CN110982773A

CN110982773A - 重组枯草芽孢杆菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用

Info

Publication number: CN110982773A
Application number: CN201911392421.2A
Authority: CN
Inventors: 杨套伟; 饶志明; 刘会灵; 刘栓英; 张显; 徐美娟; 邵明龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-10

Abstract

本发明公开了重组枯草芽孢杆菌及其在生产2,3‑丁二醇中的应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种可高产2,3‑丁二醇的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5‑P_spac‑gdh‑tdh，将此重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5‑P_spac‑gdh‑tdh接种至发酵培养基中发酵60h，即可使发酵液中2,3‑丁二醇的产量、2,3‑丁二醇的生产强度以及糖酸转化率分别高达43.15g/L、0.719g/L·h和0.43g/g，分别较野生型枯草芽孢杆菌168提高了22.5％、29.08％和30.3％。

Description

重组枯草芽孢杆菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用

技术领域

本发明涉及重组枯草芽孢杆菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

2,3-丁二醇是一种重要的四碳平台化合物，可作为合成橡胶、ABS树脂以及SBS弹性体等多种化合物的中间体，可作为一种环境友好且燃烧值(高达27200J·g^-1)可与乙醇相媲美的燃料，可作为合成乙偶姻等食品添加剂的中间体，还可作为一种抗冻剂，因此，2,3-丁二醇在化工、食品、医药、燃料及航空航天等多个领域均具有广泛的应用。

目前，生产2,3-丁二醇的方法主要有化学法和生物转化法。其中，化学法主要是通过裂解石油获得2,3-丁二醇。但是，由于对条件的要求十分苛刻(如高温高压等)，利用化学法合成2,3-丁二醇较为困难，并且，利用化学法合成2,3-丁二醇易对环境造成污染，因此，化学法至今尚未实现大规模工业化生产。

生物法则主要是通过微生物发酵获得2,3-丁二醇。与化学法相比，生物法具有环保、反应温和以及原料低廉等的优势。但是，现有的生物法也仍存在一定的缺陷，例如，现有的一些可产2,3-丁二醇的微生物的产量不高，以及，现有的一些可产2,3-丁二醇的微生物为非食品安全级微生物(例如，大肠杆菌)。

上述缺陷使得现有的生物法无法真正实现2,3-丁二醇的大规模工业化生产以及2,3-丁二醇在食品和医药等领域的大规模应用，因此，急需找到一种可高产食品级2,3-丁二醇的微生物以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种可高产食品级2,3-丁二醇的重组枯草芽孢杆菌。

[技术方案]

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主过表达编码葡萄糖脱氢酶的基因和编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述2,3-丁二醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码葡萄糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pMA5质粒、pMA0911质粒或pHP13质粒为载体过表达编码葡萄糖脱氢酶的基因和编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pMA5质粒过表达编码葡萄糖脱氢酶的基因和编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述编码葡萄糖脱氢酶的基因的上游连接有启动子P_spac。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_spac的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因位于pMA5质粒的启动子P_hpaII的下游。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_HpaII的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168。

本发明还提供了一种生产2,3-丁二醇的方法，所述方法为先将上述重组枯草芽孢杆菌接种至含有葡萄糖的培养基中，于温度为30～45℃、转速为100～50rpm的条件下进行培养，获得含有2,3-丁二醇的发酵液，然后将含有2,3-丁二醇的发酵液进行提取，获得2,3-丁二醇。

本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌或上述方法在生产2,3-丁二醇中的应用。

[有益效果]

本发明提供了一种可高产2,3-丁二醇的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh，将此重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh接种至发酵培养基中发酵60h，即可使发酵液中2,3-丁二醇的产量、2,3-丁二醇的生产强度以及糖酸转化率分别高达43.15g/L、0.719g/L·h和0.43g/g，分别较野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168提高了22.5％、29.08％和30.3％；并且，由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)属于食品安全级菌株，因此，利用以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为宿主获得的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh生产得到的2,3-丁二醇可达到食品级。

