4℃条件下静置过夜。将静置液体在8000r/min条件下离心10min，收集沉淀。使用11mol/L的NaOH调节沉淀物pH为7.0，然后将沉淀物冷冻干燥获得黄色疏松固体。将该黄色固体放在甲醇中，充分抽提；然后将抽提液在40℃条件下，真空旋转干燥，获得surfactin粗产物。

根据bte基因的功能，我们推测过表达bte基因可能会生产脂酰基链长为12或14的surfactin。图2为从菌株BSFX022和BSFX025发酵液中提取的surfactin粗提物的HPLC检测图谱，从中可以看出菌株BSFX022和菌株BSFX025的surfactin产物的结构组份差异显著。紧接着通过HPLC-MS鉴定出了样品中不同组份的质谱图(图3)，对每个分子量可能代表的结构组份进行了推测如表1所示；其中，3，5，6，7组份的结构是比较明确的。结合HPLC和HPLC-MS可以明显看出，过表达bte的菌株BSFX025在第6位置的组份比例发生明显地提高，该位置为C₁₄-surfactin组份。

表1图3所示几种surfactin组分的结构分析表

实施例4鉴定菌株BSFX022和BSFX025所产surfactin粗提物的脂酰基结构

按照华东理工大学牟伯中老师团队的方法：

第一步，进行酸水解。称取从BSFX022和BSFX025菌株中提取的surfactin粗品各10mg加入6mol/L的HCl，密封后在90℃下水解20h；

第二步，进行脂肪酸衍生化。将水解后的样品，在常温下空气泵吹去残留溶剂，并在真空干燥箱中，60℃下干燥2h。然后向样品中加入0.5ml的乙腈-BSTFA(3；2,v/v)溶液后，并于60℃下反应20min。将衍生化好的溶液过0.22μm的有机滤膜，装入待测样品瓶中。

第三步，进行GC-MS分析。将待测样品分析条件为：使用的是6890-5975气相色谱/质谱联用仪(美国Agilent公司)，配以HP-5MS石英毛细管柱(美国Agilent公司)，尺寸是30m×0.25mm×0.25μm，5％苯基甲基硅氧烷。气相色谱条件：进样口温度250，℃载气为高纯度氦气(99.999％)，流速1.0mL/min，分流比20∶1，进样量1.0μL；升温程序：初始温度60，℃维持3min，以10℃/min的速度升温至250，℃维持5min；质谱条件：EI离子源，电离电压70eV，离子源温度230，℃四极杆温度150。℃

图4为提取质荷比为(m/z＝233)233处的总离子流图。BSTFA与surfactin样品中的脂肪酸组份反应，该部分是由具有不同碳原子的β-羟基脂肪酸组成，BSTFA用–Si(CH₃)₃(三甲基甲硅烷基)取代了活性氢。每个质谱图中的特征质荷比为233，表明存在–[CHO(Si(CH₃)₃)CH₂COOSi(CH₃)₃]⁺的结构，并用–Si(CH₃)取代了一个氢和一个甲基–[CH(OH)CH₂COOCH₃]⁺(m/z＝103)，它是β-羟基脂肪酸的特征性碎片离子。从离子流图可以看出，第4位置所代表的脂肪酸组分占比发生明显改变，进一步通过MS分析了每个位置代表的脂肪酸结构如图5所示，其中各峰分别为isoC₁₃、anteisoC₁₃、isoC₁₄、nC₁₄、isoC₁₅和anteisoC₁₅。紧接着计算了各组分所占比例进行了汇总如表2所示，从表中可以明确看出BSFX025所得surfactin粗提物中nC₁₄组分相比于BSFX022菌株提高了将近7倍左右，说明过表达bte基因可以有效地提高surfactin中nC₁₄组份的比例。

表2 surfactin脂酰基中不同结构组份的占比

由于不同发酵批次存在一定差异，我们分析了BSFX025不同发酵批次的surfactin产物，不同批次surfactin粗提物nC₁₄组分稳定在55％以上，基本在55-60％范围内。

实施例5比较两种surfactin粗提物的临界胶束浓度(CMC)

Surfactin样品的临界胶束浓度检测使用表面张力法。随着表面活性剂浓度的增加，表面张力下降的速率会在一定浓度时出现明显下降，该浓度即为临界胶束浓度。用去离子水配制不同浓度(0-100mg/L)的surfactin样品溶液，使用表面张力仪测量在25℃条件下，测量各样品水溶液表面张力，获得临界胶束浓度CMC。两种菌株(BSFX022和BSFX025)发酵所产的surfactin粗提取物的CMC值如图6所示，相比较之下，BSFX025菌株所产的含更多的nC₁₄组分的surfactin产物具有更低的表面张力和CMC值。

