CN108559737B

CN108559737B - 一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体

Info

Publication number: CN108559737B
Application number: CN201810033873.0A
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 宗迅成; 徐雄峰; 王瑞; 李雪晴; 李剑芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN108559737A

Abstract

本发明公开一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明通过菜豆来源的环氧水解酶进行单向定点突变，获得对映选择性与对映归一性提高的突变酶P184L。P184L对外消旋间氯环氧苯乙烷(rac‑mCSO)的最终ee_p，在25℃下从3.1％提高到27.3％。与野生型相比，P184L对外消旋对氯环氧苯乙烷rac‑pCSO的E值从2.6提高至20，对rac‑pCSO的对映选择性提高了7.7倍。

Description

一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体

技术领域

本发明涉及一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体及构建方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

对映纯对氯环氧苯乙烷(pCSO)与其水解产物对氯苯乙二醇(pCPED)是多种手性药物与功能材料的重要中间体，如R型对氯环氧苯乙烷((R)-pCSO)可以用于合成CB1拮抗剂；R型对氯苯乙二醇((R)-pCPED)是NMDA受体抑制剂——依利罗地的重要手性砌块。目前，一系列合成对映纯pCSO与pCPED的生物化学方法已经被报道。其中，Suresh等人利用一类手性大环席夫碱类化合物催化对氯苯乙烯加氧合成(R)-pCSO，其ee_p最高可达47％；Karboune等人利用来自重组黑曲霉(Aspergillus niger)的环氧化物水解酶(AnEH)水解外消旋对氯环氧苯乙烷制备(R)-pCSO，当转化率达到51％时，ee_s为87％并保留S型底物；Manoj等人使用两种对映选择性互补的EH(StEH与AnEH)协同水解外消旋pCSO合成(R)-pCPED，ee_p达到93％。利用EHs催化制备(R)-pCSO与(R)-pCPED与席夫碱催化合成相比，具有ee_p高，来源清洁，更易分离等优势。

环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。该反应的立体化学结果与酶对底物的立体选择性(包括对映选择性与对映归一性)紧密相关：具有对映选择性的EHs快速催化某一构型环氧化物的水解反应，得到相应的产物邻二醇以及保留另一构型环氧化物，即进行酶促动力学拆分。其中，EHs对外消旋环氧化物的对映选择率E决定环氧化物的对映体纯度。若继续反应，另一构型环氧化物也会被水解，即进行酶促对映归一性水解。底物完全转化时，区域选择性系数决定最终产物邻二醇的对映体纯度。环氧化物和邻二醇的对映体纯度通常用对映体过量值ee评价，分别表示为ee_s和ee_p。

EHs广泛存在于各生物体中，如真菌、细菌、古生菌、病毒、植物和哺乳动物等。迄今为止，NCBI数据库中收录的EHs基因序列已达数千个。PDB数据库中与EHs晶体结构相关的数据已达两百多条，根据其晶体结构与催化机理的不同，EHs分为三类：(1)α/β水解折叠EHs，例如有微生物来源的ArEH，植物来源的StEH和动物来源的MmsEH；(2)非α/β水解折叠EHs，例如来源于人的LTA₄H；(3)其他类型，例如来源于红串红球菌的LEH。为了更好地将PvEH1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，对现有的EHs中进行结构和特性方面的优化显得十分必要。

发明内容

为了更好地将PvEH1应用于对映纯的环氧化物与邻二醇的工业生产，本发明利用定点突变获得了立体选择性提高的PvEH1突变体。本发明采用全质粒PCR的方法对184位脯氨酸进行单向定点突变，获得了立体选择性和催化活性同时提高的突变酶P184L，解决了立体选择性不能满足生产高对映纯环氧化物与邻二醇的需求，为拓宽PvEH1的工业应用奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种环氧化物水解酶PvEH1的突变体，所述突变体含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括大肠杆菌、酵母或枯草芽孢杆菌。

本发明的第五个目的是提供一种提高环氧化物水解酶立体选择性的方法，是将Phaseolus vulgaris来源的环氧化物水解酶第184位氨基酸突变成疏水性氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将GenBank登录号为XM007146940的环氧化物水解酶PvEH1的第184位氨基酸突变成疏水性氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述突变是将色氨酸突变成亮氨酸。

