CN113564183A

CN113564183A - 一种通过过表达基因psrA提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的方法

Info

Publication number: CN113564183A
Application number: CN202110800395.3A
Authority: CN
Inventors: 饶志明; 潘学玮; 杨套伟; 尤甲甲; 徐美娟; 张显; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-07-15
Filing date: 2021-07-15
Publication date: 2021-10-29

Abstract

本发明公开了一种通过过表达基因psrA提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明通过在粘质沙雷氏菌中过表达LysR家族转录调控因子PsrA编码基因BVG90_12635(psrA)，显著提高了粘质沙雷氏菌合成灵菌红素能力；将利用本发明的方法制备得到的重组粘质沙雷氏菌在发酵培养基中发酵72h产灵菌红素发现，重组菌株发酵产灵菌红素能力较野生型菌株JNB5‑1相比，提高了33.58％。

Description

一种通过过表达基因psrA提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的方法

技术领域

本发明涉及一种通过过表达基因psrA提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

灵菌红素(Prodigiosin，PG)，一类由微生物产生的次级代谢产物，具有抗细菌、抗痢疾、抗肿瘤和免疫抑制等多种生物活性，在医药开发、环境治理和染料制备等领域具有巨大的应用价值。当前，灵菌红素的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法等2种方法。由于化学合成法合成灵菌红素存在反应步骤多和产率低等缺点，难以实现灵菌红素的大规模生产。而微生物发酵法生产灵菌红素具有环境友好、条件温和、成本低和易于工业化生产等优势，因此，近年来微生物发酵法生产灵菌红素已成为国内外研究热点。

然而，现有的生物法仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，Lee等人通过将Zooshikella ganghwensis KCTC 12044T接种至Marine broth 2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达15.40mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,et al.(2011).Exceptional production ofbothprodigiosin and cycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novelmarine bacterium,Zooshikella rubidus S1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967-4973.)；Lee等人通过将Hahella chejuensis KCTC 2396T接种至Marine broth 2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28.10mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,et al.(2011).Exceptional production ofboth prodigiosin andcycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novel marine bacterium,Zooshikella rubidus S1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967-4973.1)。

因此，急需找到一株可高产灵菌红素的微生物以克服上述缺陷。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的方法；所述方法是在粘质沙雷氏菌中过表达LysR家族转录调控因子BVG90_12635(PsrA)。

在本发明的一种实施方式中，所述LysR家族转录调控因子PsrA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将psrA基因整合至载体中得到重组质粒，而后将重组质粒转入粘质沙雷氏菌中得到重组菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述psrA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌包括粘质沙雷氏菌JNB5-1。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pUCP18。

本发明第二个目的是提供一株高效合成灵菌红素的重组菌株。

在本发明的一种实施方式中，在粘质沙雷氏菌中过表达LysR家族转录调控因子BVG90_12635(PsrA)。

在本发明的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌包括粘质沙雷氏菌野生型菌株JNB5-1。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pUCP18。

本发明第三个目的是提供一种生产灵菌红素的方法，所述方法为先将上述重组菌株接种至发酵培养基中进行培养，获得发酵液，然后从发酵液中提取获得灵菌红素。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体步骤为：将重组菌株接种至LB液体培养基培养获得OD₆₀₀＝0.4～0.8菌液，将菌液接种至发酵培养基中于28-32℃，160-200rpm培养获得发酵液，收集发酵液并用酸性乙醇作用6-10h测定菌株生产灵菌红素的量。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的组成为：蔗糖1.5～2.5％、牛肉膏1.0～2.0％、CaCl₂0.75～1.25％、L-脯氨酸0.5～1.0％和MgSO₄·7H₂O 0.0025～0.0035％，pH 7.0。

本发明的第四个目的是所述提高灵菌红素合成的方法或所述重组菌株在生产灵菌红素或生产含有灵菌红素产品中的应用。

本发明的第五个目的是所述提高灵菌红素合成的方法或所述重组菌株在医药开发、环境治理和染料制备等领域。

有益效果：

1、本发明通过在粘质沙雷氏菌中过表达psrA基因，得到了灵菌红素合成能力显著提高的重组粘质沙雷氏菌；将本发明的重组粘质沙雷氏菌在发酵培养基中进行72h发酵，最终灵菌红素产量可达7.12g/L，较野生型菌株提高了33.58％。

2、利用本发明的方法提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素能力效果好，且不会对粘质沙雷氏菌本身的生长性能造成任何的影响，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1:重组质粒pUCP18-PsrA构建成功的PCR验证结果。

