CN105671099A - 一种制备光学纯二氟苯基环氧乙烷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物催化和化学反应结合的“一锅两步法”制备光学纯二氟苯基环氧乙烷的方法。该方法首先利用羰基还原酶ChKRED20不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮得到(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇;再在该反应体系中加入强碱性物质,使(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇脱氯后环氧化,得到(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷,ee值>99%。本工艺反应条件简单、温和、高效、专一性强,无副产物,获得的产物浓度高且易于提取分离,具有良好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域,具体涉及一种生物催化和化学反应结合的“一锅两步法”制备手性化合物(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷。该化合物是药物替格瑞洛合成的一种手性中间体。
背景技术
替格瑞洛(ticagrelor),商品名为Brilinta,是由阿斯利康制药公司(AstraZeneca)研制开发的一种新型治疗急性冠状动脉综合征(acutecoronarysyndrome,ACS)的药物。该药物与P2Y12ADP受体可逆性结合,能有效改善ACS患者的症状,降低死亡风险。
目前有许多关于替格瑞洛的合成路线的报道,但绝大多数工艺均涉及一种关键手性中间体(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)-1-环丙胺(化合物A)。专利CN103508899详细总结了该化合物合成的几种路线,其中以WO2008018822报道的路线较为常用,这一路线的关键步骤是合成(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷(该化合物CAS号:1006376-63-1)。专利CN103664697,CN101495442也报道了化合物A及其类似物的合成方法,其路线的关键化合物也是(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷。
已报道的(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷都是以化学合成或者拆分得到。主要有以下三种路线:WO2008018822报道的手性基团的引入是以手性催化剂(S)-二苯基脯氨醇(S-DPPM)将羰基变成手性羟基,再环氧化生成(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷(文献路线1)。专利CN103073525报道了以3,4-二氟苯乙烯为起始物的合成路线(文献路线2)。专利CN103087011以2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮起始物,公开了一种水解动力学拆分路线(文献路线3)。
文献路线1:
文献路线2:
文献路线3:
相对于以上的化学方法,生物催化过程具有高度的化学、区域和立体选择性,反应条件温和,后处理容易,能耗较低,对环境友好,是当今化工生产和相关领域发展的一大潮流。近年来研究者们积极探索各类化合物的生物催化技术,特别是手性中间体。利用生物催化技术与化学方法结合,开发新的工艺合成(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷,实现简化工艺、降低成本、减少污染的目标,从而可有效推动替格瑞洛合成工艺的进一步改进。同时作为手性砌块,也为其他医药中间体合成提供备用资源。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物催化和化学方法相结合的“一锅两步法”生产(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷,具体来说,包括以下步骤:第一步,利用羰基还原酶不对称还原2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮得到(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇;第二步,在该反应体系中加入强碱性物质,使(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇脱氯后环氧化,得到(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷。
本发明的技术方案可用说明书附图说明,现详述如下:
(1)第一步:生物催化反应,是以羰基还原酶ChKRED20作为生物催化剂,2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物,经不对称羰基还原生成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。
所述羰基还原酶ChKRED20,其序列在NCBI数据库中的登录号为KC342020。
所述羰基还原酶ChKRED20的制备方法为该领域常规方法,具体方案见实施例1。
本领域技术人员熟知,所述的催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。反应体系为:磷酸钾缓冲液、羰基还原酶ChKRED20、底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、还原型辅酶NADH(还原型辅酶I)或者NADPH(还原型辅酶Ⅱ)。
或者,反应体系为:磷酸钾缓冲液、羰基还原酶ChKRED20、底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、氧化型辅酶NAD+(氧化型辅酶I)、异丙醇。
所述磷酸钾缓冲液,较佳的pH范围为pH6.0~8.0;所述磷酸钾缓冲液浓度为0.05~0.5M。
反应体系中羰基还原酶ChKRED20的较佳浓度为0.1~20g/l。
反应体系中较佳的底物浓度为0.1~300g/l。
为达到本发明的最佳效果,还原型辅酶NADH或者NADPH的摩尔浓度大于等于反应体系中底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的摩尔浓度。
较佳的氧化型辅酶NAD+的浓度为0.1~0.5g/l。
较佳的异丙醇浓度为5%~75%(异丙醇体积占总反应体系体积的百分比)。
较佳的反应温度为25~45℃。转速为50~200rpm。
