CN103013945A - 一种环氧水解酶突变体及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环氧水解酶突变体及其基因和应用。该环氧水解酶突变体是在具有如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸且具有环氧水解酶活性的由其衍生的蛋白质。本发明所述环氧水解酶突变体与野生型环氧水解酶相比，对消旋环氧化物的水解活性和对映选择性均有大幅度提高，所述环氧水解酶突变体尤其适合拆分催化消旋萘基缩水甘油醚拆分反应，制备(S)-萘基缩水甘油醚，并可进一步合成手性药物(S)-普萘洛尔，该水解酶突变体具有很好的工业应用前景。

Description

一种环氧水解酶突变体及其基因和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种环氧水解酶突变体及其基因和应用。

背景技术

生物催化是一个由有机化学、生物化学、微生物学和过程工程学等多个学科交叉的研究领域。生物催化剂具有高效、特异的催化活力，其最大优势在于无可比拟的化学选择性和立体选择性，在酶的作用下，产物的光学纯度可高达99%ee，在医药中间体合成中显得尤为重要。生物催化的反应条件很温和，适宜在常温常压、中性pH和水相中进行反应，这与“可持续发展”、“绿色化学”、“环境友好制造”等工业发展的目标相符。生物催化技术已被看作是对传统生物发酵与化学合成产业改造极为重要的、很有吸引力的技术之一。

目前已实现工业化的生物转化过程中，水解酶由于其高活性和稳定性以及不需要额外添加辅因子等优点成为主要的一大类应用于有机合成的生物催化剂，大约占生物催化剂总量的44%，而其中的大部分水解酶应用于手性化合物的合成(参见Curr. Org.Chem.2010,14,1447-1460)。在大量的手性化合物中，手性环氧化物是一类非常重要的手性合成砌块，由于环氧化物及其开环产物邻二醇能与各种亲核试剂反应，因而广泛应用于手性药物、农药、液晶、香料以及其他手性化学品的合成。通过化学法或生物法催化外消旋环氧化物的动力学拆分可以制备光学活性环氧化物。其中环氧水解酶是用于高光学活性手性环氧化物和手性二醇制备的一类重要的生物催化剂。它具有以下一些优点：1)酶的来源广泛、底物谱广、选择性高；2)反应不需要添加任何辅因子；3)环氧水解酶在非水相介质中仍能保留一定活性；4)反应条件温和，无污染，符合“绿色化学”趋势；5)具有对映选择性和位置选择性互补的环氧水解酶可实现对映归一性水解，理论上能以100%的转化率获得单一构型的光学纯邻位二醇，具有很高的原子经济性，因此该方法在光学纯的环氧化物或邻位二醇制备中具有很高的应用潜力。

目前市场上已有来源于黑曲霉(Aspergillrs niger)和红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的环氧水解酶实现了商品化酶制剂的销售(Sigma)。然而真正实现工业化的环氧水解酶应用实例还很少，许多重要的环氧化合物找不到合适的环氧水解酶进行拆分。一大类重要的心血管药物-洛尔类药物(也称β-blocker，β-肾上腺素阻断剂)，发挥功能的主要是它们的(S)-对映体，而(R)-对映体不具备药理活性甚至会产生副作用，如普萘洛尔的(S)-对映体的药理活性是(R)-对映体药理活性的130倍(参见Br.J. Pharmacol.1968,34,13-55)。洛尔类药物可通过其相应构型的环氧化物作为前体合成得到，如(S)-普萘洛尔可通过(S)-萘基缩水甘油醚作为前体合成得到。但由于洛尔类药物的合成前体往往分子结构比较大，因此具有较大的空间位阻，目前已发现的环氧水解酶对它们的活性和选择性往往很低。

从巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC1293克隆得到的环氧水解酶BmEH可催化多种缩水甘油芳基醚的对映选择性水解拆分制备高光学活性的手性环氧化物，该酶已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组过量表达(Adv.Synth.Catal.2011,353,1510-1518;CN102242085A)。该酶对苯基缩水甘油醚底物具有高达83U/mg纯酶的比活力，并且优先催化(R)-构型底物水解。对于萘基缩水甘油醚，由于其苯环上有大取代基团的底物，因此该重组酶对该底物的活性和选择性较低，活性不足1U/mg纯酶，从而限制了它在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。通过解析环氧水解酶的晶体结构，并利用分子动力学模拟等手段，从分子水平解析酶的催化过程，通过定点突变技术提高环氧水解酶对目标底物的催化活性和选择性，将具有较强的工业应用价值。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题是，针对目前已发现的环氧水解酶对萘基底物的催化活性和选择性都较低的问题，提供一种环氧水解酶突变体蛋白质及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，所述环氧水解酶突变体蛋白质、含有该环氧水解酶突变体蛋白质的细胞的制备方法，以及该环氧水解酶突变体蛋白质或表达该环氧水解酶突变体蛋白质的重组转化体作为催化剂在催化消旋环氧化物水解拆分反应，制备光学纯手性化合物中的应用。与野生型环氧水解酶相比，本发明提供的环氧水解酶突变体蛋白质具有更高的催化底物反应活性和选择性。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，所述蛋白质是在具有如序列表中SEQ IDNo:1所示氨基酸序列的蛋白质的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸且具有环氧水解酶活性的由其衍生的蛋白质。

其中所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。具有序列表中SEQID No:1所示氨基酸序列的蛋白质命名为BmEh蛋白。

其中所述的取代的位点较佳地为：序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221氨基酸中的一位或多位。

其中所述蛋白质较佳地为：将具有序列表中SEQ IDNo:1所示氨基酸序列的蛋白质的第98位的色氨酸突变为苯丙氨酸(W98F)；所述氨基酸序列中第101位的甘氨酸突变为亮氨酸(G101L)；所述氨基酸序列中第123位的脯氨酸突变为色氨酸(P123W)；所述氨基酸序列中第128位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(F128A)、缬氨酸(F128V)或异亮氨酸(F128I)，其中更佳地是突变为缬氨酸(F128V)；所述氨基酸序列中第132位的亮氨酸突变为丙氨酸(L132A)；所述氨基酸序列中第144位的酪氨酸突变为苯丙氨酸(Y144F)；所述氨基酸序列中的第145位的甲硫氨酸突变为丙氨酸(M145A)、缬氨酸(M145V)、异亮氨酸(M145I)、亮氨酸(M145L)、半胱氨酸(M145C)、苏氨酸(M145T)或组氨酸(M145H)，其中更佳地是突变为丙氨酸(M145A)；所述氨基酸序列中第168位的亮氨酸突变为丙氨酸(L168A)；所述氨基酸序列中第169位的缬氨酸突变为苯丙氨酸(V169F)；所述氨基酸序列中第203位的酪氨酸突变为苯丙氨酸(Y203F)；所述氨基酸序列中第206位的亮氨酸突变为丙氨酸(L206A)；所述氨基酸序列中第208位的异亮氨酸突变为丙氨酸(I208A)；所述氨基酸序列中第219位的亮氨酸突变为丙氨酸(L219A)；所述氨基酸序列中第220位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(F220A)；所述氨基酸序列中第221位的脯氨酸突变为甘氨酸(P221G)；所述氨基酸序列中第242位的苯丙氨酸突变为丙氨酸(F242A)；所述氨基酸序列中第268位的丙氨酸突变为苯丙氨酸(A268F)所得的蛋白质。

本发明所述蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中，将所得重组载体转化到转化体中，得到重组表达转化体，通过培养所得重组表达转化体，即可分离纯化获得所述蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述核酸是编码上述蛋白质的核酸分子。

其中所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码环氧水解酶的核酸分子，通过基因克隆技术获得编码环氧水解酶突变体的基因核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码环氧水解酶突变体的核酸分子。

如本领域技术人员所知：编码SEQ IDNo:1的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

本发明所述核酸较佳地为具有点突变的核酸分子，所述具有点突变的核酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地为：以来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC1293中的环氧水解酶基因(该基因名称：bmeh，请参考GenBank:HQ436037.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取需要进行突变的氨基酸位点上下游各15～20bp的一段碱基序列，将突变位点的碱基替换为突变后氨基酸的密码子，作为PCR正向引物，其反向互补序列即为PCR反向引物)，通过PCR方法扩增，即得到带有点突变的核酸分子。其中所述含有突变点的突变引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:43所示。

其中所述含有突变点的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为人工合成。利用所得PCR引物进行PCR扩增程序，即得编码所述环氧水解酶突变体的核酸分子。

