CN111621458A - Bvg90_11450基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了BVG90_11450基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌，属于生物技术领域。本发明提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔBVG90_11450，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔBVG90_11450是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5‑1中编码转录调控因子BVG90_11450的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5‑1ΔBVG90_11450接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达68.68mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5‑1的1.35倍。

Description

BVG90_11450基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌

技术领域

本发明涉及BVG90_11450基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌，属于生物技术领域。

背景技术

灵菌红素(Prodigiosin，正式名称为2-methyl-3-pentyl-6-methoxyprodiginine)是Prodiginin的一种，可由沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、河氏菌属(Hahella)、弧菌属(Vibrio)和海洋新细菌(Zooshikellarubidus)等合成。它具有Prodiginin的基本结构，也就是三吡咯环，其中的一个吡咯环C2上带有一个甲基，另一个吡咯环C3上则有一个戊基。

研究发现，灵菌红素具有多种生物活性，包括：抗细菌、抗痢疾、抗肿瘤和免疫抑制等(具体可见参考文献：Yip CH,Yarkoni O,Ajioka J,Wan KL,Nathan S.2019.Recentadvancements in high-level synthesis of the promising clinical drug,prodigiosin.Appl Microbiol Biotechnol 103:1667–1680.)，因此，灵菌红素在医药开发等领域均具有巨大的应用价值。

目前，生产灵菌红素的方法主要有化学合成法和微生物发酵法。其中，化学合成法主要是通过串联共轭加成及高温脱氢的方法获得灵菌红素。但是，由于途径复杂且困难、产率低下，化学合成法难以实现大规模工业化生产。微生物发酵法则主要是通过微生物发酵获得灵菌红素。与化学合成法相比，微生物发酵法具有工艺相对简单、环境友好、条件温和和成本低等的优势。

然而，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，其中，产量不高是阻碍微生物发酵法工业化进程最主要的缺陷。例如，Lee等人通过将Zooshikella ganghwensis KCTC 12044^T接种至Marine broth 2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达15.40mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,et al.(2011).Exceptional production of bothprodigiosin and cycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novelmarine bacterium,Zooshikella rubidus S1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967-4973.)；Lee等人通过将Hahella chejuensis KCTC 2396^T接种至Marine broth 2216培养基中进行发酵以生产灵菌红素，但是，使用此方法发酵24h，仅可使发酵液中灵菌红素的产量达28.10mg/L(具体可见参考文献：Lee,J.S.,Kim,Y.S.,Park,S.,Kim,J.,Kang,S.J.,Lee,M.H.,et al.(2011).Exceptional production of both prodigiosin andcycloprodigiosin as major metabolic constituents by a novel marine bacterium,Zooshikella rubidus S1-1.Appl.Environ.Microbiol.77,4967-4973.1)。

因此，急需找到一株可高产灵菌红素的微生物以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一株粘质沙雷氏菌工程菌，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为宿主敲除编码转录调控因子BVG90_11450的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述转录调控因子BVG90_11450的氨基酸序列如SEQID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码转录调控因子BVG90_11450的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。

本发明还提供了一种生产灵菌红素的方法，所述方法为将上述粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28～30℃、转速为150～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为LB液体培养基；所述LB液体培养基的成分包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

本发明还提供了上述粘质沙雷氏菌工程菌或上述方法在生产灵菌红素中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一株可高产灵菌红素的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450，此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450是通过敲除粘质沙雷氏菌JNB5-1中编码转录调控因子BVG90_11450的基因获得的，将此粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450接种至LB液体培养基中发酵24h，即可使发酵液中灵菌红素的产量高达68.68mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的1.35倍。

附图说明

图1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450的菌落PCR验证结果；其中，DNAMarker(2000bp)，1为以粘质沙雷氏菌JNB5-1基因组为模板的PCR结果，2为以粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450基因组为模板的PCR结果。

图2：粘质沙雷氏菌JNB5-1、粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450、粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840、粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_24040和粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_20160发酵生产灵菌红素的产量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1购自唯地生物公司；下述实施例中涉及的pUTmini质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JNB5-1记载于文献“徐虹,徐美娟,杨套伟,等.温度对粘质沙雷氏菌合成灵菌红素的影响[J].微生物学报,2014,54(5):517-524.”中，并且，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放此菌株。

下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L。

牛膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂20g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

