CN109439696A - 一种制备（r）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法 - Google Patents

一种制备（r）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法 Download PDF

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chloro
difluorophenyl
ketoreductase
ethyl alcohol
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竺伟
包蕾
胡集铖
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Abstract

本发明涉及酶法制备手性醇，属于基因工程技术用于制备医药中间体的领域。一种制备（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇的方法，2‑氯‑1‑( 3,4‑二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇。该方法通过筛选出特定氨基酸序列的酮还原酶用于催化制备（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇，实现底物99%以上的转化率，所制备的产物ee值为100%。并且后续产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。

Description

一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法
技术领域
本发明涉及一种中间体制备方法，尤其涉及一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法。
背景技术
替格瑞洛是一种血小板聚集抑制剂，其临床疗效和安全性已得到血小板抑制和患者后果结局研究（PLATO研究）及其多项亚组研究的验证和支持。PLATO研究也显示替格瑞洛的疗效明显优于氯吡格雷，所以被国内外多个指南列于一线推荐。替格瑞洛的生产制备、质量分析及相关的生物体实验中，替格瑞洛分子的光学异构体起到重要的标样或对照实验的作用。目前并没有专用于替格瑞洛光学异构体的合成工艺，而是借助于原有的替格瑞洛合成路线，通过改变手性中间体的分子构型，制备出替格瑞洛光学异构体。
替格瑞洛的合成路线如式I：
式I
式II
式II所示的化合物作为制备替格瑞洛的关键中间体，向替格瑞洛分子中引入了手性中心。现有技术中式II所示的手性分子主要通过式III所示的（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇分子经多步反应得到（见专利文件WO2008018822、WO2008018823及Singh A K ；Rao M N;Simpson J H; et al，Org. Process Res . Dev . 2002, 6, 618-620. 及Zhang H ; Liu; zhang L .Y; et al .Bioorg . Med. Chem. Lett., 2012, 22, 3598-3602），因此式III所示（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇分子是替格瑞洛原料药分子手性中心的来源，只需要制备出（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）即可通过现有合成路线制备出替格瑞洛分子的光学异构体。
式III
式VII
但现有技术中并没有一种高效制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）分子的方法，只能通过成本相对比较高的化学法合成消旋体，然后通过HPLC纯化分离得到。这使得（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）制备成本高，收率低，专业性不强。
现有技术中式III的制备工艺如专利CN105969757A、专利CN105671099 A、CN106047828以及文献Appl Microbiol Biotechnol DOI 10.1007/s00253-016-7947-0所记载，这四篇文献给出采用酮还原酶的方法，通过式V制备出（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III）：
式V
但以上文献所记载的酮还原酶只对制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III）具备较高的催化活性，并不适用于（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）的制备。
因此，目前急需一种新的高效制备式VII所示（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇并实现工业化应用的技术，提高该化合物的生产效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法；
本发明的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶及其氨基酸序列；
本发明的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶的基因序列，此基因序列能够编码上述酮还原酶；
本发明的另一个目的在于提供包含上述酮还原酶基因序列的载体及工程菌体；
本发明的最终目的在于提供一种利用酮还原酶催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，该方法能够高效、高纯度的制备出（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。
技术方案
一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，将2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇：
式IV
式IV中，Acetone为丙酮、Isopropylalcohol为异丙醇，所述酮还原酶（KRED）的氨基酸序列如（a）或（b）所述：
（a）、所述酮还原酶具有如表SEQ ID No.2 所记载的氨基酸序列；
（b）、所述酮还原酶为将表SEQ ID No.2 中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶。
进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备85%以上的同源性，且该氨基酸序列所编码的酮还原酶能催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。
进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，优选为具备93%以上的同源性，更优选为具备95%以上的同源性，最优选为具备99%以上的同源性。
进一步，所述酮还原酶的基因如下（c）或（d）：
（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示；
（d）、与（c）具有N%以上的同源性（N选自85、90、95、99），且能编码催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转换为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶的基因。
一种含有上述基因的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。
进一步，上述酮还原酶以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。
进一步，所述酮还原酶催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的工艺步骤包括：将2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞（本技术方案中所述“含有酮还原酶的细胞”是指本技术领域常见的用于生产发酵的工程细菌，比如酵母菌、大肠杆菌等。）、缓冲剂配置成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。
进一步，所述2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮浓度为1～240g/L，优选为100～200g/L，更优选为150～200g/L；
进一步，所述酮还原酶的酶粉使用质量与含有酮还原酶细胞的使用质量之比为1:4～6。即1质量份数的酮还原酶酶粉催化效率相当于4～6质量份数酮还原酶细胞的催化效率。
进一步，所述含有酮还原酶的细胞浓度为10～50g/L，优选为20～40g/L。如果采用酮还原酶酶粉替换酮还原酶细胞，则酮还原酶酶粉的使用浓度为2～10g/L；
进一步，所述水/异丙醇溶液中，水与异丙醇体积比为1:0.3～0.5，优选为1:0.35～0.45；
进一步，反应体系中可以加入辅因子促进反应，当采用含酮还原酶的细胞时，细胞内部含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶；某些情况下制备的酮还原酶酶粉中亦含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶。但反应体系中也可以加入辅酶进一步促进反应进行，当反应体系中加入辅因子促进反应时，所述辅因子选自NAD+、NADH、NADP+和NADPH 的任意一种或它们的组合物，优选为NADP+；所述辅因子浓度为0.02～0.2 g/L，优选为0.08～0.12g/L。
进一步，所述缓冲剂为磷酸-磷酸盐缓冲剂、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂，优选为磷酸-磷酸盐缓冲剂；缓冲剂的pH为6.5～7.5，优选为6.8～7.2；缓冲剂摩尔浓度为0.01～0.5mol/L,优选为0.05～0.2。
进一步，所述催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的反应温度为24～45℃，反应时间为5～36h。
进一步，酮还原酶以酶粉形式、含酮还原酶的细胞破碎液或全细胞的形式参与反应，优选以酶粉形式参与反应。
进一步，本技术方案中，所述酮还原酶为来源于Novosphingobium aromaticivorans的突变体，是通过对N. aromaticivorans的酮还原酶的突变体文库进行筛选后得到的。来源于N. aromaticivorans的野生型酮还原酶在NCBI的登记号为WP_011906790.1。并且本专利中所有的氨基酸序列及其可能对应的基因序列均可通过商业化的全基因合成服务制得。
进一步，所述酮还原酶由基因工程菌发酵得到，所述基因工程菌选自酵母菌、大肠杆菌，其中优选为酵母菌。
有益效果