其中所述PCR扩增为本领域常规技术，其中所述PCR反应的体系(50μl)较佳地为：上述模板0.5~20ng，5μl10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的KOD酶，加灭菌蒸馏水至50μl。

所述PCR扩增的程序较佳地为：(1)94°C变性5min；(2)94°C变性30sec，(3)55°C退火1min，(4)68°C延伸7min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后68°C延伸10min，4°C保藏产物。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的环氧水解酶基因突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒pET-28a(+)。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的环氧水解酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌(E.coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将前述重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五是：一种重组环氧水解酶的制备方法，其中包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得重组环氧水解酶。

其中所述制备方法较佳地为：将上述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素(100μg/ml)的LB培养基中，30～40°C，150～200rpm培养，培养液的吸光密度OD₆₀₀达到0.5~1.0(优选0.8)，加入0.05~1.0mmol/L(优选地为0.2mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16～30°C(优选25°C)，诱导12~16小时即可得到高效表达的重组环氧水解酶。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之六是：上述蛋白质或上述重组表达转化体作为催化剂在消旋环氧化物水解拆分制备光学纯手性环氧化物以及手性邻位二醇中的应用。

其中所述消旋环氧化物的化学通式较佳地如式1或式2所示：

式1                  式2

其中取代基R为本领域常规使用的取代基，其中取代基R为H、羟基、腈基、酰胺基、甲氧乙基、甲砜氨基、烷基、硝基、卤素基团、2,3-芳香基取代、2,3-芳烷杂环基取代或2,3-环状杂烷基取代。

其中所述消旋环氧化物更佳地为苯基缩水甘油醚、α-萘基缩水甘油醚、2-乙基-苯基缩水甘油醚、2-烯丙基-苯基缩水甘油醚、对硝基氧化苯乙烯、4-环氧丙氧基咔唑、4-环氧丙氧基苯乙酰胺、对氯苯基缩水甘油醚、4-甲砜氨基苯基缩水甘油醚、2-腈基苯基缩水甘油醚、4-羟甲苯基缩水甘油醚、4-甲氧乙基苯基缩水甘油醚、2-烯丙氧基苯基缩水甘油醚、2R,3S-1,2,3,4-四氢萘基-2,3-二醇缩水甘油醚、2-羰基-3,4-二氢喹啉缩水甘油醚或吲哚缩水甘油醚。

其中所述光学纯手性环氧化物的化学通式较佳地如式3或式4所示：

式3                  式4

其中所述手性邻位二醇的化学通式如式5或式6所示：

式5                  式6

其中取代基R为本领域常规使用的取代基，其中取代基R较佳地为H、羟基、腈基、酰胺基、甲氧乙基、甲砜氨基、烷基、硝基、卤素基团或2,3-芳香基取代、2,3-芳烷杂环基取代、2,3-环状杂烷基取代。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：与野生型环氧水解酶相比，本发明所述环氧水解酶突变体具有更高的催化活性和对映选择性，对萘基缩水甘油醚的水解活性由野生型的不足1U/mg的比活力提升至最高达79U/mg，并且对映选择性也有大幅度提高。本发明所获得的多个环氧水解酶突变体特别适用于催化消旋萘基缩水甘油醚水解拆分反应制备(S)-萘基缩水甘油醚，并可进一步合成手性药物(S)-普萘洛尔，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1为环氧水解酶突变体表达及纯化结果的SDS-PAGE电泳图。其中：图1(A)泳道1为野生型环氧水解酶蛋白，泳道2为不同分子量的蛋白质标准品，泳道3~9分别为突变体蛋白W98F、G101L、P123W、F128A、F128V、F128I和L132A。图1(B)泳道1为野生型环氧水解酶蛋白，泳道2为不同分子量的蛋白质标准品，泳道3~10分别为突变体蛋白Y144F、M145A、M145V、M145I、M145C、M145L、M145T和M145H。图1(C)泳道1为野生型环氧水解酶蛋白，泳道2为不同分子量的蛋白质标准品，泳道3~9分别为突变体蛋白L168A、V169F、Y203F、L206A、I208A、L219A和F220A。图1(D)泳道1为野生型环氧水解酶蛋白，泳道2为不同分子量的蛋白质标准品，泳道3~10分别为突变体蛋白P221G、F242A、A268F、M145A/F128A、M145A/L206A、M145A/L219A、219至220缺失突变体和219至222缺失突变体。

