CN103834694B - 羰基还原酶ChKRED20在催化羰基底物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在不对称催化多种前手性羰基底物生成相应手性醇中的用途。该羰基还原酶ChKRED20来源于金黄杆菌（Chryseobacterium？sp.CA49），具有高活力高对映选择性。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种羰基还原酶ChKRED20在不对称催化羰基底物合成手性醇中的用途。
背景技术
羰基还原酶是一类广泛应用于手性醇合成的重要酶类，利用羰基还原酶作为催化剂还原前手性的羰基化合物，可以直接构建光学活性醇的手性中心，从而一步法获得化学反应可能需要多步反应才能得到的手性化合物砌块。当前越来越多的羰基还原酶已用于工业生产手性醇(Nature,2012，485:185-194)。尽管如此，许多羰基还原酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最合适生物催化剂，因此在催化一些结构相似度很高的底物时才能获得较高的对映体过量值和活性。虽然通过蛋白质工程技术可以扩展羰基还原酶的底物谱，但扩展范围有限，这就使酶的应用范围相对较窄。
目前报道的羰基还原酶仅有少数催化前手性酮符合anti-Prelog规则(Bioscience，BiotechnologyandBiochemistry,2011，75：2155-2161)，其中只有少量的文献研究这些羰基还原酶的底物谱(Tetrahedron:Asymmetry，2005，16：2539-2549)。从自然界中筛选的符合anti-Prelog规则的高效羰基还原酶，研究其可以高效高选择性催化的天然底物，可以拓展应用范围，丰富生物催化工具箱，提升该酶在多种化合物合成中的应用潜力，为这些化合物生物合成提供更多高效催化剂的选择。
氟取代的光学醇广泛应用在制药、放射指示剂等材料中，近来年研究者们积极探索以生物催化技术生产这类化合物(TheJournalofOrganicChemistry,2013，78：7312-7317)。研究手性氟取代芳基醇生物催化工艺具有重要意义，可为这些化合物的生产提供新的环保路线。
发明内容
本发明的目的是提供羰基还原酶ChKRED20在催化多种羰基底物中的用途。该酶来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)，具有高活力高对映选择性，该酶核苷酸序列和氨基酸序列及其在催化3,5-双三氟甲基苯乙酮中的应用已申请中国专利：一株金黄杆菌及其羰基还原酶用于阿瑞匹坦手性中间体生产，申请号201310399109.2，申请日2013年9月5日。该酶在NCBI数据库中的登录号为KC342020。
金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)可以在中国典型培养物保藏中心获得，其保藏号为CCTCCM2012484；分类命名为金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)。在已公开的专利申请201310399109.2中已经保藏。
羰基还原酶ChKRED20的基因是通过PCR技术从金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)基因组中克隆获得。通过构建大肠杆菌异源表达体系使该酶过量表达。重组菌构建方法，诱导表达条件和纯化方法已经在申请人在前提交的专利申请(申请号201310399109.2，申请日2013年9月5日)的说明书以及实施例中有详细描述。即步骤为：将羰基还原酶ChKRED20的基因以常规PCR方法克隆，并连入pET28a(+)载体，转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌。挑取单克隆至LB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中，37℃过夜培养，以1％的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中，37℃培养3h，加入0.5mMIPTG诱导后，30℃继续培养至20～36h。
羰基还原酶ChKRED20的纯化采用镍柱亲和层析(Bio-Rad)。将上述诱导培养后的菌体以13,000rpm，4℃离心收集，重悬于BufferA(50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)，超声破碎(超声10s，间隔30s，30次)，之后以13,000rpm，4℃离心20min，将上清液加入已用BufferA平衡的柱料中，轻微混匀30min，用含有20mM咪唑的BufferA漂洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的BufferA的缓冲液洗脱目的蛋白，最后电泳鉴定纯度，并用BCAProteinAssaykit测定蛋白浓度。