附图说明

图1：重组质粒PMA5-P_spac-gdh-tdh的质粒图谱。

图2：重组质粒PMA5-P_spac-gdh的酶切验证结果；其中，CK：Marker，lane1：重组质粒PMA5-P_spac-gdh的双酶切验证。

图3：重组质粒PMA5-P_spac-gdh-tdh的酶切验证结果；其中，Ck：Marker，lane1：重组质粒PMA5-P_spac-gdh-tdh的单酶切验证，lane2：重组质粒PMA5-P_spac-gdh-tdh的双酶切验证。

图4：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168发酵不同时间获得的发酵液中葡萄糖、2,3-丁二醇的含量以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168发酵不同时间获得的发酵液OD₆₀₀值。

图5：重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh发酵不同时间获得的发酵液中葡萄糖、2,3-丁二醇的含量以及重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh发酵不同时间获得的发酵液OD₆₀₀值。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168购自北纳生物；下述实施例中涉及的PMA5质粒购自优宝生物。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl10g/L、琼脂15g/L。

种子培养基：葡萄糖50g/L、酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L，pH6.5。

发酵培养基成分：葡萄糖100g/L、酵母浸膏5g/L、玉米浆25g/L、尿素2g/L，pH6.5。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

葡萄糖含量的测定：将发酵液离心，取上清液用水稀释适当倍数，使用生物传感分析仪测定发酵液中葡萄糖的含量。

2,3-丁二醇含量的测定：用高效液相色谱仪进行定量分析；

具体色谱条件为：色谱柱：糖柱×；进样量：5μL；柱温：85℃；检测器：示差折光检测器；流动相：纯水；流速：0.4mL/min。

实施例1：重组枯草芽孢杆菌的构建

化合合成(金唯智公司)编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)和启动子P_spac(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)；通过融合PCR将编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh和启动子P_spac连接，获得目的基因P_spac-gdh(编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh位于有启动子P_spac的下游)；将目的基因P_spac-gdh与PMA5质粒经限制性内切酶EcoRI酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组大肠杆菌Escherichia coli/PMA5/P_spac-gdh以及重组质粒PMA5/P_spac-gdh；

化合合成(金唯智公司)NADPH依赖的编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因tdh(核苷酸序列如SEQ ID No.4)；将NADPH依赖的编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因tdh与重组质粒PMA5/P_spac-gdh经限制性内切酶Nde I和BamH I酶切后进行连接，得到连接产物(编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因tdh位于pMA5质粒的启动子P_HpaII的下游)；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg.mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证(酶切验证结果见图2)，验证正确即获得重组大肠杆菌Escherichia coli/PMA5/P_spac-gdh-tdh以及重组质粒PMA5/P_spac-gdh-tdh；

将重组质粒PMA5/P_spac-gdh-tdh转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证(酶切验证结果见图3)，验证正确即获得重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh(上述序列均可见表1)。

表1引物及基因的核苷酸序列

实施例2：重组枯草芽孢杆菌的验证

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168为对照，挑取实施例1获得的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh的单菌落接种至10mL的LB培养基(含有100μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、180r/min的条件下振荡培养12h，得到培养液；将培养液全部转接于50mL的种子培养基中，于37℃、180r/min的条件下振荡培养12h，得到种子液；将种子液以6％(v/v)接种量接种至发酵培养基中，于37℃、300r/min的条件下发酵60h，获得发酵液。

发酵期间，每隔8～12h对发酵液进行取样，检测发酵液中葡萄糖、2,3-丁二醇的含量以及发酵液的OD₆₀₀值(检测结果见图4-5)。

由图2-3可知，将重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh接种至发酵培养基中发酵60h，即可使发酵液中2,3-丁二醇的产量、2,3-丁二醇的生产强度以及糖酸转化率分别高达43.15g/L、0.719g/L·h和0.43g/g，分别较野生型枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168提高了22.5％、29.08％和30.3％。