图2为化学-酶法合成(S)-普萘洛尔的路线图。其中式A为α-萘酚，式B为环氧氯丙烷，式C为消旋萘基缩水甘油醚，式D为(S)-萘基缩水甘油醚，式E为(S)-普萘洛尔。其中步骤1为45℃回流，NaOH，CH₂CL₂，PEG400；步骤2为BmEH蛋白突变体M145A，10℃，异丙醚/水=1/4；步骤3为42℃回流，异丙胺。

图3为酶促拆分萘基缩水甘油醚的反应进程曲线图。图中所示四条曲线为反应过程中两种构型底物及其对应的两种构型产物在反应体系中的浓度变化。其中▲：(S)-萘基缩水甘油醚；■：(R)-萘基缩水甘油醚；△：(S)-3-α-萘氧基-1,2-丙二醇；□：(R)-3-α-萘氧基-1,2-丙二醇。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1环氧水解酶突变体的制备

定点突变采用

II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，Catalog#200522)所述方案进行操作。首先设计含有突变点的突变引物，如表1所示，包括对序列表中SEQ ID NO:1所示序列中第98位、101位、123位、128位、132位、144位、145位、168位、169位、203位、206位、208位、219位、220位、221位、242位和268位引入突变的引物，以及对128位和145位进行饱和突变(将第128位的苯丙氨酸突变为20种氨基酸中的任意一种和将第145位甲硫氨酸突变为20种氨基酸中的任意一种和)的两对简并引物，上述引物的序列如序列表中SEQ ID NO:2～SEQ ID NO:43所示：

表1  环氧水解酶的突变引物

PCR反应体系(50μl)：模板0.5~20ng，5μl10×KOD plus buffer，5μldNTP(各2.0mM)，2μl MgSO₄(25mM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka,Japan)，加灭菌蒸馏水至50μl。

其中所述的模板为：环氧水解酶基因(bmeh，GenBank:HQ436037.1)，该基因由土壤中筛选的菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC1293制备所得(请参见J.Mol.Catal.B:Enzym.2001,13,61–68)。

PCR反应程序：(1)94°C变性5min；(2)94°C变性30sec，(3)55°C退火1min，(4)68°C延伸7min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后68°C延伸10min，4°C保藏产物。

扩增得到的PCR产物经内切酶DpnⅠ37°C消化2h后转化E.coli DMT感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板。37°C过夜培养后，挑选单克隆，即得到含突变体表达质粒的E.coli DMT菌株，送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与野生型环氧水解酶基因序列进行比对，确认突变前后基因序列及相应的氨基酸序列的差异，用Qiagen小量质粒抽提试剂盒从含突变体质粒的E.coli DMT菌株中提取质粒。所得质粒转化到表达宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板，37°C过夜培养后，挑选单克隆，即得到含不同突变酶的表达菌株。

实施例2  巨大芽孢杆菌环氧水解酶突变体的表达纯化

1.环氧水解酶突变体的表达

将实施例1中所得突变体的表达菌株接种于1L含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37°C200rpm培养至OD600达到0.6~0.8，降温至16°C并加入终浓度为0.4mM的IPTG，继续培养20h进行诱导表达。6000×g离心10min收集菌体，用50mM pH8.0磷酸钠缓冲液(含500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)重悬，高压匀浆破碎，30,000×g离心45min离心后取上清，即可得到环氧水解酶突变体蛋白的粗酶液。将所得粗酶液进行冷冻干燥，即得环氧水解酶突变体的粗酶粉。

2.环氧水解酶突变体的纯化

使用Ni亲和柱纯化环氧水解酶突变体蛋白，具体方法如下：

(1)用50mM pH8.0磷酸钠缓冲液(含500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)平衡Ni柱；

(2)将上述方法所得的环氧水解酶突变体蛋白的粗酶液以1ml/min的流速通过Ni柱，使目的蛋白挂载到Ni柱上；

(3)用含0~50mM咪唑的50mM pH8.0磷酸钠缓冲液(含500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)洗脱与Ni柱没有结合能力的杂蛋白；

(4)用含200mM咪唑的50mM pH8.0磷酸钠缓冲液(含500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)洗脱目的蛋白；

(5)用50mM pH8.0磷酸钠缓冲液(含500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)平衡Ni柱，备用。