本发明的第六个目的是提供所述突变体在食品、医药领域中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备手性药物或功能材料。

本发明的有益效果：

本发明通过菜豆来源的环氧水解酶1(PvEH1)的Pro184进行单向定点突变，获得对映选择性与对映归一性(即立体选择性)提高的突变酶P184L。P184L对外消旋间氯环氧苯乙烷(rac-mCSO)的最终ee_p，在25℃下从3.1％提高到27.3％，这表明P184L对间氯环氧苯乙烷rac-mCSO的对映归一性提高了26倍。同时，与野生型相比，P184L对外消旋对氯环氧苯乙烷rac-pCSO的E值从2.6提高至20，这表明P184L对rac-pCSO的对映选择性提高了7.7倍。同时，该突变体的稳定性没有发生变化，有利于酶在工业生产上的应用

具体实施方式

突变体命名方式：

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如P184L，表示位置184的氨基酸由亲本PvEH1的Pro替换成Leu，位置的编号对应于亲本PvEH1的氨基酸序列。

全细胞比活力和对映选择性测定

称取100mg重组菌湿菌体悬浮于1mL磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH＝7.0，)中，吸取200μL菌悬液(100mg·mL^-1)加入到含750μL磷酸钠缓冲液的2mL EP管中，25℃孵育5min后加入50μL rac-pCSO或rac-mCSO(200mmol·L^-1，溶剂为甲醇)至终浓度为10mmol·L^-1，25℃、800r·min^-1恒温震荡反应器中反应10min，取50μL样品用1mL乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥。样品分析采用高效液相色谱仪Waters e2695、手性液相色谱柱和紫外检测器。rac-pCSO高效液相色谱条件为：流动相为正己烷:异丙醇＝80:20，柱温为30℃，流速为0.8mL·min^-1，检测波长为220nm，手性液相色谱柱AS-H(250mm×4.6mm×5μm)。(R)-对氯环氧苯基乙烷((R)-pCSO)：6.290min，(S)-p对氯环氧苯基乙烷((S)-pCSO)：7.062min，(R)-对氯苯基乙二醇((R)-pCPED)：7.977min，(S)-对氯苯基乙二醇((S)-pCPED)：9.059min。

rac-mCSO高效液相色谱条件为：流动相为正己烷:异丙醇＝90:10，柱温为30℃，流速为0.8mL·min^-1，检测波长为220nm，手性液相色谱柱OD-H(250mm×4.6mm×5μm)。(R)-间氯环氧苯基乙烷((R)-mCSO)：5.674min，(S)-p间氯环氧苯基乙烷((S)-mCSO)：5.786min，(R)-间氯苯基乙二醇((R)-mCPED)：9.766min，(S)-间氯苯基乙二醇((S)-mCPED)：10.972min

在上述测定条件下，酶活单位定义为每分钟消耗1μmol的pCSO或rac-mCSO所需的酶量定义为1个单位酶活(U)。全细胞比活力(U·g^-1)计算如公式(1)所示，其中c全细胞催化rac-pCSO或rac-mCSO的转化率，C₀为初始浓度，t为反应时间，v为反应体积，m为全细胞质量。

底物ee_s和产物ee_p的计算公式(2)和(3)所示，其中R_s和S_s分别代表(R)-pCSO或(R)-mCSO和(S)-pCSO或(S)-mCSO的峰面积，R_p和S_p表示(R)-pCPED或(R)-mCPED和(S)-pCPED或(S)-mCPED的峰面积^[17]。酶的对映选择性通常用对映体比率(enantiomeric ratio,E)来评价，E值越高，则对映选择性越高，其计算公式如(4)，其中c是转化率。

实施例1：突变质粒构建

利用高纯度质粒小提试剂盒PurePlasmidMini Kit(购于康为试剂有限公司)从实验室保藏的E.coli BL21(DE3)/pET-28a-pveh1(叶慧华,胡蝶,李闯,等.新型菜豆环氧化物水解酶的异源表达及对映归一性催化特性[J].中国生物工程杂志,2016,36(10):21-27.169:41-54.)中提取质粒作为单向定点突变的模板，