灵菌红素含量的测定：以酸性乙醇为空白对照，取发酵液溶解到酸性乙醇(pH3.0)中，得到样品；将样品做适度的稀释(50、250、1000倍)，得到稀释样品；将稀释样品密封放置8h(充分溶解灵菌红素)后12000r·min^-1离心10min，取上清；测定上清的A₅₃₅的值，根据标准曲线Y＝1.1936X-0.001计算得到发酵液中灵菌红素的含量；标准曲线Y＝1.1936X-0.001中，Y代表A₅₃₅值，X代表灵菌红素产量，单位mg/100mL。

实施例1：粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450的构建

具体步骤如下：

以粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组为模板，分别以11450-D-U-F/11450-D-U-R(SEQID NO:3和SEQ ID NO:4)和11450-D-D-F/11450-D-D-R(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)为引物，通过PCR扩增获得DNA片段BVG90_11450-U(SEQ ID NO:7)和DNA片段BVG90_11450-D(SEQID NO:8)；合成aacC3抗性基因(SEQ ID NO:9)；通过重叠延伸PCR将DNA片段BVG90_11450-U、DNA片段BVG90_11450-D与aacC3抗性基因依次相连，得到DNA片段BVG90_11450-AacC3；将DNA片段BVG90_11450-AacC3与经Kpn I酶切后的线性化pUTmini质粒经同源重组后进行连接，得到重组质粒pUTmini-BVG90_11450；重组质粒pUTmini-BVG90_11450转化大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1，得到转化产物1；将转化产物1涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1硫酸铵普霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子1；挑取转化子1接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_11450；将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_11450和粘质沙雷氏菌JNB5-1分别接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养16h，得到培养液；将培养液离心取菌体；将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_11450和粘质沙雷氏菌JNB5-1共同接种至牛膏蛋白胨固体培养基上进行共培养，通过接合转移的方式将大肠杆菌工程菌S17-1/pUTmini-BVG90_11450中的重组质粒pUTmini-BVG90_11450转化至粘质沙雷氏菌JNB5-1中，得到转化产物2；将转化产物2涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1安普霉素和50μg·mL^-1克林霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养12～24h，得到转化子2；挑取转化子2接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h稳定遗传三代，得到培养液；提取培养液中转化子2的基因组DNA和粘质沙雷氏菌JNB5-1的基因组DNA，以11450-YZ-F/11450-YZ-R(SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11)为引物，通过PCR扩增单菌落中编码转录调控因子BVG90_11450的基因BVG90_11450，扩增成功即获得粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450(PCR验证结果将图1)。

参照与构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450同样的方法，构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840、JNB5-1ΔBVG90_24040和JNB5-1ΔBVG90_20160；

其中，构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840所用的引物为03840-D-U-F/03840-D-U-R(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13)和03840-D-D-F/03840-D-D-R(SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15)；构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840所用的DNA片段为BVG90_03840-U和BVG90_03840-D(SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)；

构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_24040所用的引物为24040-D-U-F/24040-D-U-R(SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19)和24040-D-D-F/24040-D-D-R(SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21)；构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_24040所用的DNA片段为BVG90_24040-U和BVG90_24040-D(SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23)；

构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_20160所用的引物为20160-D-U-F/20160-D-U-R(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25)和20160-D-D-F/20160-D-D-R(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)；构建粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_20160所用的DNA片段为BVG90_20160-U和BVG90_24040-U(SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29)。

实施例2：灵菌红素的生产

具体步骤如下：

以粘质沙雷氏菌JNB5-1为对照，分别挑取实施例1获得的粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450、JNB5-1ΔBVG90_03840、JNB5-1ΔBVG90_24040和JNB5-1ΔBVG90_20160的单菌落接种至LB液体培养基(含有50μg·mL^-1安普霉素和50μg·mL^-1克林霉素)中，于37℃、180rpm的条件下振荡培养至对数生长期初期(OD₆₀₀＝0.6)，得到种子液；将种子液以4％(v/v)接种量接种至LB液体培养基中，于30℃、180rpm的条件下发酵24h，获得发酵液。