(6)用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测收集到的蛋白样品。取20μl样品加入5μl5×SDS样缓冲液进行处理，上样量均为10μl，标准分子量蛋白(Protein Molecular Weight Marker)，购于美国Thermo公司。SDS-PAGE胶浓度为12%，选用110V电压进行浓缩电泳，再改为200V电压进行分离电泳。结果表明通过上述方法获得的突变体能够纯化得到高纯度蛋白，分子量大小在38kDa左右，蛋白电泳结果如图1所示。

实施例3环氧水解酶突变体的活性测定

我们利用高效液相色谱(HPLC)对反应后混合物中的底物和产物进行分离，测定反应前后反应体系中底物浓度的减少及产物浓度的增加，确定环氧水解酶的催化活性。一个酶活单位定义为在上述反应条件下每分钟水解1μmol底物所需的酶量。比活定义为每毫克蛋白所具有的活力单位数。

环氧水解酶活性检测方法为：总反应体系为0.5ml，其中含2mM底物，助溶剂为10%DMSO，100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)。在2ml EP管中，30°C，1000rpm条件下反应，预热5min后加入同样在30°C预热的酶液反应5min，取样100μl加入400μl甲醇终止反应，样品离心过滤后用装有C18反相柱的HPLC(岛津)进行分析，流动相甲醇:水=90:10或75:25，流速0.8ml/min，检测波长为280nm或254nm。一个酶活力单位定义为在上述反应条件下每分钟水解1μmol底物所需的酶量。比活定义为每毫克蛋白所具有的活力单位数。测定酶的选择性时采用上述方法相同的反应体系，控制转化率低于50%，用装备有手性柱的HPLC或GC进行检测(所用手性柱及检测条件参考：Adv.Synth.Catal.2011,353,1510-1518;Org.Lett.2006,8,1737-1740)。

环氧水解酶突变体测活结果表明针对苯基缩水甘油醚、α-萘基缩水甘油醚、苯基缩水甘油醚、2-烯丙基-苯基缩水甘油醚、对硝基氧化苯乙烯等一系列底物，本发明所获得的环氧水解酶突变体库中均能找到相应的突变体适用于特定底物的动力学拆分。以α-萘基缩水甘油醚为底物，对各突变体纯酶进行测活，结果参见表2。

表2  环氧水解酶突变体对萘基缩水甘油醚比活力

酶	比活(U/mg纯酶)
		WT	0.9±0.06
128A	21.8±0.0
		F128V	79.0±0.5
F128I	47.5±0.4
		M145A	11.5±0.1
M145V	67.6±0.8
		M145I	12.8±0.2
M145C	14.3±0.3
		M145L	2.94±0.02
M145A/L219A	1.2±0.1
		M145A/L206A	2.5±0.1

对实施例2纯化所得突变体蛋白进行测活，表2中所列数据为对α-萘基缩水甘油醚活性具有显著提高的突变体的比活。结果表明在环氧水解酶底物结合位点周围将位阻较大的残基突变为位阻较小的丙氨酸后，145位的甲硫氨酸与128位的苯丙氨酸在突变后对萘基缩水甘油醚具有很大的活性提高。由于145位与128位处于底物结合位点的同一个方向，因此可以得出结论，在野生型环氧水解酶中，主要由于这两个残基的存在限制了萘基缩水甘油醚与酶的结合。我们进一步对145位和128位两个位点进行的饱和突变可以拿到其他活性更高的突变体。在所获得的突变体中M145V和F128V与野生型相比，对萘基缩水甘油醚的催化活性由0.9U/mg分别提高到了68U/mg和79U/mg。以α-萘基缩水甘油醚、2-甲基-苯基缩水甘油醚、2-烯丙基-苯基缩水甘油醚、对硝基氧化苯乙烯为底物，对表达后具有较好可溶性的突变体粗酶冻干粉进行测活，其结果参见表3。其余突变体包括W98F、G101L、L206A、F220A、F242A以及219-220和219-222缺失的两个突变体都具有较低的可溶性或几乎完全不可溶表达，因此测得的对各底物的活力均远低于野生型BmEH蛋白。

表3  环氧水解酶突变体粗酶粉对不同底物比活力

为了从机理上了解突变体对萘基缩水甘油醚催化活性提高的原因，我们测定了野生型和突变体M145A与突变体F128A对底物萘基缩水甘油醚的动力学常数。采用实施例4所示测定酶活性的方法，我们测定了突变体与野生型环氧水解酶在不同底物浓度下的活性，利用Origin8.0软件拟合到米氏方程，从而得到它们的动力学常数，其结果如表4所示。