本发明提供一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，该方法通过筛选出特定氨基酸序列的酮还原酶，用于催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇，使得生产过程在水相高效进行，并且反应的原料转化率超过99%，所制备的产物（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇ee值为100%，能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。解决现有技术中采用化学合成消旋体然后HPLC纯化制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的一系列难题。
附图说明
图1为实施例2所制备产物的HPLC分析谱图；
图2为实施例2所制备产物的手性分析谱图；
图3为实施例3所制备产物的HPLC分析谱图；
图4为实施例4所制备产物的HPLC分析谱图；
图5为实施例5所制备产物的HPLC分析谱图；
图6为实施例6所制备产物的HPLC分析谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。
实施例1 酮还原酶的制备
将含有酮还原酶的编码基因（SEQ ID No.1）的基因工程菌（载体pET21a，宿主细胞E.Coli BL21(DE3)）接种至5mL 含氨苄青霉素的LB 试管培养基中活化培养（37℃培养12h），按1%接种量转接活化培养物至400mL 含氨苄青霉素的LB 液体培养基中，37℃培养OD至0.6-0.8，加入IPTG（终浓度0.1mM）于25℃诱导培养16h。离心收集菌体得到酮还原酶细胞，用40mL 磷酸盐缓冲液（10mM，pH 7.5）重悬菌体后，于冰水浴中超声破碎15min，离心收集上清，-20℃预冻后真空冷冻干燥48h 后碾碎，即得重组酮还原酶酶粉。
实施例2 克级（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（4mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（1.5g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.2g，最后采用磷酸盐缓冲液定容至10mL，25℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在6.9 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率及产物ee 值如附图1、2所示：底物转化率=99.92%，R 型产物ee 值=100%。
实施例3 克级（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（3.5mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（2.0g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞0.28g，最后采用磷酸盐缓冲液定容至10mL，36℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在6.8 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图3、产物ee 值同附图2：底物转化率=99.94%，R 型产物ee 值=100%。
实施例4 克级（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（38 mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（22g），搅拌均匀后加入酮还原酶的酶粉0.7g、辅酶NADP+（10mg），最后采用磷酸盐缓冲液定容至100mL，33℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在7.0 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图4、产物ee 值同附图2：底物转化率=99.96%，R 型产物ee 值=100%。
实施例5 百克级（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（420mL）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（180g），搅拌均匀后加入酮还原酶细胞33g，最后采用磷酸盐缓冲液定容至1.0 L，25℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在7.1 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图5，产物ee 值同附图2：底物转化率=99.91%，R 型产物ee 值=100%。
实施例6 公斤级（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的制备
向反应容器中加入异丙醇（8.4 L）及底物2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮（3.5Kg），搅拌均匀后加入酮还原酶的酶粉0.36Kg、辅酶NADP+（2.5g），最后采用磷酸盐缓冲液定容至20L，40℃下磁力搅拌反应，并采用NaOH（0.5M）控制反应pH 在7.0 左右，同时TLC 检测反应进程。反应结束后硅藻土过滤，液相采用有机相萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压旋干，即得产品。HPLC检测转化率如附图6，产物ee 值同附图2：底物转化率=99.91%，R 型产物ee 值=100%。
序列表
<110> 尚科生物医药（上海）有限公司
<120> 一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatgccgc ttgaaatgac gattgctctc aacaatgtgg tcgccgtcgt caccggcgcg 60
gcgggaggca tcggccgcga actggtcaag gcgatgaagg ccgccaacgc catcgtcatc 120
gccaccgaca tggcgccctc ggccgatgtc gaaggcgcgg accattatct ccagcacgac 180
gtgacgagcg aggccggctg gaaggcggtc gcggcgctgg cccaggaaaa gtacgggcgc 240
gtcgatgcgc tggtgcacaa cgcgggcatc tcgatcgtca cgaagttcga agacactccg 300
ctgtccgatt tccaccgcgt gaacacggtc aacgtcgatt ccatcatcat cggtacgcag 360
gtcctgctgc cgctgctcaa ggaaggcggc aaggcgcgcg cagggggcgc ctcggtggtc 420
aacttctcca gcgtcgcggg tctgcgcggc gcggcgttca atgcggccta ttgcaccagc 480
aaggcggcgg tgaagatgct ctcgaagtgc ctcggcgcgg aattcgcggc gctcggctac 540
aacatccgcg tcaactccgt gcatccgggc ggcatcgata ccccgatgct cggctcgatc 600
atggacaagt acgtcgaact cggcgctgcc ccctcgcgcg aggtggccca ggccgcgatg 660
gaaatgcgcc acccggtggg tcgcatgggt cgccctgccg aaatgggcgg cggcgtggtc 720
tatctctgct ccgacgcagc gagcttcgtc acctgcacgg aattcgtgat ggacggcggc 780
ttcagccagg tctga 795
<210> 2
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Met Met Pro Leu Glu Met Thr Ile Ala Leu Asn Asn Val Val Ala
1 5 10 15
Val Val Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Arg Glu Leu Val Lys Ala
20 25 30
Met Lys Ala Ala Asn Ala Ile Val Ile Ala Thr Asp Met Ala Pro Ser
35 40 45
Ala Asp Val Glu Gly Ala Asp His Tyr Leu Gln His Asp Val Thr Ser
50 55 60
Glu Ala Gly Trp Lys Ala Val Ala Ala Leu Ala Gln Glu Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Arg Val Asp Ala Leu Val His Asn Ala Gly Ile Ser Ile Val Thr Lys
85 90 95
Phe Glu Asp Thr Pro Leu Ser Asp Phe His Arg Val Asn Thr Val Asn
100 105 110
Val Asp Ser Ile Ile Ile Gly Thr Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Lys
115 120 125
Glu Gly Gly Lys Ala Arg Ala Gly Gly Ala Ser Val Val Asn Phe Ser
130 135 140
Ser Val Ala Gly Leu Arg Gly Ala Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Cys Thr
145 150 155 160
Ser Lys Ala Ala Val Lys Met Leu Ser Lys Cys Leu Gly Ala Glu Phe
165 170 175
Ala Ala Leu Gly Tyr Asn Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Gly
180 185 190
Ile Asp Thr Pro Met Leu Gly Ser Ile Met Asp Lys Tyr Val Glu Leu
195 200 205
Gly Ala Ala Pro Ser Arg Glu Val Ala Gln Ala Ala Met Glu Met Arg
210 215 220
His Pro Val Gly Arg Met Gly Arg Pro Ala Glu Met Gly Gly Gly Val
225 230 235 240
Val Tyr Leu Cys Ser Asp Ala Ala Ser Phe Val Thr Cys Thr Glu Phe
245 250 255
Val Met Asp Gly Gly Phe Ser Gln Val
260 265