发酵过程中，间隔2h检测发酵液中灵菌红素的含量(检测结果见图2)，结果表明：发酵24h时，粘质沙雷氏菌JNB5-1发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为51.01mg/L，粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_11450发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量为68.68mg/L，是野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的1.35倍，而粘质沙雷氏菌工程菌JNB5-1ΔBVG90_03840、JNB5-1ΔBVG90_24040和JNB5-1ΔBVG90_20160发酵获得的发酵液中灵菌红素的产量分别仅有49.45mg/L、50.16mg/L和51.81mg/L，分别为野生型粘质沙雷氏菌JNB5-1的0.97倍、0.98倍和1.02倍。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> BVG90_11450基因缺失的粘质沙雷氏菌工程菌

<160> 29

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 100

<212> PRT

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 1

Met Ser Lys Ile Leu Ala Glu Ile His Gln Glu Val Gln Gly Leu His

1 5 10 15

Arg Ala Gly Phe Val Asp Asp Val Thr Met Arg Thr Phe Asp Met Leu

20 25 30

Cys Leu Arg Pro Val Lys Gln Phe Gly Pro Ala Glu Ile Arg Ala Leu

35 40 45

Arg Glu Arg Glu Asn Val Ser Gln Pro Val Phe Ala Leu Tyr Leu Asn

50 55 60

Val Ser Lys Lys Ala Val Gln Lys Trp Glu Arg Gly Glu Ala Gln Pro

65 70 75 80

Asn Ser Ala Ala Met Lys Leu Leu Thr Leu Val Glu Arg Asn Gly Leu

85 90 95

Gln Ile Leu Ala

100

<210> 2

<211> 303

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 2

atgagtaaaa ttcttgccga gatccaccag gaagttcagg gcctgcaccg cgccggtttc 60

gtcgacgacg tgaccatgcg caccttcgac atgctgtgcc tgcggccggt gaagcagttc 120

gggccggccg agatccgcgc gctgcgcgaa cgggaaaacg tcagtcagcc ggtgtttgcg 180

ctgtatctca acgtcagcaa aaaggcggtg cagaaatggg agcgcggcga agcgcaaccg 240

aactccgccg cgatgaagct gctgacgctg gtggaacgca acggcctgca aattctggcc 300

tga 303

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taggccgaat tcgagctcgg taccttaaga ctttgcgcca ggctg 45

