CN112080479B - 一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了比酶活高的17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y和V107A/T155N/H164Y，17β‑羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y和V107A/T155N/H164Y的比酶活分别高达1.85、1.93、2.06和5.15U/mg，分别是野生型17β‑羟基类固醇脱氢酶(1.66U/mg)的1.11、1.16、1.24和3.10倍。

Description

一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
甾体类药物具有重要的生理功能，在甾体医药行业以及临床治疗上中具有不可或缺的地位，是除抗生素以外最为重要的药物。现阶段生产的甾体类药物主要的是甾体激素(类固醇激素)类药物。
宝丹酮是一种重要的甾体激素类药物，其可由睾酮衍生而来，因此，其具有睾酮的大部分性质。例如，宝丹酮与睾酮一样，可用于促进肌肉增长，提高肌肉的耐力与恢复能力。并且，与睾酮相比，宝丹酮芳烃率更低，转化为雌激素的可能较低。因此，宝丹酮在医疗上可用于治疗肌肉损失和骨质疏松，以及，为运动员非赛季增加体重、提高力量和食欲、保留肌肉和紧实肌肉。
目前，多采用化学法合成宝丹酮，但是，利用化学法合成宝丹酮存在产率低、副产物多、合成路线复杂、需要添加强酸或有毒试剂以及成本较高等缺陷，不能满足工业生产的需要。并且，利用化学法合成宝丹酮的过程中会产生大量的废气废水废料，这些废气废水废料会严重污染环境，不符合现代工业对绿色的要求。
也有人尝试通过生物法合成宝丹酮，生物法主要是通过将17β-羟基类固醇脱氢酶添加至含有低生物活性的雌酮、雄烯二酮中进行转化以生产高生物活性的宝丹酮。与化学法相比，生物法天然具有工艺相对简单、环境友好和成本低等的优势。但是，现有的生物法也仍存在很大的缺陷。例如，Chen等人通过以毕赤酵母GS115为宿主表达3-ketosteroid-Δ1-dehydrogenase构建得到了一种重组毕赤酵母，通过毕赤酵母GS115内源的17β-羟基类固醇脱氢酶，此重组毕赤酵母可以4-雄烯二酮为底物转化生产宝丹酮(得率为41％)，但是，由于毕赤酵母GS115内源的17β-羟基类固醇脱氢酶比酶活不高，利用此重组毕赤酵母生产宝丹酮时，会产生大量的1,4-雄烯二酮，副产物较多(具体可见参考文献：Chen M M,Wang FQ,Lin L C,et al.Characterization and application offusidane antibioticbiosynethsis enzyme 3-ketosteroid-1-dehydrogenase in steroid transformation[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2012,96(1):133-142.)。
因此，急需找到一种酶活高的17β-羟基类固醇脱氢酶以克服现有利用生物法合成宝丹酮存在的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种酶活高的17β-羟基类固醇脱氢酶。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第107位缬氨酸突变为了丙氨酸，命名为V107A；
或者，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第155位苏氨酸突变为了天冬酰胺，命名为T155N；
或者，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第164位组氨酸突变为了酪氨酸，命名为H164Y；
或者，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第107位缬氨酸突变为了丙氨酸、第155位苏氨酸突变为了天冬酰胺且第164位组氨酸突变为了酪氨酸，命名为V107A/T155N/H164Y。
在本发明的一种实施方式中，编码所述17β-羟基类固醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种基因，所述基因编码上述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pET-28a质粒。
本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
本发明还提供了一种生产宝丹酮的方法，所述方法为将上述宿主细胞添加至含有1,4-雄烯二酮(ADD)的转化体系中进行转化，获得含有宝丹酮的转化液；将含有宝丹酮的转化液进行分离，获得宝丹酮。
在本发明的一种实施方式中，所述转化的温度为35～40℃、pH为7.0～8.0。
在本发明的一种实施方式中，所述转化的温度为37℃、pH为7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述转化体系中还含有甲基化-β-环糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述转化体系中，1,4-雄烯二酮和甲基化-β-环糊精的质量比为1:3。
本发明还提供了上述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述生产宝丹酮的方法在生产宝丹酮中的应用。
[有益效果]
(1)本发明提供了比酶活高的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y和V107A/T155N/H164Y，17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y和V107A/T155N/H164Y的比酶活分别高达1.85、1.93、2.06和5.15U/mg，分别是野生型17β-羟基类固醇脱氢酶(1.66U/mg)的1.11、1.16、1.24和3.10倍。
(2)本发明提供了可高产宝丹酮的大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A、E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N、E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y和E.coliBL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y，大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A、E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N、E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y和E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y分别以大肠杆菌BL21为宿主表达编码17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y和V107A/T155N/H164Y的基因，将大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A、E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N、E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y和E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y分别添加至含有1,4-雄烯二酮的转化体系中转化24h，即可使转化液中宝丹酮的产量分别高达2.12、2.20、2.16和2.49g/L，分别是大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBo(1.91g/L)的1.11、1.15、1.18和1.30倍。