通过NADH/NAD和NADPH/NADP检测试剂盒(购于sigma公司)检测枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168以及重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh中NADPH和NADH的水平(检测结果见表2)。

由表2可知，重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh中NADPH的水平较枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168有了明显的上升，NADH的水平较枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168有了明显的下降。

综上所述，过表达编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh和编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因tdh后，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168胞内达到了新的以NADPH为主导的辅酶平衡，并且，此以NADPH为主导的辅酶平衡可增强枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168对2,3-丁二醇的积累。

表2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168以及重组枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis/PMA5-P_spac-gdh-tdh中NADPH和NADH的水平

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 重组枯草芽孢杆菌及其在生产2,3-丁二醇中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val

35 40 45

Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val

100 105 110

Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Ala Val Leu Trp Tyr Asp Lys Lys Asp Val Arg Val Glu Glu

1 5 10 15

Ile Glu Glu Pro Lys Val Lys Glu Asn Ala Val Lys Ile Lys Val Lys

20 25 30

Trp Cys Gly Ile Cys Gly Ser Asp Leu His Glu Tyr Leu Gly Gly Pro

35 40 45

Ile Phe Ile Pro Val Gly Thr Pro His Pro Leu Ser Lys Ser Thr Ala

50 55 60

Pro Val Val Leu Gly His Glu Phe Ser Gly Glu Val Val Glu Ile Gly

65 70 75 80

Ser Lys Val Thr Lys Phe Lys Ala Gly Asp Arg Val Ile Val Glu Pro

85 90 95

Ile Val Ala Cys Gly Lys Cys Pro Ala Cys Leu Glu Gly Lys Tyr Asn

100 105 110

Leu Cys Glu Ala Leu Gly Phe His Gly Leu Cys Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Phe Ala Glu Tyr Thr Val Phe Pro Glu Asp Phe Val His Lys Ile Pro

130 135 140

Asp Thr Met Asp Tyr Glu Gln Ala Ala Leu Val Glu Pro Met Ala Val

145 150 155 160

Ala Leu His Ser Leu Arg Val Gly Asn Phe Thr Thr Gly Asn Thr Ala

165 170 175

Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro Ile Gly Leu Ala Thr Ile Gln Cys Leu

180 185 190

Lys Ala Ser Gly Ala Arg Ile Val Ile Val Phe Gln Arg Lys Ser Val

195 200 205

Arg Gln Glu Tyr Ala Lys Lys Phe Gly Ala Asp Val Val Leu Asp Pro

210 215 220

Asn Glu Val Asp Val Ile Glu Glu Ile Lys Lys Leu Thr Gly Gly Val

225 230 235 240

Gly Val Asp Thr Ser Phe Glu Thr Thr Gly Ala Asn Val Gly Ile Asn

245 250 255

Thr Ala Ile Gln Ala Leu Lys Tyr Glu Gly Thr Ala Val Ile Thr Ser

260 265 270

Val Trp Glu Lys Asn Ala Glu Ile Asn Pro Asn Asp Leu Val Phe Thr

275 280 285

Glu Lys Lys Val Val Gly Thr Leu Ala Tyr Arg His Glu Phe Pro Ser

290 295 300

Thr Ile Ala Leu Met Asn Asp Gly Arg Ile Lys Thr Asp Gly Tyr Ile

305 310 315 320

Thr Lys Arg Ile Ala Leu Glu Asp Ile Val Lys Glu Gly Phe Glu Thr

325 330 335

Leu Thr Gly Pro Glu Lys Lys Lys His Val Lys Ile Ile Val Thr Pro

340 345 350

Asp Lys Ser Leu Leu

355

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg ggataaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540

attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600

gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660

ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720

ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acacaatatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