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cgcttagcct ccgtaactcc 60

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga gcctgcaaat tctggcctga 60

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

attacagccg gatccccggg taccccaacc tggagatcaa cgacga 46

<210> 7

<211> 1040

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 7

gctcaacggc gtgctggagg aagagcacga cttgctgtgc tccggccagt tgccgggcgt 60

ggccttgcag cgcgtcaccg atgccaaaag ccaactgctg gcgacggtcg cttacctcga 120

gcaacagcgc ctggggcagg aaaaaacctg cgggcaacgc gccccctatg ccagccaagc 180

gcccctggcc gatcgttggc agcgcgttca gttgctgagc caaacgctgc gcgaaaagaa 240

ccagcacaac ggtctgctgc tcaatcagca gatcgaccat aacgcgcagg cgctggccat 300

cctcagcaaa aacaacaaat cgctgtatgg cccagatggc cagtcgcacg ccggcagcct 360

gctcggcaga aaaatcggcg tctgacctga ctcatttcgc ccggtgagcc tatcaccggg 420

cgcgcgttaa ccggcttctg cgcatcccct cgcattttct ccctatcact ctttgaattc 480

acttaagact ttgcgccagg ctgcgcatgg cgtgaatttg gctgtttctt tccctttggc 540

cgcttgtcac cctgtggtta tttttaaacc acttgaaata tacccttaac gggtatagat 600

tcgcagggag agcgaatggt cgacatttat ctcaccaaaa cctttcaggg ttttgccgca 660

cgcgagcgca tcagtgatgc cacgatagtg aaagcggcgc gagagatgca acatcagctg 720

tacgacgcca atcttggcgg ttgcgtatac aaaaagcgca tcgctcgggc tggtgcgggc 780

aaacgtggcg gctatcgggt actgatcgtt tttcgcgatg aagaacgcct gttttttatg 840

cgcggctttg ccaaaagtga gagagaaaac atcagtacgg atgagttaca gggattgaaa 900

catctggctg cgctgtatct ggattattcg ccattcagac tctaccagct ggtcaacaac 960

agggagttac ggaggctaag cgatgagtaa aattcttgcc cgcggaaccc ctatttgttt 1020

atttttctaa atacattcaa 1040

<210> 8

<211> 1040

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 8

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga gggccggccg agatccgcgc 60

gctgcgcgaa cgggaaaacg tcagtcagcc ggtgtttgcg ctgtatctca acgtcagcaa 120

aaaggcggtg cagaaatggg agcgcggcga agcgcaaccg aactccgccg cgatgaagct 180

gctgacgctg gtggaacgca acggcctgca aattctggcc tgatgttact gataattgac 240

gatcacctga ttgccaatca ccctcagcgg cgggttcaac ccgccttgcg actgcacgta 300

gtagacaaaa cgcaattccg cattggccgg ctcgccctgc agaccgttgc tgctgccgct 360

gccgccgccc agcggaatgc agcggttcac cgtgcagagc tgcgcctgca gccccaccgg 420

ttcaggcccc agcaagcggt agcgccaact gacgctggtg atgcgcgcat gggcatccgg 480

cagcgcgttc ggcggccgca aaccggcgga ttcatcgcgc atcccgccct gttccagcgt 540

gacccccgcc ccttcggcca cccaggagcc ggacaccgcg ccggcggcta gcggcgccag 600

caaacacaac aaggacagac agcgtttcat caggcggctc caatggtcga ggtcatgcga 660

atctggcgat cgtcgttgat ctccaggttg gacagcacca cgagctgcgg caggctgcga 720

cgcaggaagc gcgccagtaa aggacgcagc gcatggttaa ccaacagcac cggcggcgcg 780

ctgagcatct cttgccgttg tagcgcctga cgcgcctgct ccaacaggcg atcggccagc 840

cccggctcca gaccaccgcc gccctgcaac gcctgcagca acaggcgctc cagttgagta 900

tccaagccga taacctgaat ctcgccgttg cccgggaacc actgctgcgt gatcgcccgg 960

cccagggcca cccgcaccac ggtggtcaat tcgtaaggat cgctctgcgc cggggcatgt 1020

tccgccagcg tttcgacgat 1040

<210> 9

<211> 909

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgtc atcagcggtg 120

gagtgcaatg tcgtgcaata cgaatggcga aaagccgagc tcatcggtca gcttctcaac 180

cttggggtta cccccggcgg tgtgctgctg gtccacagct ccttccgtag cgtccggccc 240

ctcgaagatg ggccacttgg actgatcgag gccctgcgtg ctgcgctggg tccgggaggg 300

acgctcgtca tgccctcgtg gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg 360

cccgttacac cggaccttgg agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag 420

cgcagcgccc atccatttgc ctttgcggca gcggggccac aggcagagca gatcatctct 480

gatccattgc ccctgccacc tcactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc 540

gatgggcagg tacttctcct cggcgtggga cacgatgcca acacgacgct gcatcttgcc 600

gagttgatgg caaaggttcc ctatggggtg ccgagacact gcaccattct tcaggatggc 660

aagttggtac gcgtcgatta tctcgagaat gaccactgct gtgagcgctt tgccttggcg 720

gacaggtggc tcaaggagaa gagccttcag aaggaaggtc cagtcggtca tgcctttgct 780

cggttgatcc gctcccgcga cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg 840

ttgatcttcc tgcatccgcc agaggcggga tgcgaagaat gcgatgccgc tcgccagtcg 900

attggctga 909

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcagtccaa gtggcccatc ttc 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaccagcac aacggtctgc tg 22

<210> 12

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taggccgaat tcgagctcgg taccgcaact gctgttgctg accg 44