附图说明
图1：不同重组质粒的酶切验证结果；其中，M：DNAMarker；1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21：经BamH I单酶切的重组质粒pET28a-HSDBoV106L、pET28a-HSDBoV107A、pET28a-HSDBoF109D、pET28a-HSDBoN154S、pET28a-HSDBoT155N、pET28a-HSDBoD158R、pET28a-HSDBoF159G、pET28a-HSDBoV161F、pET28a-HSDBoH164Y、pET28a-HSDBoV208G和pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y；2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22：经BamH I和Sac I双酶切的重组质粒pET28a-HSDBoV106L、pET28a-HSDBoV107A、pET28a-HSDBoF109D、pET28a-HSDBoN154S、pET28a-HSDBoT155N、pET28a-HSDBoD158R、pET28a-HSDBoF159G、pET28a-HSDBoV161F、pET28a-HSDBoH164Y、pET28a-HSDBoV208G和pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y。
图2：不同重组大肠杆菌发酵获得的细胞破碎上清液的SDS-PAGE分析结果；其中，M：蛋白Marker；1：E.coli BL21/pET28a发酵获得的细胞破碎上清液；2：E.coli BL21/pET28a-HSDBoV106L发酵获得的细胞破碎上清液；3：E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A发酵获得的细胞破碎上清液；4：E.coli BL21/pET28a-HSDBoF109D发酵获得的细胞破碎上清液；5：E.coli BL21/pET28a-HSDBoN154S发酵获得的细胞破碎上清液；6：E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N发酵获得的细胞破碎上清液；7：E.coli BL21/pET28a-HSDBoD158R发酵获得的细胞破碎上清液；8：E.coli BL21/pET28a-HSDBoF159G发酵获得的细胞破碎上清液；9：E.coliBL21/pET28a-HSDBoV161F发酵获得的细胞破碎上清液；10：E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y发酵获得的细胞破碎上清液；11：E.coli BL21/pET28a-HSDBoV208G发酵获得的细胞破碎上清液；12：E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y发酵获得的细胞破碎上清液。
图3：纯化后的不同17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的SDS-PAGE分析结果；其中，M：蛋白Marker；1：E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y发酵获得的细胞破碎上清液；2：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V106L；3：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A；4：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体F109D；5：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体N154S；6：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体T155N；7：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体D158R；8：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体F159G；9：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V161F；10：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体H164Y；11：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V208G；12：纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A/T155N/H164Y。
具体实施方式
下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21购自Invitrogen公司；下述实施例中涉及的pET-28a质粒购自Novagen公司；下述实施例中涉及的1,4-雄烯二酮(ADD)和宝丹酮购自美国SIGMA公司；下述实施例中涉及的Ellman试剂(DTNB)和半胱氨酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
下述实施例中涉及的培养基和试剂如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
1,4-雄烯二酮和宝丹酮含量的测定：采用HPLC法测定产物浓度；其中，色谱条件：色谱柱：DimosoilC18(5μL，250mm×4.6mm)，流动相：甲醇-水(V/V＝70:30)，检测器：UVDetector，检测波长：254nm，柱温：30℃，进样量：5μL，流速：1.0mL/min。
17β-羟基类固醇脱氢酶酶活的测定：反应体系(2mL)中含有10mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)、200μM预溶于2％(v/v)甲醇的1,4-雄烯二酮、0.5mM NADPH和适量纯化的17β-羟基类固醇脱氢酶；将反应体系在37℃水浴中反应1h后，沸水浴5min终止反应，离心取上清，通过HPLC法测定上清中宝丹酮的含量，进而计算17β-羟基类固醇脱氢酶的酶活；
其中，17β-羟基类固醇脱氢酶酶活的定义为：将37℃、pH 7.5的条件下每分钟转化1μmol1,4-雄烯二酮生产宝丹酮所需的酶量定义为一个酶活力单位(1U)。
17β-羟基类固醇脱氢酶比酶活的测定：17β-羟基类固醇脱氢酶比酶活＝酶活/蛋白浓度；
其中，蛋白浓度通过Bradford法测定，Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.1976.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramquantities of protein utilizing the principle ofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248–254.”中。