Claims (10)

1.一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如（a）或（b）所述：
（a）、所述酮还原酶具有如表SEQ ID No.2 所记载的氨基酸序列；
（b）、所述酮还原酶为将表SEQ ID No.2 中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶。
2.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，且能催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。
3.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：所述酮还原酶的基因序列如下（c）或（d）所示：
（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID No.1所示基因序列；
（d）、与（c）具有90%以上的同源性，且能催化2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶的基因序列。
4.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇，步骤包括：将2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞、缓冲剂一起配置成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。
5.如权利要求4所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：所述2-氯-1-( 3 ,4-二氟苯基)乙酮浓度为1～200g/L；酮还原酶酶粉浓度为2～10g/L或含有酮还原酶的细胞的浓度为10～50g/L。
6.如权利要求4所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：所述水/异丙醇溶液中水与异丙醇体积比为1:0.3～0.5。
7.如权利要求4所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：反应温度为24～45℃。
8.如权利要求4所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：反应时间为5～36h。
9.如权利要求4所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：反应液中还添加有辅因子，所述辅因子选自NAD+、NADH、NADP+和NADPH 的任意一种或它们的组合物。
10.如权利要求4所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：所述含有酮还原酶的细胞选自基因工程改造的酵母菌或大肠杆菌。
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