本发明提供了羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在不对称催化多种前手性羰基底物生成相应手性醇中的应用，具体地说，这些底物包括如下化学式1、2或3所示的前手性羰基化合物。
化学式1中，R1为H、F、Cl、Br、CF3、CCl3或者CBr3；R2为CH3、C2H5、CH2F、CH2Cl、CH2Br、C2H4F、C2H4Cl、C2H4Br、CF3、CCl3、CBr3或者CH2OH；
化学式2中，R3和R4为F、Cl、Br、CF3、CCl3或者CBr3；R5为CH3、CH2F、CH2Cl或者CH2Br；条件是排除R3和R4为CF3，且分别在苯环上第三、第五位，且R5为CH3；排除R3和R4为F，且分别在苯环上第三、第四位，且R5为CH2Cl。
更优选地，
化学式1中，R1为H，R2为CH3，C2H5，CH2Cl，C2H4Cl，CH2OH，CF3；或者R1为CF3，位置为间位或者对位，R2为CH3；
化学式2中，R3和R4为F，且分别在苯环上第三、第五位，且R5为CH3。
根据现有的知识，任何基因通过DNA突变技术都可以改变其序列，获得突变体，这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。因此，羰基还原酶ChKRED20经等位基因突变或者经添加、插入、缺失或/和取代一个或多个氨基酸且编码具有同等活性蛋白的氨基酸序列同样能作为生物催化剂转化底物上述底物。
上述应用中，所述的催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。羰基还原酶ChKRED20作催化剂时，较佳的反应体系为：磷酸钾缓冲液(pH6.0-8.0，0.1M)，羰基还原酶ChKRED20，NADH(还原型辅酶I)或者NADPH(还原型辅酶Ⅱ)，底物。反应液中较佳的底物浓度为5-100mM，较佳的NADH或者NADPH的浓度为大于等于底物摩尔浓度。较佳的反应温度为25-40℃。反应结束后可按照本领域常规方法提取产物。
根据本领域的常识，本发明中还可以用羰基还原酶ChKRED20重组菌休止细胞或其粗酶液或者冻干粗酶粉等形式作为生物催化剂，同样能达到本发明的效果。
本发明的积极进步效果在于：羰基还原酶ChKRED20催化多种前手性羰基化合物，如苯乙酮、2,2,2-三氟苯乙酮、3’-(三氟甲基)苯乙酮、3',4',5'-三氟苯乙酮等具有很高的立体选择性(ee>99％)和很高活力，为这些手性醇产物合成提供了可供选择的高效、环保的技术路线，具有进一步开发利用的潜力。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明发明内容部分。以下所给出的实施例是为进一步说明本发明的技术特征，并非对本发明的技术方案进行限制。对本发明中的技术方案进行的任何修改或局部替换，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，均应涵盖在本发明的保护范围中。
羰基还原酶ChKRED20重组菌的构建、异源表达、酶的纯化见说明书。粗酶液和冻干粉的制备均为本领域一般方法。即步骤为：将诱导培养的重组菌离心10min(8000rpm，4℃)，以磷酸钾缓冲液(pH7.0，0.1M)洗涤2次，之后重悬于磷酸钾缓冲液中，菌体终浓度为50～150g/L。以超声破碎机破细胞，离心后(13,000rpm，4℃)上清液即为粗酶液。将粗酶液冷冻于-80℃过夜，而后用冷冻干燥机干燥至粉状，制成粗酶粉。
实施例1羰基还原酶ChKRED20还原化学式1所示羰基化合物
(1)R1为H，R2为CH3：
(R，ee值>99％)
羰基还原酶ChKRED20生物催化：反应体系10ml，包括磷酸钾缓冲液(pH6.0，0.1M)，羰基还原酶ChKRED20纯酶0.1mg/ml，NADH20mM，底物10mM(先溶于异丙醇配成10％的母液)。反应条件：30℃，150rpm，24h。
反应结束后，10ml乙酸乙酯萃取。以手性气相色谱测定转化率和产物ee值。气相色谱测定条件：福立FuliGC9790气相色谱仪，氢离子火焰FID检测器，手性柱CP-Chirasil-DEXCBcolumn(Varian，USA)，进样口温度260℃，检测器280℃，柱温115℃，tR＝9.3min，tS＝10.1min。底物的转化率为83％，产物为R构型，ee值为>99％。
(2)R1为H，R2为C2H5：
(R，ee值>99％)
反应体系和条件同实施例1(1)。将产物以10ml乙酸乙酯萃取，将有机相以无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯，加入500ul异丙醇(HPLC级)溶解产物，离心(13，000rpm，5min)获得样品。高压液相色谱测定，手性柱为OJ-H，流动相正己烷：异丙醇＝95：5，流速0.5ml/min，柱温35℃，tS＝16.95min，tR＝18.27min。底物的转化率为7％，产物为R构型，ee值为>99％。