实施例1：17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备
具体步骤如下：
1、重组大肠杆菌的构建
将pET-28a质粒转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a。
合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码17β-羟基类固醇脱氢酶(SEQ IDNO.2)的基因；以编码17β-羟基类固醇脱氢酶的基因为模板，以HSDBo-F和HSDBo-R为引物(具体可见表1)进行PCR扩增，得到扩增产物；将扩增产物与经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pET-28a质粒连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pET28a-HSDBo以及大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBo。
利用融合PCR技术，以重组质粒pET28a-HSDBo为模板，分别以HSDBoV106L-F和HSDBoV106L-R、HSDBoV107A-F和HSDBoV107A-R、HSDBoF109D-F和HSDBoF109D-R、HSDBoN154S-F和HSDBoN154S-R、HSDBoT155N-F和HSDBoT155N-R、HSDBoD158R-F和HSDBoD158R-R、HSDBoF159G-F和HSDBoF159G-R、HSDBoV161F-F和HSDBoV161F-R、HSDBoH164Y-F和HSDBoH164Y-R、HSDBoV208G-F和HSDBoV208G-R为引物(具体可见表1)进行定点突变，得到PCR产物；将PCR产物转化大肠杆菌BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图1)和测序验证(测序工作由上海生工完成)，验证正确即获得重组质粒重组质粒pET28a-HSDBoV106L、pET28a-HSDBoV107A、pET28a-HSDBoF109D、pET28a-HSDBoN154S、pET28a-HSDBoT155N、pET28a-HSDBoD158R、pET28a-HSDBoF159G、pET28a-HSDBoV161F、pET28a-HSDBoH164Y、pET28a-HSDBoV208G和pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y，以及，大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBoV106L、E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A、E.coli BL21/pET28a-HSDBoF109D、E.coli BL21/pET28a-HSDBoN154S、E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N、E.coli BL21/pET28a-HSDBoD158R、E.coliBL21/pET28a-HSDBoF159G、E.coli BL21/pET28a-HSDBoV161F、E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y、E.coli BL21/pET28a-HSDBoV208G和E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y。
表1 PCR所用引物及其核苷酸序列
Figure BDA0002675130020000061
Figure BDA0002675130020000071
2、17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备
将大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a、E.coli BL21/pET28a-HSDBo、E.coliBL21/pET28a-HSDBoV106L、E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A、E.coli BL21/pET28a-HSDBoF109D、E.coli BL21/pET28a-HSDBoN154S、E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N、E.coliBL21/pET28a-HSDBoD158R、E.coli BL21/pET28a-HSDBoF159G、E.coli BL21/pET28a-HSDBoV161F、E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y、E.coli BL21/pET28a-HSDBoV208G和E.coliBL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y分别划线于LB固体培养基上，于37℃的条件下培养8～12h，得到单菌落；挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃的条件下培养8～12h，得到种子液；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基中，于37℃、180rpm的条件下培养12～24h，获得发酵液；将发酵液离心取菌体；将菌体超声波细胞破碎后进行离心，得到细胞破碎上清液(细胞破碎上清液的SDS-PAGE分析结果见图2)；将细胞破碎上清液镍柱亲和层析，获得纯化后的野生型17β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V106L、V107A、F109D、N154S、T155N、D158R、F159G、V161F、H164Y、V208G和V107A/T155N/H164Y(纯酶的SDS-PAGE分析结果见图3)。
检测纯化后的野生型17β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V106L、V107A、F109D、N154S、T155N、D158R、F159G、V161F、H164Y、V208G、V107A/T155N/H164Y的比酶活，检测结果为：纯化后的野生型17β-羟基类固醇脱氢酶的比酶活为1.66U/mg、纯化后的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V106L、V107A、F109D、N154S、T155N、D158R、F159G、V161F、H164Y、V208G和V107A/T155N/H164Y的比酶活分别为0.27、1.85、1.03、1.26、1.93、1.42、0.74、0.67、2.06、0.38和5.15U/mg，可见，仅有17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y和V107A/T155N/H164Y的比酶活较野生型17β-羟基类固醇脱氢酶有所提高。
3、17β-羟基类固醇脱氢酶突变体的酶学性质
3.1、最适温度