根据本领域的公共知识,本发明中还可以用羰基还原酶ChKRED20重组菌休止细胞或者粗酶液或者冻干粗酶粉或者固定化酶等形式作为生物催化剂,同样能达到本发明的效果。以重组菌休止细胞作催化剂时,可用葡萄糖和/或异丙醇代替还原型辅酶(NADH或者NADPH)用于辅酶循环。
根据现有的公共知识,任何基因通过DNA突变技术可以改变其序列,获得突变体,这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。因此,羰基还原酶ChKRED20经等位基因突变或者经添加、插入、缺失或/和取代一个或多个氨基酸且编码具有同等活性蛋白的氨基酸序列,同样能作为生物催化剂转化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮,生成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。
(2)第二步:环氧化,在第一步反应结束后,在反应体系中直接加入强碱,使生物催化获得的产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇进一步脱氯环氧化,生成(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷。
所述的强碱为NaOH或者KOH。先将NaOH或者KOH配制成浓度为5%~20%(w/v)的水溶液,缓慢地加入到反应体系中,并均匀搅拌,之后放置于摇床反应。反应温度为30~50℃,50~200rpm,时间1~2h。
为达到本发明的最佳效果,加入的NaOH或者KOH的总摩尔数为反应体系中底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮摩尔数的1~4倍。
产物的萃取和检测:
反应结束后,在反应体系中加入2~5倍体积的甲基叔丁基醚萃取,将上层有机相取出,以无水硫酸钠干燥,减压旋蒸,得到淡黄色液体,即为产物粗品。经硅胶柱进一步纯化,得到(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷产品。
本发明的有益效果:
(1)本发明设计的“一锅两步法”路线,反应条件简单、温和、高效、专一性强,无副产物,获得的产物浓度高且易于提取分离。本发明投料浓度为150g/l,酶浓度为5g/l时,反应24h,底物的转化率大于99%,获得的中间产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇的对映体过量值(e.e值)大于99%。随后进行第二步环氧化反应时,无需任何纯化,直接在反应体系中加入强碱溶液便可以得到终产物。因此,该工艺简单,底物利用率高,最终反应体系中产物为(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷(e.e值>99%),无其他副产物生成,后续分离纯化过程简便。
(2)可有效降低成本。该工艺的催化剂(羰基还原酶ChKRED20)易于制备,用量少,且以异丙醇为辅酶循环底物,只需加入廉价、少量的氧化型辅酶(NAD+,浓度>0.1g/l即可)便能实现高效辅酶循环。该工艺主要的成本是底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的价格,目前的市场价仅为每千克5000余元。由于化学合成工艺复杂,副产物较多,纯化困难等因素影响,(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷的价格高达每千克14万元。采用本发明工艺,将大大降低(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷的生产成本。
除此之外,(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷还可以作为手性砌块,用于多种下游化合物合成,该化合物的成本的大幅度降低将推动相关下游产品的发展,具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为本发明的技术方案。
具体实施方式
以下结合实施实例对本发明做进一步说明,需要指出的是,本实施例仅用于解释本发明,而非对本发明范围的限制。
实施例1生物催化剂羰基还原酶ChKRED20的制备
羰基还原酶ChKRED20(NCBI登录号:KC342020)重组菌的构建方法、异源表达、酶纯化等为本领域常规方法。以金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)为模板(2012年11月27日在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为NO:CCTCCM2012484),根据羰基还原酶ChKRED20的基因序列设计引物,PCR的方法克隆获得该基因,并连入pET28a(+),转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌。也可以根据羰基还原酶ChKRED20的序列信息在生物合成公司直接合成该基因。
羰基还原酶ChKRED20的诱导表达:挑取单克隆至LB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中,37℃,200rpm,培养16h,以1%的接种量转接至TB(含卡那霉素50μg/ml)培养基中(500ml容量摇瓶装入200ml培养基),37℃,200rpm,培养3h,加入终浓度为0.2mMIPTG诱导后,30℃继续培养至24h。离心(8000rpm,4℃,10min)收集菌体,磷酸钾缓冲溶液(pH7.0、0.1M)洗涤2次,离心,获得湿菌体。
粗酶液和粗酶粉的获得:将上述获得的湿菌体重悬于磷酸钾缓冲液中(pH7.0、0.1M),经高压均质机破碎后,冷冻离心(12000rpm,4℃,20min),得到的上清液即为粗酶液,将其冷冻干燥后获得的酶粉即为粗酶粉。
根据本领域一般常识,上述湿菌体(休止细胞)、粗酶液和粗酶粉均可作为生物催化剂用于底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的催化。
羰基还原酶ChKRED20的纯化采用的是镍柱亲和层析方法(美国Bio-Rad公司产品),按照产品使用说明进行纯化。
实施例2异丙醇浓度对生物催化过程的影响
根据羰基还原酶生物催化的常识,可直接用NADH(NADPH)为辅酶,但是价格昂贵。本发明涉及的羰基还原酶ChKRED20可利用异丙醇作为辅酶循环底物(J.Mol.Catal.B:Enz.2014,102(4):1-8),只需要添加少量廉价的NAD+便可实现辅酶高效循环。本发明生物催化步骤的底物、产物关系可表示如下:
不同异丙醇浓度对底物转化效率的影响:
1ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M)中含有以下组分:羰基还原酶ChKRED20纯酶3mg,底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮0.05g(相当于底物浓度50g/l),NAD+0.2mg,不同异丙醇体积浓度。置于摇床上反应,37℃,200rpm,2h。异丙醇浓度10%时,底物的转化率最高,将其标准化为100%,其余异丙醇浓度时的相对转化率见表1。异丙醇浓度从5%~75%均能获得良好转化率。
表1不同异丙醇浓度的转化率
异丙醇浓度 | 5% | 10% | 20% | 40% | 60% | 70% | 75% |
相对转化率 | 93% | 100% | 95% | 58% | 63% | 54% | 54% |
实施例3高浓度酮底物生物催化制备手性醇
10ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M)中含有以下组分:羰基还原酶ChKRED20粗酶粉90mg,底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮1.5g(相当于底物浓度150g/l),NAD+2mg,异丙醇1ml。置于摇床上反应,40℃,150rpm。20h反应结束,转化率99.6%,ee值>99%。
实施例4“一锅两步法”反应制备光学纯环氧化合物
(1)生物催化过程:
10ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M)中含有以下组分:羰基还原酶ChKRED20粗酶粉80mg,底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮1g(相当于底物浓度100g/l),异丙醇1ml(10%体积浓度),NAD+2mg。置于摇床上反应,35℃,200rpm,12h。
反应结束后,取500μl样品,加入等体积乙酸乙酯萃取,有机相以气相色谱测定其转化率和产物ee值:底物转化率>99%,ee值(对映体过量值)>99%。
气相色谱测定条件:福立FuliGC9790气相色谱仪,氢离子火焰FID检测器,手性柱CP-ChiraSil-DEXCBcolumn(Varian,USA),进样口温度260℃,检测器280℃。测定转化率时柱温150℃,测定产物ee值时柱温90℃。
(2)环氧化:
上述(1)体系中均匀搅拌、缓慢加入NaOH溶液(10%质量浓度)10ml,置于摇床反应,35℃,200rpm,1.5h。
这个环氧化过程加入KOH溶液,也同样能得到本发明的效果。
反应结束后,每次加入甲基叔丁基醚20ml,萃取3次,合并有机相,无水硫酸钠干燥,减压旋蒸,得到淡黄色液体,即为产物粗品。经硅胶柱进一步纯化,得到(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷。
该步骤产物测定:气相色谱测定,福立FuliGC9790气相色谱仪,氢离子火焰FID检测器,手性柱CP-ChiraSil-DEXCBcolumn(Varian,USA),进样口温度260℃,检测器280℃,柱温110℃。
经测定,上述(1)步骤得到的中间产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇已经完全转化(>99%)成最终产物(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷,(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷的ee值>99%。
实施例5制备级反应
100ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M)中含有如下组分:羰基还原酶ChKRED20粗酶粉1.8g,底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮15g(相当于底物浓度150g/l),异丙醇15ml(15%体积浓度),NAD+40mg。置于摇床上反应,38℃,200rpm,24h。
之后搅拌并缓慢加入NaOH溶液(15%质量浓度)50ml,置于摇床反应,40℃,200rpm,2h。
反应结束后,每次加入甲基叔丁基醚100ml,萃取3次,合并有机相,无水硫酸钠干燥,减压旋蒸,得到淡黄色液体,即为产物粗品。经硅胶柱进一步纯化,得到(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷10.95g,产物的收率为89%,纯度>99%,ee值>99%。
Claims (5)
1.一种制备光学纯二氟苯基环氧乙烷的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)生物催化反应,以羰基还原酶作为生物催化剂,2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮为底物,经不对称羰基还原生成(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇。
(2)环氧化,在上述反应体系中加入强碱,使生物催化获得的产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙醇再进一步环氧化,生成(2S)-2-(3,4-二氟苯基)环氧乙烷。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述羰基还原酶为ChKRED20,其在NCBI数据库中的登录号为KC342020。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,生物催化的反应体系为:磷酸钾缓冲液、羰基还原酶ChKRED20、底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、还原型辅酶NADH或者NADPH;或者,反应体系为:磷酸钾缓冲液、羰基还原酶ChKRED20、底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、氧化型辅酶NAD+、异丙醇。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述强碱为NaOH或者KOH。
5.根据权利要求3所述的生物催化体系,其特征在于,所述磷酸钾缓冲液pH范围为pH6.0~8.0,浓度为0.05~0.5M;所述羰基还原酶ChKRED20的浓度为0.1~20g/l;所述底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮浓度为0.1~300g/l;所述还原型辅酶NADH或者NADPH的摩尔浓度大于等于反应体系中底物2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮的摩尔浓度;所述氧化型辅酶NAD+的浓度为0.1~0.5g/l;所述异丙醇体积占总反应体系体积的百分比为5%~75%。
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