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg aacctcaggt cggcagtctc 60

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga gttttccggc tgtcggccg 59

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

attacagccg gatccccggg tacccggtgg ccaacatgca gaaa 44

<210> 16

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 16

taggccgaat tcgagctcgg taccgcaact gctgttgctg accgtggcgg tgctggtggt 60

gtccgccggc agcctggcgc acagcgcctg gatcaacctg gcgggcatcg cgctttcgct 120

ggtgctgatg gcctggctga tgaagcgtga agcgcacgcg cgcgcccgcc tgttgccgca 180

tggcgcattg cggcgcggct catcgctggc ggcgttgtac atcacgaccg cgttgctggt 240

gatcggcatg accagcgaaa tcttcgtgcc ctatttcctg cagctgctgc acggtcagtc 300

gccgctgatc tccggctata tcgccgccgc catggccgcc ggctggacgc tgtccgagat 360

cctcagctcc ggctggcgtg gggcgggcat tcgccgggcg atcgtcagcg ggccgctgtt 420

tgtgctggta ggcctgctgg cactggcgat cctgatgccg acgccgtccg gcggccactg 480

gcaggcgctg gcgccgatcg tcattgcgct attgctggtg ggattcggca tcggcttcgg 540

ttggccgcac ctgctgacgc gcattttgca ggtggcgcct gaagcggaca aagatatcgc 600

cggcgcttca attaccacgg tgcagctgtt cgccaccgca ttcggcgcgg cgctggccgg 660

gatgatcgtc aatctggcgg ggctgaacga tccgggcggc gcgacgggcg cggcatcggc 720

ggcgcgttgg ctgttcctgg cgttcgcgct ggcgccgctg ctggcggtat tcagcgcctg 780

gcgctgcgcg gcgatcgcgc cgccgggggc cgaaacggga aattttgtac aaaccccgcc 840

ctcgcgcgag agctagaacg cttctcctca cctggtgatg ttcgcggtga tccaggcgtt 900

attcctgcgc gacattttaa aatccgcttg ctatatctct aatttgagat tatttctctt 960

atatgggatt tttaagcgga gtatgaacga tggataacgg tttggagact gccgacctga 1020

ggttcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaa 1064

<210> 17

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 17

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga gttttccggc tgtcggccgg 60

cgactgcctg cgctaccgcc tgttcggcgc ctcccgtttc catgtccccg gcgatgagcc 120

ggcccattac accctcgtta tctgcaggcc atagccatga ttgaattgca acagtgggac 180

gccgacgcgg cgcaaagcgc cattgccgac ttggccgaga tgctgcacgc cagcgtggcg 240

cacggcgcca gcatcggttt tgtcatgccc tttacgcagg aacaggcgca ggcattttgg 300

caggggttgc tgccggccat cgcgcgggga gagcgtgcga tgctggtggc gctcgcgaac 360

ggccggccgg tcggcaccgt gcaactgtta ctggcgatgc cggacaacgg ccgccaccgc 420

gcggaagtgg tcaagctgat ggtgcacccg caggcgcggc ggcagggcgt cgcccggttg 480

ttgatgcaag aagtgcaggc gctggcggcg cgtcattgcc gcagcctgtt ggtgctggat 540

actctgagcg gcagcgcggc gcaggggctg taccgtcaat tggggttcga ggcggcgggc 600

gacatcccgc aatacgcccg cgccagcgac ggcggggcgt tggaggccac ctgctatatg 660

tacaaactgc tgtgaggctt agcgcccgcg ccaggccttg atcgcctgtt ggcgcacctg 720

cagcttctgt tgcggcgtca gcttgttgta gtcgcgagcc aggccgcttt cccaatcgcc 780

gtacagcggg ttgggcagca cgatgaattc ggtgccgaac ttgccctgat tctcgctgac 840

gaacgcccgg cgctgcgcat tgtcctggtg gtaagtcgcg gcgccgaagt cgttcaggtt 900

gtcgcctgcg tacaccacga tgtcatagcc ggcttgtttg atggcgtcga agcgcgcctg 960

cttattggag gtatcggtgc tgagcagcac ggttttttcc gacatgccgg tgaatccgag 1020

tttctgcatg ttggccaccg ggtacccggg gatccggctg taat 1064

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

taggccgaat tcgagctcgg tacccgggca ttataacgaa gacggca 47

<210> 19

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg gacggtggcg ctggatct 58

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga atatccagac agtggcgggg 60

<210> 21

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

attacagccg gatccccggg taccccagtt gccccagggt aaaact 46

<210> 22