分别以20～60℃(温度梯度间隔为5℃，包括37℃)作为反应温度测定纯化后的野生型17β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y、V107A/T155N/H164Y的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用温度。
检测结果为：野生型17β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y、V107A/T155N/H164Y的最适温度均为37℃。
3.2、最适pH
分别将反应体系中的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)替换为pH 4～6的10mM Na2HPO4-柠檬酸缓冲液、pH 6～8的10mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；pH 8～10的10mM Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH梯度间隔为1，包括pH 7.5)后测定纯化后的野生型17β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y、V107A/T155N/H164Y的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，以考察酶的最适作用pH。
检测结果为：野生型17β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟基类固醇脱氢酶突变体V107A、T155N、H164Y、V107A/T155N/H164Y的最适pH均为7.5。
实施例2：宝丹酮的生产
具体步骤如下：
以实施例1获得的大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBo为对照，将实施例1获得的大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A、E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N、E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y和E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y菌体分别按200g/L的添加量添加至含有1g/L底物1,4-雄烯二酮和3g/L甲基化-β-环糊精(底物助溶剂)的转化体系中，于温度为37℃、pH为7.5的条件下转化24h，得到转化液。
检测转化液中宝丹酮的产量，检测结果为：将大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A、E.coli BL21/pET28a-HSDBoT155N、E.coli BL21/pET28a-HSDBoH164Y和E.coli BL21/pET28a-HSDBoV107A/T155N/H164Y分别添加至含有1,4-雄烯二酮的转化体系中转化24h，即可使转化液中宝丹酮的产量分别高达2.12、2.20、2.16和2.49g/L，分别是大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pET28a-HSDBo(1.91g/L)的1.11、1.15、1.18和1.30倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgccacacg tagaaagcac accctccacc tacatccccg gccgcctcga cggcaaagtc 60
gccctcgtca ccggctccgg ccgcggtatc ggcgcagccg tagccacgca cttgggccgt 120
ctaggcgcca aagtcgtcgt caactatgcc aactcgacca aagacgccga gaaagtagtc 180
tcagagatca aagcgctcgg cagcgatgcc atcgccatca aagccgacat ccgccaagtc 240
ccagacattg tgcgcctctt cgacgaagcc gtcgcgcact tcggccacct tgatattgct 300
gttagcaact cgggcgtcgt aagcttcggc cacttgaaag atgtcacaga agaagaattc 360
gaccgcgtct tcagcctcaa cacgcgcggc caattcttcg tcgcccgcga ggcatatcgc 420
cacctgaccg agggcggccg catcatcctg acttcctcca acacctcgcg cgactttagc 480
gtgccaaagc actcgctgta ctctgggtcc aagggcgctg tcgactcgtt cgtccgcatc 540
ttctccaagg actgtggcga taagaagatt acggttaatg cggttgcgcc cggaggaacg 600
gtgacggata tgtttcatga ggtttcgcat cattatattc cgaatgggtt ggactatacg 660
gcggagcagc gtcagcagat ggccgcgcat gcgtcgccgc tgcataggaa tgggttcccg 720
caggatgtgg cgaatgtggt tggtttccta gtaagcaagg agggcgagtg ggtgaatggt 780
aaggttctta cgctggatgg tggtgccgca tag 813
<210> 2
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Pro His Val Glu Ser Thr Pro Ser Thr Tyr Ile Pro Gly Arg Leu
1 5 10 15
Asp Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Ser Gly Arg Gly Ile Gly Ala
20 25 30
Ala Val Ala Thr His Leu Gly Arg Leu Gly Ala Lys Val Val Val Asn
35 40 45
Tyr Ala Asn Ser Thr Lys Asp Ala Glu Lys Val Val Ser Glu Ile Lys
50 55 60
Ala Leu Gly Ser Asp Ala Ile Ala Ile Lys Ala Asp Ile Arg Gln Val
65 70 75 80
Pro Asp Ile Val Arg Leu Phe Asp Glu Ala Val Ala His Phe Gly His
85 90 95
Leu Asp Ile Ala Val Ser Asn Ser Gly Val Val Ser Phe Gly His Leu
100 105 110
Lys Asp Val Thr Glu Glu Glu Phe Asp Arg Val Phe Ser Leu Asn Thr
115 120 125
Arg Gly Gln Phe Phe Val Ala Arg Glu Ala Tyr Arg His Leu Thr Glu
130 135 140
Gly Gly Arg Ile Ile Leu Thr Ser Ser Asn Thr Ser Arg Asp Phe Ser
145 150 155 160