所用的引物为P184L-F(5’-3’GAGACCAGGACCACTAATACTCCCCAA)；P184L-R(5’-3’TTGGGGAGTATTAGTGGTCC TGGTCTC)。

利用

HS PCR酶(购于TaKaRa公司)采用全质粒PCR的方法。以PvEH1的质粒为模板，PCR条件：变性98℃，10s；退火55℃，5s；延伸72℃，3.5min，循环30次，72℃延伸10min。PCR产物经采用Dpn I酶消化模板质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化参照SK9302超级感受态细胞制备试剂盒使用说明书，突变体经测序确认碱基序列。得到了氨基酸序列为SEQ ID NO:1的突变酶，与野生酶(Phaseolus vulgaris来源的PvEH1，GenBankAccession No.XM007146940)相比，第184位的氨基酸由脯氨酸突变成了亮氨酸。

实施例2：突变体酶的获取

将获得的突变酶表达载体接种(接种量为1％)于2mL含1％卡那霉素的LB培养基中，于37℃、220r·min^-1培养过夜；取2mL培养液转接于100mL含1％卡那霉素的LB培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入100μL的IPTG(500mmol·L^-1)至终浓度为0.5mmol·L^-1，20℃下诱导10h后离心收集重组菌菌体。经测定，菌体的环氧化物水解酶对rac-pCSO的酶活为10.0U/g菌体细胞。

实施例3：突变前后酶的对rac-pCSO对映选择性比较

本发明比较了突变前后酶的立体选择性，立体选择性又包括对映选择性与对映归一性两种性质。其中野生酶是指Phaseolus vulgaris来源的PvEH1，GenBank AccessionNo.XM007146940。

每20mg湿菌体用1ml磷酸钠缓冲液(pH＝7.0，100mmol·L^-1)悬浮，取1mL加入到2mLEP管中，加入50μL 200mmol·L^-1rac-pCSO(溶剂为甲醇)，底物终浓为10mmol·L^-1。放置于25℃、220r·min^-1摇床反应，分别于30min、1h、2h及24h取50μL样品用乙酸乙酯萃取三次(总量为1mL)，并用无水硫酸镁干燥后利用高效液相色谱对样品进行分析。当转化率c在50％左右时测定E值，与野生型相比，P184L对外消旋对氯环氧苯乙烷rac-pCSO的E值从2.6提高至20。

实施例4：突变前后酶的对rac-mCSO对映归一性比较

每200mg湿菌体用1ml磷酸钠缓冲液(pH＝7.0，100mmol·L^-1)悬浮，取1mL加入到2mL EP管中，加入50μL 200mmol·L^-1间氯环氧苯乙烷rac-mCSO(溶剂为甲醇)，底物终浓为10mmol·L^-1。放置于25℃、220r·min^-1摇床反应，过夜反应取50μL样品用乙酸乙酯萃取三次(总量为1mL)，并用无水硫酸镁干燥后利用高效液相色谱对样品进行分析。结果发现，反应12h后，P184L对外消旋间氯环氧苯乙烷rac-mCSO最终ee_p从3.1％提高到27.3％。

实施例5：突变前后酶的全细胞催化rac-pCSO及rac-mCSO的酶活比较

称取100mg重组菌湿菌体悬浮于1mL磷酸钠缓冲液(100mmol·L^-1，pH＝7.0)中，吸取200μL菌悬液(100mg·mL^-1)加入到含750μL磷酸钠缓冲液的2mL EP管中，25℃孵育5min后加入50μL rac-pCSO(200mmol·L^-1，溶剂为甲醇)至终浓度为10mmol·L^-1，25℃、800r·min^-1恒温震荡反应器中反应10min，取50μL样品用1mL乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥。样品分析采用HPLC。结果发现，P184L对外消旋对氯环氧苯乙烷rac-pCSO的全细胞比活力从12.7U·g^-1到27U·g^-1；P184L对外消旋间氯环氧苯乙烷rac-mCSO的全细胞比活力从3.4U·g^-1到6.4U·g^-1。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种立体选择性提高的菜豆环氧水解酶突变体

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 319

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Gly Val Glu His Arg Thr Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met

1 5 10 15

His Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ala Leu Ser

35 40 45

Ala Leu Gly Tyr Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Asp Ala Pro Ala Ser Val Ser Ser Tyr Thr Ile Leu His Leu Val