<210> 4

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaagctg tattgtggta tgataaaaaa gatgtaagag tagaggaaat tgaggaacct 60

aaggtaaaag aaaatgctgt aaaaattaaa gtgaaatggt gtggtatatg tggttctgac 120

ttgcatgagt atttaggagg acctatattt attccagtag gtacgccaca tcctttaagc 180

aagagtactg caccagtagt tttaggacat gagttttcag gagaagtagt agaaatagga 240

agcaaggtta caaaatttaa agcaggagat agagttattg tagaacctat agttgcctgt 300

ggaaagtgtc ctgcttgtct tgaaggaaaa tataatttat gtgaagcttt gggatttcat 360

ggactttgtg gaagcggcgg cggatttgct gaatacacag tatttcctga agattttgtc 420

cataagatac cagatactat ggactatgag caggctgcac ttgttgagcc tatggcagtt 480

gcccttcatt ctctaagagt tggaaacttt actacaggaa atactgcttt ggttttaggt 540

gcaggaccta taggacttgc aactattcag tgtttaaagg catcaggggc aagaattgta 600

attgtatttc agagaaaatc tgtaagacag gaatatgcta agaaatttgg agcagatgta 660

gttttagatc caaatgaggt agatgtaatt gaagaaatta aaaaacttac aggcggcgta 720

ggcgtggata catcttttga aacaacaggt gcaaatgtag ggattaatac ggcaattcaa 780

gctttaaaat atgaaggtac tgcggtaata accagcgtat gggagaaaaa tgcagaaatc 840

aatccaaatg atcttgtatt tacagaaaag aaggtagttg gtactcttgc ctacagacat 900

gaatttcctt ctacaatagc acttatgaat gatggaagaa taaagacaga cggatatatt 960

acaaagagaa tagcacttga ggacattgta aaagaaggat ttgaaacact tacaggacct 1020

gaaaagaaaa aacatgtaaa aataattgta actcctgaca aatccttatt gtaa 1074

<210> 5

<211> 309

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacacagccc agtccagact attcggcact gaaattatgg gtgaagtggt caagacctca 60

ctaggcacct taaaaatagc gcaccctgaa gaagatttat ttgaggtagc ccttgcctac 120

ctagcttcca agaaagatat cctaacagca caagagcgga aagatgtttt gttctacatc 180

cagaacaacc tctgctaaaa ttcctgaaaa attttgcaaa aagttgttga ctttatctac 240

aaggtgtggc ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa ttaagcttaa ggaggtgtat 300

ctagaattc 309

<210> 6

<211> 269

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttttgagtga tcttctcaaa aaatactacc tgtcccttgc tgatttttaa acgagcacga 60

gagcaaaacc cccctttgct gaggtggcag agggcaggtt tttttgtttc ttttttctcg 120

taaaaaaaag aaaggtctta aaggttttat ggttttggtc ggcactgccg acagcctcgc 180

agagcacaca ctttatgaat ataaagtata gtgtgttata ctttacttgg aagtggttgc 240

cggaaagagc gaaaatgcct cacatttgt 269

Claims

1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主过表达编码葡萄糖脱氢酶的基因和编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。

2.如权利要求1所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1或2所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述2,3-丁二醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1-3任一所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pMA5质粒、pMA0911质粒或pHP13质粒为载体过表达编码葡萄糖脱氢酶的基因和编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。

5.如权利要求1-4任一所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌为宿主，以pMA5质粒过表达编码葡萄糖脱氢酶的基因和编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因。

6.如权利要求1-5任一所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述编码葡萄糖脱氢酶的基因的上游连接有启动子P_spac。

7.如权利要求1-6任一所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述启动子P_spac的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

8.如权利要求1-7任一所述的一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述编码2,3-丁二醇脱氢酶的基因位于pMA5质粒的启动子P_hpaII的下游。

9.一种生产2,3-丁二醇的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1-8任一所述的重组枯草芽孢杆菌接种至含有葡萄糖的的培养基中，于温度为30～45℃、转速为100～50rpm的条件下进行培养，获得含有2,3-丁二醇的发酵液，然后将含有2,3-丁二醇的发酵液进行提取，获得2,3-丁二醇。

10.权利要求1-8任一所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求9所述的方法在生产2,3-丁二醇中的应用。