表4  环氧水解酶野生型及突变体对消旋萘基缩水甘油醚的动力学常数

环氧水解酶	kcat(s-1)	KM(mM)	kcat/KM(s-1mM-1)
				Wild type	0.60±0.06	1.3±0.3	0.45±0.12
M145A	19.0±2.7	1.5±0.5	12±5
				F128A	34.1±0.4	0.75±0.24	45±15

分析结果表明突变体K_M值与野生型环氧水解酶相比没有很大程度的变化，而突变体的k_cat值与野生型相比均有几十倍的提高，说明活性提高的主要原因是由于环氧水解酶催化效率的提高。

此外，我们还分别测定了突变体M145A与野生型环氧水解酶对光学纯底物(S)和(R)-萘基缩水甘油醚的动力学常数，其结果如表5所示，

表5  环氧水解酶对光学纯底物的动力学常数

注：E=(k_cat/K_M)_R/(k_cat/K_M)_S

突变体M145A与野生型环氧水解酶对光学纯底物(S)和(R)-萘基缩水甘油醚的动力学常数测定结果表明M145A突变体与野生型相比对两种构型底物的催化活性提高程度不同(k_cat/K_M)，对(R)-构型底物具有更大幅度的活性提高，因此该突变体对R构型底物的对映选择性(E值)有所提高，由野生型的30提高到206。因此M145A突变体与野生型相比对底物萘基缩水甘油醚的活性与选择性都有很大程度的提高，说明该突变体非常适用于萘基缩水甘油醚的水解拆分制备反应。

实施例4环氧水解酶突变体在催化拆分萘基缩水甘油醚合成(S)-普萘洛尔中的应用

(S)-普萘洛尔合成反应路线如附图2所示。消旋萘基缩水甘油醚的合成方法为：取甲萘酚14.4g(0.1M)溶于80ml二氯甲烷中，加入到溶有1.6gPEG400及15g NaOH的100ml水中(250ml三口烧瓶)，45°C冷凝回流机械搅拌1h后加入30ml环氧氯丙烷，用HPLCC18柱监测反应进程。反应20小时后将反应混合物分液，水相用50ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相后用50ml15%NaOH洗涤，分液后有机相用饱和食盐水洗涤两次，加无水硫酸钠干燥，抽滤后旋蒸得粗产品约20克。粗产品用硅胶柱纯化，流动相为石油醚/乙酸乙酯=9/1流动相进行洗脱，可分离得到纯的外消旋萘基缩水甘油醚。

萘基缩水甘油醚酶促拆分：在500ml锥形瓶中磁力搅拌进行拆分反应，反应温度控制在约10°C。反应体系为160ml的磷酸钾缓冲液(100mM，pH7.0，含0.02%Tween-80)，加入由约5g湿细胞破碎所得M145A突变体粗酶，加入含4g消旋萘基缩水甘油醚的40ml异丙醚。用OD-H手性柱监测反应过程中ee_s与ee_p的变化，反应16小时后转化率为52%，ee_s和ee_p分别为99.4%和91.1%，反应进程曲线如图3所示。该图显示：随着拆分反应的进行，R构型萘基缩水甘油醚逐渐转化为其对应的R构型二醇产物，而S构型萘基缩水甘油醚基本未被水解。

反应混合物用乙酸乙酯萃取(150ml×3)后离心分层，合并有机相后加无水Na₂SO₄干燥抽滤，旋转蒸发除去溶剂后上硅胶柱层析，流动相为石油醚/乙酸乙酯=10：1。

(S)-普萘洛尔的合成：分离得到的(S)-萘基缩水甘油醚旋转蒸发除去溶剂后加入50ml异丙胺封管回流，点板监测反应进程，48h后反应结束，旋转蒸发除去异丙胺得粗产物，用正己烷重结晶后得纯(S)-普萘洛尔1.86g，总收率36%(理论最高得率50%)，比旋光度