实施例6比较两种surfactin粗提物的乳化能力差异性

考察200mg/L的两种surfactin粗提物对几种烷烃(正辛烷、十二烷、十四烷、十六烷、十八烷)、二甲苯、液体石蜡和柴油的乳化能力。取2mL的两种200mg/L的surfactin粗提物分别加入2mL以上几种物质中，在振荡混匀仪的最大转速下混合2min后静置12h，观察两种粗提物的乳化能力，如图7所示。菌株BSFX025所产的含更多nC₁₄组份的surfactin粗提物对十二烷、十四烷、十六烷、十八烷、二甲苯和液体石蜡的乳化能力明显要强于对照菌株BSFX022所产的surfactin粗提物。

实施例7比较两种surfactin粗提物的润湿性

首先，制作油膜。将沾3原油稀释涂布在玻璃载玻片上，放在70℃下固化7d。

然后，进行接触角测定。将两种surfactin粗提物稀释成0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L和0.2g/L后，用接触角测定仪(DropMeter A100P宁波海曙迈时检测科技有限公司)吸取定量的不同浓度的surfactin溶液加入到做好的油膜上，通过接触角在线分析软件分析两种粗提物在不同溶度下的接触角大小。从图8可以看出，在较低浓度下，BSFX025菌株所产的surfactin粗提物的接触角更小，表明含有更多nC₁₄组分的surfactin产物具有更好的润湿性，亲油效果更好。

实施例8比较两种surfactin粗提物的油砂清洗能力

第一步，制作油砂。油砂制作方法参考胜利石油管理局企业标准中的油层清洗剂通用条件。

第二步，清洗油砂。称取2g的油砂装入50mL的锥形瓶中，并加入20mL的水。将不同浓度的2种粗品溶液加入装有油砂的锥形瓶中，使得surfactin浓度为0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L和0.2g/L的浓度梯度。在90rpm，70℃条件下清洗12h。

第三步，计算清洗效率。将洗脱在水相中的油用石油醚进行提取，并在吸光度225nm下用玻璃比色皿计算吸光度，带入含油量标准曲线，计算含油量。将残留的沙子放在70℃下烘干。计算公式为：油砂清洗效率＝(油砂总含量-清洗后残留原油量)/油砂总含油量×100％。结果如图9所示。在较低浓度下，nC₁₄组份比例多的surfactin油砂清洗效率要高于对照的surfactin。这进一步说明nC₁₄组份比例多时，更利于MEOR应用。

实施例9分析surfactin发酵液体系中的共产物

先将BSFX025单菌落接入种子培养基LB中，于37℃，200rpm条件下培养12h。以2％的接种量将种子培养基接到发酵培养基中，于37，℃200rpm条件下培养36h后，取样进行共产物组分分析。结果如图10所示，在这些初级代谢产物体系中，乙偶姻和2，3-丁二醇的量占据主体，共累计达到30g/L左右，这也是导致surfactin转化率低下的原因。

实施例10分析乙偶姻和2，3-丁二醇对surfactin的MEOR应用活性的影响

主要考察不同浓度(0、0.2、0.5、0.8、1及1.5g/L)的乙偶姻和2，3-丁二醇对200mg/L surfactin的柴油乳化能力、润湿性及油砂清洗能力的影响。乳化活性、润湿性及油砂清洗效率测定，如实施案例6，7，8所述，实验结果分别为图11、12和13所示。

从图11可以看出，乙偶姻大大地影响了200mg/L surfactin对柴油的乳化能力，而2，3-丁二醇对surfactin的乳化活性影响不大。从图12可以进一步看出，2，3-丁二醇和乙偶姻对接触角都有影响，但是2，3-丁二醇对surfactin接触角的影响明显小于乙偶姻对surfactin接触角的影响。随着乙偶姻浓度的增加，接触角从θ小于90°变成了大于90°，说明乙偶姻使得surfactin在油膜上从亲油的状态变为亲水的状态。从洗油效果(图13)可以进一步看出，乙偶姻相比于2，3-丁二醇会大大地抑制surfactin的油砂清洗能力，使得清洗效率从93.8％下降到了21.3％，这就意味着当发酵液中存在高浓度乙偶姻时，会严重影响surfactin在MEOR中的应用。