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 22

taggccgaat tcgagctcgg tacccgggca ttataacgaa gacggcaagc gcgactatca 60

gcgccaactg tacgccggtt tcaaggacga tcgttacggc accctgacct atggccatca 120

atacggcatc tattattcgg tggtcggcat taaaagcgac gtctgggata acgatggcca 180

tgcgggcggc accggcatcg gcatttccgg cgactatgac ggtggcaata aaccgaaaaa 240

cagcatcaaa tacaccaatg atttcgggcc ggtcacgctg tacgccaact atttattgcc 300

ggaagacgat ctgcacaccg cggataacct gatttaccgc cgcaagggcg gtggcgggct 360

gggcttcgat tataaggtga cgaaggattt caccttcagc gcggcctaca gttataccga 420

cgcgaagatc aaagacaatc tgtaccacga acaggattat caccagcagc tgtccggcac 480

cgcgttaacc tggcagccga acaactggta catcgtcggc accgccagct attacaaaga 540

ttatgtgccg agcacccgcc agcgcacgct gtcgcacttc ttcgccggtg acggctacgg 600

gctggaaggc ttcgtcggtt atacctttaa tatcgacaag ccgttcctca aatccgtcca 660

gccttatgtg gcggcggact cgctgcggct gaagggagac gaggcgtatc acgccaacca 720

cgtctatctt ggcgcgggca ccaccatcgg ttacggtctg tcggtgtatg tggagcgcac 780

gctggccaac agcagcgaca atgagccgga ttccacctgg ataacggtgt tctacgattt 840

ctgattttca cctgctccaa gccggcgctt gcgccggctt tttcacatgg tgatcgcgcc 900

gcccagggtt tctccagagg cgttgcgctc cgccaggtag cgcgccggcg gtttgcccac 960

cgcctttctg aacatggtga cgaagccgct ggcgctctcg tagcccagat ccagcgccac 1020

cgtccgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaa 1064

<210> 23

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 23

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga atatccagac agtggcgggg 60

gatctgtact ttcatgagaa tagttctcaa tttggcggaa ttgaaaagta ttatgtcctg 120

attgcgcaat gcggtctagc accggtgccg ataaagtaag cgccagtcct aaaccctttc 180

gcgaggaaac tgattatgtc attggatacc gccgattttc cgctggtgtg gatgcgccga 240

aacgggcgcg atacccaggc cgagctggcc gaattcagcg cgctgctggc gcgcgccgaa 300

ccttttgttc tgatcaccga ccgcagcgtc ggcgatgaag aagaagaaca tgaccgcgat 360

gctcgcaccc aggtggcgct gtggaaacgc gataaccgcg aggcgctgaa gcggtgggtg 420

aaaggcatga tcatgctgga gccggacgac gccaaacgcg cggcggcgga agaattcgcc 480

gaatacggcg ccaaattctg gggctatccg gtgctggtgg ccgccaatga agccgcaggc 540

cgggtattgg cgcagacgtt attgatcaaa taaggggaac accatgcacc agcaacaggt 600

gattgaacag ctgctggcct ggatcgagca gagcctggat cagccgctga cgctggacga 660

catcgccgcc aagtccggct actccaaatg gcatttgcag cggatgttca agcagcatac 720

cggccatatt ctcggcacct acgcgcgccg cagaaggctg accgccgccg cgcgtgaact 780

gcgcctgacc ggcaccagcg tggcctgcat cgccgatact taccagttcg attcgcagca 840

gaccttcacc cgttgcttcc gcaagcagtt cggtctgccg ccggccagct atcgtcgcag 900

ccaggattgg tcgagctatg gcctgcagcc gccgctgcgc ctgaccgaag cgccattgcc 960

gcaggccgat atcgtgacgc tgcccgccat gcagttggtg ggccataccc agcgccgcag 1020

ttttaccctg gggcaactgg ggtacccggg gatccggctg taat 1064

<210> 24

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

taggccgaat tcgagctcgg taccctggat gagcaggatt gccgc 45

<210> 25

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg ccatttccgc gaagtgatgt 60

cgg 63

<210> 26

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga ctcagacctc aaaggactta 60

acttagacaa a 71

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

attacagccg gatccccggg taccgttagc cagcgcaaac tgca 44

<210> 28

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 28

taggccgaat tcgagctcgg taccctggat gagcaggatt gccgccgcat ggtgaactac 60

ctggccgcac aggcgcgccc ggcccacaag caagcgcgcc tactcgagct gcgcgaagag 120

ttgcagcgcg agctgacgga cagcctgctc ggcaactggc tcaccgccgc cgatccgtac 180