图2:粘质沙雷氏菌野生型菌株JNB5-1和psrA基因过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA灵菌红素合成能力分析。

图3:粘质沙雷氏菌野生型菌株JNB5-1和psrA基因过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA生长能力分析。

具体实施方式

下述实施例中涉及的pUCP18质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌JNB5-1购自北纳生物，产品编号为BNCC336646。

同源重组试剂盒购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

发酵培养基：蔗糖2％、牛肉膏1.5％、CaCl₂1％、L-脯氨酸0.75％和MgSO₄·7H₂O0.03％，pH7.0。

LB液体培养基：NaCl 10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L。

实施例1：psrA基因过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA的构建

根据粘质沙雷氏菌JNB5-1转录调控因子PsrA编码基因psrA的核苷酸序列(如SEQID NO.2所示)，以粘质沙雷氏菌JNB5-1基因组DNA为模板，以PsrA-F和PsrA-R为引物，进行PCR扩增，扩增得到DNA片段PsrA；将该DNA片段与使用BamHI和HindIII内切酶线性化的pUCP18质粒进行同源重组后化转入大肠杆菌JM109菌株中，经菌落PCR验证后得到重组质粒pUCP18-PsrA(PCR验证结果见图1)；该重组质粒经电转转移至粘质沙雷氏菌JNB5-1中，得到psrA基因过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA。本发明中所用到的引物序列如表1所示。

表1引物序列

PCR反应体系如下：

表2突变PCR反应体系

PCR反应条件为：98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火5s和72℃延伸90s，共30个循环。

实施例2：psrA过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA发酵产灵菌红素能力分析

将过夜培养的野生型菌株JNB5-1和实施例1构建的psrA基因过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA接种于液体LB培养基中，30℃、180rpm培养获得对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，而后以4％(v/v)的接种量接种于50mL发酵培养基中，30℃、180rpm，在接种后的0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h和108h收集菌体，收集后的菌体经pH 3.0的酸性乙醇静置作用8h后，使用分光光度计测定A₅₃₄下的波长，并根据公式Y＝1.1936X-0.001(Y表示A₅₃₄下测定得到的吸光值、X表示灵菌红素产量)得到各时间点各菌株合成灵菌红素的量(图2)，分析过表达基因psrA对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响。

结果如图2所示，通过测定psrA基因过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA发酵产灵菌红素的能力发现，菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA(7.12g/L)较出发菌株JNB5-1(5.33g/L)相比，其合成灵菌红素最高产量提高了33.58％，说明过表达基因psrA可显著提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素能力。

实施例3：野生型菌株JNB5-1及psrA过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA生长能力分析

将过夜培养的野生型菌株JNB5-1和实施例1构建的psrA基因过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA接种于液体LB培养基中，30℃、180rpm培养获得对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.6)的菌液，而后以4％(v/v)的接种量接种于50mL发酵培养基中，30℃、180rpm，在接种后的0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h收集菌体，使用分光光度计测定A₆₀₀下的波长，最终绘制得到菌株JNB5-1和JNB5-1/pUCP18-PsrA的生长曲线。结果如图3所示，相比于野生型菌株JNB5-1，psrA过表达菌株JNB5-1/pUCP18-PsrA生长未发生明显的变化，说明过表达基因psrA对菌株的生长无显著影响。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种通过过表达基因psrA提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的方法

<130> BAA210097A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Val Asn Phe Asp Leu Asn Asp Leu Tyr Ala Phe Arg Ala Leu

1 5 10 15

Val Glu Tyr Gly Asn Phe Arg Leu Ala Ala Glu Ser Ile Cys Leu Ser

20 25 30

Gln Ser Ala Leu Ser Arg Arg Ile Glu Lys Leu Glu Asn Ala Leu Gly

35 40 45

Ile Lys Leu Phe Asp Arg Thr Thr Arg Arg Val Thr Leu Thr Leu Tyr

50 55 60

Gly Gln Ala Phe Ala Glu Arg Ser Glu Gln Leu Leu Met Asn Val Glu

65 70 75 80

Ala Val Met Ala Asp Ile Asp Lys Val Ser Gln Glu Arg Val Gly Leu

85 90 95

Val Thr Val Ala Thr Val Pro Ser Ala Ala Tyr Tyr Phe Met Pro Asp

100 105 110

Val Ile Arg Arg Phe Arg Leu Arg Tyr Pro Arg Val Arg Val Lys Leu

115 120 125

Ile Asp Gly Ser Ala Gly Asn Val Ile Glu Ala Val Thr Gly Gly Gln

130 135 140

Ala Asp Phe Gly Ile Cys Phe Ala Gly Arg Leu Gln Pro Asn Leu Glu

145 150 155 160

Phe Val Pro Leu Val Gly Asp Val Tyr Val Ala Ala Cys Arg Arg Asp

165 170 175

His Pro Leu Ala Gly Lys Lys Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe Tyr Gln