实施例11验证乙偶姻脱氢酶启动子强度

以绿色荧光蛋白sfGFP为报告基因，检测sfGFP在几种不同启动P_veg、P₄₃及P_aco调控下的荧光强度来验证启动子的强度。将sfGFP在三个启动子的调控下整合到枯草168基因组的解淀粉amyE位点，通过引物amyE-up-F/amyE-up-R扩增出上游up,Te-F/Te-R扩增出四环抗性Te,P_veg-F/P_veg-R扩增出P_veg启动子，P_aco-F/P_aco-R扩增出acoABCL的原始启动子P_aco,P₄₃-F/P₄₃-R扩增启动子P₄₃，amyE-down-R/amyE-down-F扩增出解淀粉酶基因的下游，然后通过重叠PCR重叠出up-Te-P_aco-sfGFP-down、up-Te-P_veg-sfGFP-down和up-Te-P₄₃-sfGFP-down三个片段，并将这3个片段转化进枯草168菌株感受态中，得到菌株168(P_aco-sfGFP)、168(P₄₃-sfGFP)和168(P_veg-sfGFP)。随后，将3株重组菌接入LB培养基中培养12h后，取1mL发酵液在8000rpm转速下离心10min，去除上清，用去离子水清洗菌泥3次并稀释到相同的OD₆₀₀。之后，立即用多功能酶标仪(Spectra Max M3)测试样品，并将枯草芽孢杆菌168用作对照。激发波长和发射波长分别为485nm和525nm，每组样品测试3次取平均值。结果如图14所示，可以发现乙偶姻脱氢酶编码基因的原始启动子P_aco表达强度比较弱，P_veg启动子的表达强度是原始启动子P_aco表达强度的10倍左右。

amyE-up-F:AACCCGACATCCGGCGTTCTCATGG

amyE-up-R:ACAACAATATGGCCCGTTTGTTGAATCTTGACACTCCTTATTTGATTTTT

Te-F:AAAAATCAAATAAGGAGTGTCAAGATTCAACAAACGGGCCATATTGTTGT

Te-R:TTAGAAATCCCTTTGAGAATGTTTA

sfGFP-F:ATGTCAAAAGGAGAAGAACTTTTTA

sfGFP-R:CGGTAAGTCCCGTCTAGCCTTGCCCTTATTTATAAAGTTCGTCCATACCG

amyE-down-R:AAGGGCAAGGCTAGACGGGACTTACCG

amyE-down-F:ACACCGATGTACACGTCATCTGCAC

P_veg-F:TAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAA GATCTATCTTACACAGCATCACACT

P_veg-R:TAAAAAGTTCTTCTCCTTTTGACAT TACATTTATTGTACAACACGAGCCC

P_aco-F:TAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAA AAAGATTTCCAAGGAAATAAATACG

P_aco-R:TAAAAAGTTCTTCTCCTTTTGACAT TTTGTGCGCCTCCTTCTATTTAGGG

P₄₃-F:TAAACATTCTCAAAGGGATTTCTAAGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAAC

P₄₃-R:TAAAAAGTTCTTCTCCTTTTGACAT GTGTACATTCCTCTCTTACCTATAAT

实施例12减少发酵液中乙偶姻的积累，构建菌株BSFX026

将无RBS的P_veg启动子替换乙偶姻脱氢酶acoABCL原来的启动子P_aco，RBS为acoABCL基因前面自带的RBS(AATAGAAGGAGGCGCACAAA)，通过同源重组策略将其转化入BSFX025的感受态中得到重组菌株BSFX026，其中P_aco的基因全序列如SEQ ID NO：2所示。采用实施例2中的步骤发酵验证36h重组菌株的surfactin生产情况及乙偶姻含量。从图15中可以看出，替换乙偶姻脱氢酶acoABCL原来的启动子P_aco后的菌株BSFX026菌株的surfactin生产能力相比于对照菌株BSFX025在36h略有提高，乙偶姻的积累量有大幅度的下降，从18.02g/L下降到了3.2g/L。