(c=5.0,EtOH)（文献值

(c=1.0,EtOH)，请参考Bioorg.Med.Chem.Lett.2004,14,4581）。

实施例5环氧水解酶突变体在水解拆分一系列环氧化物中的应用

将实施例2所得到的环氧水解酶各突变体的粗酶粉对广泛的环氧化物底物谱进行了筛选，包括对邻、间、对位具有硝基、甲基和氯取代的苯基缩水甘油醚系列底物，和萘基缩水甘油醚、2-乙基苯基缩水甘油醚、2-烯丙基苯基缩水甘油醚、以及4-环氧乙基甲氧基苯乙酰胺等芳香类环氧化物；邻、间、对位具有硝基和氯取代的氧化苯乙烯系列底物；其中多个可作为洛尔类(β-blocker)药物前体的环氧底物可找到相应的突变体具有优良的催化活性与对映选择性，其中具有突出活性及选择性的结果如表6所示，底物从上到下依次为4-环氧丙氧基咔唑、2-乙基苯基缩水甘油醚、4-环氧丙氧基苯乙酰胺、2-烯丙基苯基缩水甘油醚、对硝基氧化苯乙烯、对氯苯基缩水甘油醚、4-甲砜氨基苯基缩水甘油醚、2-腈基苯基缩水甘油醚、4-羟甲苯基缩水甘油醚、4-甲氧乙基苯基缩水甘油醚、2-烯丙氧基苯基缩水甘油醚、2R,3S-1,2,3,4-四氢萘基-2,3-二醇缩水甘油醚、2-羰基-3,4-二氢喹啉缩水甘油醚、吲哚缩水甘油醚。

表6  环氧水解酶突变体对多种环氧底物拆分效果

上述结果显示本发明所述环氧水解酶突变体与野生型环氧水解酶相比，对不同底物具有更高的催化活性和对映选择性。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是在具有如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位经过取代一个氨基酸且具有环氧水解酶活性的由其衍生的蛋白质。

2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：

所述蛋白质的氨基酸序列中第123位的脯氨酸突变为色氨酸；

所述蛋白质的氨基酸序列中第128位的苯丙氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；

所述蛋白质的氨基酸序列中第144位的酪氨酸突变为苯丙氨酸；

所述蛋白质的氨基酸序列中第145位的甲硫氨酸突变为丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸或缬氨酸；

所述蛋白质的氨基酸序列中第168位的亮氨酸突变为丙氨酸；

所述蛋白质的氨基酸序列中第219位的亮氨酸突变为丙氨酸；

所述蛋白质的氨基酸序列中第221位的脯氨酸突变为甘氨酸。

3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

4.一种包含如权利要求3所述的核酸的重组表达载体。

5.一种包含如权利要求4所述的重组表达载体的重组表达转化体。

6.一种重组环氧水解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：培养如权利要求5所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组环氧水解酶。

7.如权利要求1所述蛋白质或如权利要求5所述重组表达转化体作为催化剂在催化消旋环氧化物水解拆分反应，制备光学纯手性环氧化物以及手性邻位二醇中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述消旋环氧化物的化学通式如式1或式2所示：

式1             式2

其中取代基R为H、羟基、腈基、酰胺基、甲氧乙基、甲砜氨基、烷基、硝基、卤素基团、2,3-芳香基取代、2,3-芳烷杂环基取代或2,3-环状杂烷基取代。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述消旋环氧化物为苯基缩水甘油醚、α-萘基缩水甘油醚、2-乙基-苯基缩水甘油醚、2-烯丙基-苯基缩水甘油醚或对硝基氧化苯乙烯、4-环氧丙氧基咔唑、4-环氧丙氧基苯乙酰胺、对氯苯基缩水甘油醚、4-甲砜氨基苯基缩水甘油醚、2-腈基苯基缩水甘油醚、4-羟甲苯基缩水甘油醚、4-甲氧乙基苯基缩水甘油醚、2-烯丙氧基苯基缩水甘油醚、2R,3S-1,2,3,4-四氢萘基-2,3-二醇缩水甘油醚、2-羰基-3,4-二氢喹啉缩水甘油醚或吲哚缩水甘油醚。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述光学纯手性环氧化物如式3或式4所示：

式3                式4

所述手性邻位二醇的化学通式如式5或式6所示：

式5                  式6

其中取代基R为H、羟基、腈基、酰胺基、甲氧乙基、甲砜氨基、烷基、硝基、卤素基团、2,3-芳香基取代、2,3-芳烷杂环基取代或2,3-环状杂烷基取代。

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