(3)R1为H，R2为C2H4Cl：
(R，ee值>99％)
反应体系和条件同实施例1(1)，产物处理方法和测定条件也同实施例1(1)。tR＝17.23min，tS＝18.20min。底物的转化率为2％，产物为R构型，ee值为>99％。
(4)R1为H，R2为CH2Cl：
(S，ee值>99％)
反应体系和条件同实施例1(1)，产物处理方法和测定条件同实施例1(2)。tR＝34.53min，tS＝38.45min。底物的转化率为72％，产物为S构型，ee值为>99％。
(5)R1为H，R2为CH2OH：
(S，ee值>99％)
反应体系和条件同实施例1(1)，产物处理方法同实施例1(2)。高压液相色谱测定，手性柱为AS-H，流动相正己烷：异丙醇＝90：10，流速0.5ml/min，柱温35℃，tS＝23.40min，tR＝24.43min。底物的转化率为56％，产物为S构型，ee值为>99％。
(6)R1为H，R2为CF3：
(S，ee值>99％)
0.1g底物溶解于4ml异丙醇中，加入磷酸钾缓冲液4ml(0.1M,pH8.0)、NAD+0.05g(氧化型辅酶I)、粗酶液2ml(总蛋白浓度10g/l)。反应条件：150rpm，40℃，24h。而后10ml乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，测定转化率。测定条件同实施例1(1)。tS＝18.3min，tR＝19.7min。底物的转化率为100％，产物为S构型，ee值为>99％。
将有机相旋转蒸发除去乙酸乙酯，并硅胶过柱纯化，得到纯产物，测定产物回收得率为86％。
(7)R1为CF3且该基团在间位，R2为CH3：
(R，ee值>99％)
反应体系和条件同实施例1(6)，产物处理方法和测定条件也同实施例1(6)。tR＝11.3min，tS＝12.9min。底物的转化率为100％，产物为R构型，ee值为>99％。测定产物回收得率为94％。
(8)R1为CF3且该基团在对位，R2为CH3：
(R，ee值>99％)
反应体系和条件同实施例1(1)，产物处理方法和测定条件也同实施例1(1)。tR＝14.3min，tS＝17.2min。底物的转化率为81％，产物为R构型，ee值为>99％。
实施例2羰基还原酶ChKRED20催化化学式2所示羰基化合物
R3和R4均为F，且分别在第3、5位，R5为CH3：
(R，ee值>99％)
(a)以羰基还原酶ChKRED20粗酶液作催化剂：
反应体系和条件同实施例1(6)，产物处理方法同实施例1(6)。气相色谱测定条件：柱温90℃，其余条件同实施例1(1)。tR＝46.2min，tS＝50.5min。底物的转化率为100％，产物为R构型，ee值为>99％。测定产物回收得率为93％。
(b)以羰基还原酶ChKRED20重组菌休止细胞作催化剂：
生物催化体系10ml，包括磷酸钾缓冲液(pH7.0，0.1M)，羰基还原酶ChKRED20重组菌的菌体量150g/l，异丙醇5％(v/v)，葡萄糖2％(w/v)，底物20mM(先溶于异丙醇配成20％的母液)。反应条件：30℃，200rpm，24h。
产物处理方法和测试条件同(a)。底物的转化率为84％，产物为R构型，ee值为>99％。
实施例3羰基还原酶ChKRED20催化化学式3所示羰基化合物
(R，ee值>99％)
以羰基还原酶ChKRED20冻干粗酶粉作催化剂：
生物催化体系10ml，包括磷酸钾缓冲液(pH8.0，0.1M)，羰基还原酶ChKRED20粗酶粉量10g/l，异丙醇40％(v/v)，NAD+为0.2g/l，底物20mM(先溶于异丙醇配成30％的母液)。反应条件：30℃，120rpm，10h。产物处理方法同实施例1(1)。气相色谱测定条件：柱温100℃，其余条件同实施例1(1)。tR＝30.1min，tS＝32.2min。底物的转化率为100％，产物为R构型，ee值为>99％。
Claims (1)
1.一种羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂在不对称催化多种前手性羰基底物生成相应手性醇中的应用，其特征在于，所述底物包括如下化学式1、2或3所示的前手性羰基化合物，
所述化学式1中，R1为H，R2为CH3，C2H5，CH2Cl，C2H4Cl，CH2OH，CF3；或者R1为CF3，位置为化学式1中在苯环上取代基-COR2的间位或者对位，R2为CH3；化学式2中，R3和R4为F，且分别在苯环上第三、第五位，且R5为CH3；
所述羰基还原酶ChKRED20来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)，金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)的保藏号为CCTCCM2012484；并且该酶在NCBI数据库中的登录号为KC342020。
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