gcgacccagc aacgcgccca acacctgctg cgcgcgctgc aggcgcaggc cggccgccac 240

ggcgaactgc tggaacgact gttgccccag cgcgatacgc tgcgccagct ttaccagcaa 300

cagcagcacg ccgcgccaac cccggcgacg cctgcgccgt tcgggctcga catcgatctg 360

ttcggcgcac cggaaacgcc ggcctccggc gagccccccg cgtcaccctt tgccgcgcgg 420

gtattcgcgg attggatcaa ccatctgcgc agcctgccgg acaaccgccg gttgctggat 480

ctgctcggtg tcgacaaacc gcatctcgaa ctgctggtcg atgcgttgat cggcgctgcc 540

tgccgccagc ggctcgacga cgaactggag cgcgcgctgt gcgccggcgg cctgccggaa 600

cagggagaag atcggcagat cagccaggcg ctggcgctac tgggcgactt cgtcgcctgg 660

ctcggcttcc agcggcgcga tgcggcaacg cgccccgaga gccgcgtcaa tcccggccag 720

ccgatcttta ccccgccgcc gcagccggcg gtggactgga gcggccagca gcggctcacc 780

cggctggcgc cgacgccaac caaaaatacc gcgttttata tctatgactg gctgatcggc 840

ctgcagaccc tgctggcgga aaatgccgcg caggcgcagc ccgcgctggc agacgagcag 900

cgcggcgcac tgacggcgat cgtcgccgcc ctacgcgctg tgccgtagcg ggcgcaagcc 960

gggccggaca ccgccgcgca gtcagtggca ggccggaccg gccgacatca cttcgcggaa 1020

atggcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaa 1064

<210> 29

<211> 1064

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌

<400> 29

atgcgaagaa tgcgatgccg ctcgccagtc gattggctga ctcagacctc aaaggactta 60

acttagacaa attatgtcct atcaagtcac aacttgccaa gttatcttta gcctcgtgac 120

ggggcagacg ctgtatgagc cccacaagtt tccctgaaaa gataacgtat tgaggattca 180

ccatgagcat caaaaatatt ttacccggca agatcggttt gggcggcgcg ccgctcggca 240

atatgtaccg cgccattcca gaagaagaag cgctggctac cgtaaccagc gcctgggact 300

tgggcatccg ctacttcgac accgcgccgc tttacggttc cggcctgtcg gaaattcgca 360

tgggcgaagc gctttctcaa tacccacgcg atgagttcgt actgagcact aaagtgggcc 420

gcatcatgct ggacgaaatg gaagatcccg ccgcccgcga tctgggtgag aaaggcggcc 480

tgttcgaaca cggtttgaaa aacaagatcc tgaacgacta ctcggaagac ggcacgcttc 540

gttccattga aaacagcctg aagcgcctga aaaccgaccg tctggatatc gtctggatcc 600

acgacgtcgc tcaggatttc tacggcgaca gctggctgga acagttcaat atcgcccgta 660

ccggcgcctt ccgcgcgctg tcccgcctgc gtgacgaagg cgtgatcaaa gcctggggac 720

tcggggttaa ccgcgtcgag ccttgcgagc tgacgctggc gctcgatgaa cctaaaccgg 780

atgccttctt gctggccggt cgctacagcc tgctggatca cgaacgcgcc ctgcaacgcc 840

tgatgccgga agcgctggaa cagaatgtcg atatcgtcgt cggcggccca tacagctccg 900

gcgtgctggc cggcggtgaa catttcgaat atcagaaagc gtccccggct attcgccaac 960

aagtcgcgaa aatcaaagag atcgccgctc gcttccaggt agacgtcaaa gccgctgcgc 1020

tgcagtttgc gctggctaac ggtacccggg gatccggctg taat 1064

Claims (10)

1.一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌工程菌以粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)为宿主敲除编码转录调控因子BVG90_11450的基因。

2.如权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述转录调控因子BVG90_11450的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述编码转录调控因子BVG90_11450的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一株粘质沙雷氏菌工程菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌为粘质沙雷氏菌JNB5-1。

5.一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1-4任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，获得含有灵菌红素的发酵液；将含有灵菌红素的发酵液进行分离，获得灵菌红素。

6.如权利要求5所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为28～30℃、转速为150～200rpm。

7.如权利要求5或6所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃、转速为180rpm。

8.如权利要求5-7任一所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基为LB液体培养基。

9.如权利要求8所述的一种生产灵菌红素的方法，其特征在于，所述发酵培养基为LB液体培养基；所述LB液体培养基的成分包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠。

10.权利要求1-4任一所述的粘质沙雷氏菌工程菌或权利要求5-9任一所述的方法在生产灵菌红素中的应用。

Images