180 185 190

Gln Asp Tyr Val Ser Leu Asp Lys Thr Ser Gly Asn Arg Asn Leu Leu

195 200 205

Asp Gln Arg Leu Glu His Leu Val Pro Glu Arg Ser Ser Val Cys Glu

210 215 220

Thr Arg His Val Thr Thr Met Leu Gly Met Val Glu Ala Gly Ile Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ala Val Pro Ala Met Ser Met Pro Ala Ser Glu His Ser Val

245 250 255

Leu Thr Ser Val Ser Leu Val Asp Pro Val Val Lys Arg Thr Val Gly

260 265 270

Leu Ile Arg Arg Arg Gly Arg Met Gln Ser Phe Val Ala Ala Glu Leu

275 280 285

Glu Lys Leu Ile Thr Glu Gln Tyr His Ser Ala

290 295

<210> 2

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcccgtaa attttgatct caacgatctc tatgcgtttc gcgcgctggt ggagtacggc 60

aattttcggc tggccgcaga gtctatctgc ttgtcgcagt cggcattgag ccgcaggatt 120

gagaaactgg aaaacgcgct gggcatcaaa ctgttcgatc gcaccacccg gcgcgtgacc 180

ttgacgctgt acgggcaggc ctttgccgaa cgttcggagc agttgctgat gaacgtcgaa 240

gcagtgatgg ccgatatcga taaggtcagt caagagcggg tggggctggt taccgtcgcc 300

acggtgccct cggcggccta ctatttcatg cccgacgtga tacggcgttt ccggctgcgc 360

tatccgcgcg tgcgcgtcaa gctgatcgac ggcagcgcag gcaatgtgat tgaggcggtc 420

accggcggcc aggccgattt cggcatctgc tttgccgggc ggctgcagcc taatcttgaa 480

tttgtgccgc tggtggggga cgtctacgtg gccgcctgcc gacgtgacca tccgctcgcc 540

ggtaaaaaga gcctcacctg gcgggaattt tatcagcagg attacgtctc gctggataaa 600

acctccggca atcgcaatct gctcgatcag cgcctggaac acctcgtgcc ggaacgctcc 660

agcgtgtgtg aaactcgcca tgtgacaacc atgctgggca tggttgaggc gggcatcggc 720

attgccgccg tgcccgccat gtcgatgccc gcttcagaac attcggtgtt gacgtcggtg 780

tcgctggttg atccggtggt gaaacgcacc gtcggtctga tccggcgccg cggccgcatg 840

cagtctttcg tcgccgccga gctggaaaag ctgattactg aacagtatca ctctgcctga 900

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcgagctcg gtacccgggg atccatgccc gtaaattttg atctcaacga t 51

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaacgacgg ccagtgccaa gctttcaggc agagtgatac tgttcagtaa tcag 54

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcttccggct cgtatgttgt g 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caaggcgatt aagttgggta acgc 24

Claims

1.一种提高粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的方法，其特征在于，在粘质沙雷氏菌中过表达LysR家族转录调控因子PsrA；所述LysR家族转录调控因子PsrA的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达是将psrA基因整合至载体中得到重组质粒，而后将该重组质粒转入粘质沙雷氏菌中得到重组菌株。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述psrA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌包括粘质沙雷氏菌野生型菌株JNB5-1。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体包括pUCP18。

6.一株高效合成灵菌红素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是在粘质沙雷氏菌中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的LysR家族转录调控因子PsrA。

7.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求6所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行培养，获得发酵液，然后从发酵液中提取获得灵菌红素。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法具体步骤为：将权利要求6所述的重组菌株接种至培养基中培养获得OD₆₀₀＝0.4～0.8菌液，将菌液接种至发酵培养基中于28-32℃，160-200rpm条件下发酵培养获得发酵液，收集发酵液并用酸性乙醇作用6-10h测定菌株生产灵菌红素的量。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基成分为蔗糖1.5～2.5％、牛肉膏1.0～2.0％、CaCl₂ 0.75～1.25％、L-脯氨酸0.5～1.0％和MgSO₄·7H₂O 0.0025～0.0035％。

10.权利要求1-5任一所述方法或权利要求6所述菌株在生产灵菌红素或生产含有灵菌红素产品中的应用。