65 70 75 80

Ala Asp Val Val Ala Leu Ile Asp Ser Leu Gly Val Asp Gln Val Phe

85 90 95

Leu Val Ala His Asp Gly Ala Leu Val Gly Trp Tyr Thr Cys Leu Phe

100 105 110

Arg Pro Asp Arg Ile Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Phe Met

115 120 125

Pro Arg Asn Pro Lys Val Lys Pro Val Asp Ala Met Arg Ala Leu Tyr

130 135 140

Gly Asp Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Glu Pro Gly Lys Met Glu

145 150 155 160

Thr Leu Tyr Asp Asn Asn Ile Glu Glu Ala Ile Lys Asn Met Leu Thr

165 170 175

Ser Arg Arg Pro Gly Pro Leu Ile Leu Pro Lys Glu Gly Ala Gly Ser

180 185 190

Asn Pro Leu Ala Ser Gly Ser Leu Pro Ser Arg Pro Leu Pro Ser Trp

195 200 205

Leu Ser Gln Glu Asp Leu Thr Tyr Tyr Ala Ser Lys Phe Gly Lys Thr

210 215 220

Gly Leu Thr Gly Gly Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Leu Asn Leu Asn Trp

225 230 235 240

Glu Leu Thr Ala Ala Trp Thr Gly Val Gln Val Lys Val Pro Val Lys

245 250 255

Phe Ile Thr Gly Asp Leu Asp Ile Val His Thr Ser Leu Gly Thr Lys

260 265 270

Asp Tyr Ile Glu Ser Gly Ala Phe Lys Arg Asp Val Pro Phe Leu Glu

275 280 285

Glu Val Val Val Gln Glu Gly Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu Ala

290 295 300

Ala Glu Asp Val Ser Asn His Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe

305 310 315

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccctctaga aataattttg tttaacttta agaaggagat ataccatggg cagcagccat 60

catcatcatc atcacagcag cggcctggtg ccgcgcggca gccatatgga aggcgtagaa 120

cacaggacag tggaagtgaa tggcatcaaa atgcatgtag cagagaaagg agagggtcct 180

gtcgtcttgt tcctccatgg cttccccgag ctctggtact cctggcgcca ccagattctg 240

gctctcagcg ccctcgggta ccgcgccgtg gctcctgatc tgcgtggcta cggagacacc 300

gatgccccgg cttcggtgag cagctacacc atcttgcacc tcgtggctga cgtcgtggca 360

ctcattgact cacttggtgt ggatcaagtc ttcctcgttg cccatgattg gggagcccta 420

gtaggatggt acacatgttt atttcgacct gatagaatca aggcctatgt ttgcctcagc 480

gtccctttca tgcccagaaa cccaaaagtg aagcccgttg atgccatgcg tgccctttat 540

ggggatgact actacatctg cagattccag gaaccaggca agatggaaac tctgtatgac 600

aataatatcg aagaagcaat caagaacatg cttacaagta ggagaccagg accactaata 660

ctccccaaag aaggagcggg ttccaatccc cttgcttcag ggtcccttcc atcaaggcct 720

cttccatctt ggctctcaca ggaagatctg acttactatg cttctaaatt tggcaagaca 780

ggcttaactg gtggcctcaa ctactataga aatctcaacc tcaattggga gctcacagca 840

gcatggactg gagttcaagt caaagttcct gtgaagttca ttacaggtga tttggatata 900

gttcacacct cactggggac caaagactac atagagagtg gtgctttcaa gagagatgtg 960

ccatttttgg aggaagtggt tgtgcaggaa ggggttgctc acttcaacaa ccaagaagct 1020

gcagaggatg tcagcaatca catttatgat tttatcaaca agttctgact cgagcaccac 1080

caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaa 1125

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gagaccagga ccactaatac tccccaa 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttggggagta ttagtggtcc tggtctc 27

Claims

1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.表达权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，是真菌细胞或细菌细胞。

7.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，是大肠杆菌细胞。

8.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，是将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列与载体pET-28a连接，转化至E.coliBL21(DE3)细胞中获得。

9.权利要求1所述的环氧化物水解酶突变体在食品、医药领域中的应用。