up-F:GAATTCCTGGCCGCTATCATCATACAAAGGC

up-R:ACAACAATATGGCCCGTTTGTTGAATTAACTTCCTAGTTCCTCTGCATCG

Te-F:TTCAACAAACGGGCCATATTGTTGT

Te-R:AGTGTGATGCTGTGTAAGATAGATCTTAGAAATCCCTTTGAGAATGTTTA

P_veg-F:GATCTATCTTACACAGCATCACACT

P_veg-R:TACATTTATTGTACAACACGAGCCC

down-F:GGGCTCGTGTTGTACAATAAATGTA AATAGAAGGAGGCGCACAAAATGAA

down-R:GCTTATTAGCATCTGTTTCTTTTAA

实施例13验证菌株BSFX026发酵液的MEOR应用评价参数

考虑到在实际的MEOR驱油应用中，为降低成本省略surfactin产物的分离提取步骤，直接使用发酵液作为功能产物。将菌株BSFX026和对照菌株BSFX025的发酵液稀释到surfactin浓度相同0.2g/L、0.15g/L、0.1g/L、0.05g/L及0.01g/L，两种发酵液的乙偶姻含量不同。紧接着验证两种菌株的发酵液对柴油的乳化能力，对油膜的润湿性及油砂的清洗能力。从图16可以看出，乙偶姻含量少的BSFX026发酵液的乳化能力更好；从图17可以看出，当两种发酵液中surfactin浓度相同时，乙偶姻含量少的BSFX026发酵液对油膜的接触角要明显更小；从表3可以看出，当surfactin浓度一致时，乙偶姻含量少的BSFX026发酵液的油砂清洗能力也要强于乙偶姻含量多的BSFX025发酵液。

表3菌株BSFX026与BSFX025发酵液的油砂清洗效率比较

BSFX026和BSFX025菌株本身生长性能相同，发酵目的产物surfactin组分一致，产物surfactin化合物的表面张力和CMC值等物化性质也相同，此处不再赘述。但在BSFX026菌株中对乙偶姻进行了进一步代谢，降低了乙偶姻含量后，使得发酵液体系的驱油效果有了显著改善，而上述评价参数进一步验证了，乙偶姻积累量少的菌株BSFX026在MEOR上更有应用潜力。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 强化nC14-surfactin组分的基因工程菌及其构建方法和应用

<130> xb20120201

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatctatctt acacagcatc acactggctc accttcgggt gggcctttct gcgtttatat 60

actagagaga gaatataaaa agccagatta ttaatccggc ttttttatta tttaggcaac 120

tgaaacgatt cggatcctgt attactattc ttaaattttg tcaaaataat tttattgaca 180

acgtcttatt aacgttgata ccggttaaat tttatttgac aaaaatgggc tcgtgttgta 240

caataaatgt agattaacta ataaggagga caaac 275

<210> 2

<211> 211

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaagatttcc aaggaaataa atacgtcgat cattgtcaaa ggccgggtga tatccggtct 60

tttttttgca tgctgtaaaa cgagacaaat gaatcagttt gagacaaaac gagacacacg 120

tctcaaactg tctccaaagt gaagatgaga agactgattt tacgggctca aaagactggc 180

acacttcttg catttataat ggtgaaccct a 211

Claims

1.一株强化nC₁₄-surfactin组分的基因工程菌，其特征在于，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BSFX026，保藏编号：CCTCC NO：M 2020727。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌所产surfactin产物中nC₁₄-surfactin组分占比55~60%。

3.一种强化nC₁₄-surfactin组分的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：

敲除菌株BSFX022中的pps和pks基因簇，得到重组菌，记作BSFX024；所述菌株BSFX022保藏编号为CCTCC NO：M 2019254；

强化硫酯酶BTE蛋白编码bte基因的表达，将其置于强启动子P_veg的调控下整合在BSFX024菌株的乙酸激酶编码基因ackA位点上，得到重组菌，记作BSFX025；

在BSFX025菌株中，用不含RBS的强启动子P_veg替换乙偶姻脱氢酶的编码基因acoABCL的原始启动子P_aco，获取重组菌，即枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BSFX026。

4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述强启动子P_veg序列如SEQ ID NO：1所示。

5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述原始启动子P_aco序列如SEQ ID NO：2所示。

6.权利要求1所述基因工程菌在产nC₁₄-surfactin中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

种子培养：将菌株BSFX026在种子培养基中培养；

8.利用权利要求1所述基因工程菌发酵获取的产物surfactin。

9.根据权利要求8所述的产物surfactin，其特征在于，nC₁₄-surfactin组分占比55~60%。

10.权利要求1所述基因工程菌在MEOR中的应用。