Val Pro Lys His Ser Leu Tyr Ser Gly Ser Lys Gly Ala Val Asp Ser
165 170 175
Phe Val Arg Ile Phe Ser Lys Asp Cys Gly Asp Lys Lys Ile Thr Val
180 185 190
Asn Ala Val Ala Pro Gly Gly Thr Val Thr Asp Met Phe His Glu Val
195 200 205
Ser His His Tyr Ile Pro Asn Gly Leu Asp Tyr Thr Ala Glu Gln Arg
210 215 220
Gln Gln Met Ala Ala His Ala Ser Pro Leu His Arg Asn Gly Phe Pro
225 230 235 240
Gln Asp Val Ala Asn Val Val Gly Phe Leu Val Ser Lys Glu Gly Glu
245 250 255
Trp Val Asn Gly Lys Val Leu Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ala
260 265 270
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatcccg atgccacacg tagaaagcac accctcc 37
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgagctcgct atgcggcacc accatccagc gtaag 35
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcaactcggg cctcgtaagc ttcgg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccgaagctta cgaggcccga gttgc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
actcgggcgt cgccagcttc ggcca 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tggccgaagc tggcgacgcc cgagt 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcgtcgtaag cgacggccac ttgaa 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttcaagtggc cgtcgcttac gacgc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgacttcctc cagcacctcg cgcga 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcgcgcgagg tgctggagga agtca 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cttcctccaa caactcgcgc gactt 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aagtcgcgcg agttgttgga ggaag 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
acacctcgcg caggtttagc gtgcc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggcacgctaa acctgcgcga ggtgt 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cctcgcgcga cggtagcgtg ccaaa 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tttggcacgc taccgtcgcg cgagg 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gcgactttag cttcccaaag cactc 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gagtgctttg ggaagctaaa gtcgc 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gcgtgccaaa gtactcgctg tactc 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gagtacagcg agtactttgg cacgc 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgtttcatga gggttcgcat catta 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
taatgatgcg aaccctcatg aaaca 25

Claims (9)

1.一种17β-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第107位缬氨酸突变为了丙氨酸；
或者，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第155位苏氨酸突变为了天冬酰胺；
或者，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第164位组氨酸突变为了酪氨酸；
或者，所述17β-羟基类固醇脱氢酶突变体与出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的17β-羟基类固醇脱氢酶相比，第107位缬氨酸突变为了丙氨酸、第155位苏氨酸突变为了天冬酰胺且第164位组氨酸突变为了酪氨酸。
2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求2所述的基因。
4.一种工程化细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带权利要求2所述的基因或权利要求3的所述重组质粒。
5.如权利要求4所述的一种工程化细胞，其特征在于，其宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)。
6.一种生产宝丹酮的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求4或5所述的工程化细胞添加至含有1,4-雄烯二酮的转化体系中进行转化，获得含有宝丹酮的转化液；将含有宝丹酮的转化液进行分离，获得宝丹酮。
7.如权利要求6所述的一种生产宝丹酮的方法，其特征在于，所述转化的温度为35～40℃、pH为7.0～8.0。
8.如权利要求6或7所述的一种生产宝丹酮的方法，其特征在于，所述转化体系中还含有甲基化-β-环糊精。
9.权利要求1所述的17β-羟基类固醇脱氢酶突变体或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的重组质粒或权利要求4或5所述的工程化细胞或权利要求6-8任一项所述的一种生产宝丹酮的方法在生产宝丹酮中的应用。
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