CN111057725A - 酮还原酶在制备(s)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的用途及制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种(S)‑1,1‑二(4‑氟苯基)‑2‑丙醇的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在反应体系中，利用酮还原酶催化式2化合物即得式1化合物：(S)‑1,1‑二(4‑氟苯基)‑2‑丙醇，所述式2化合物的结构式如说明书中所述。本发明还提供了一种酮还原酶、所述式2化合物、1,1‑二(4‑氟苯基)‑1,2‑丙二醇、和/或乳酸乙酯在制备(S)‑1,1‑二(4‑氟苯基‑2‑丙醇)或吡啶酰胺类杀菌剂Florylpicoxamid中的用途。本发明所述的制备方法用酶催化的方法替代现有技术中的化学方法，使用原料成本降低，生产工艺更加环境友好，所制备得到的产品立体选择性高。

Description

酮还原酶在制备(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的用途及 制备

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种酮还原酶在制备(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇中的用途及制备的方法。

背景技术

Florylpicoxamid是陶氏益农公司开发的第2代吡啶酰胺类杀菌剂，该产品可用于作物多个生长阶段，并能提高作物产量和品质。Florylpicoxamid的结构式如下式A所示。

WO2018009618A1报道了Florylpicoxamid的制备方法，具体过程如图1所示，具体为：(R)-乳酸乙酯与对氟苯基溴化镁反应制得化合物H，化合物H经还原成化合物K，K再与G酯化为L，L再经水解，与吡啶羧酸化合物B酰胺化得到Florylpicoxamid。其中K化合物(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇是其重要中间体，此方法中采用化学还原手性H化合物制得化合物K的方法，此方法中采用化学还原方法，采用原料手性乳酸乙酯，还原剂和TFA-DCM(三氟乙酸-二氯甲烷)价格较高，且环境污染严重，因此寻找成本较低，环境友好，高效的制备中间体(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的方法至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有的制备(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的方法原料成本高、环境污染严重等问题，因此本发明提供了一种(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的制备方法及酮还原酶在制备(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的用途。本发明所述的制备方法用酶催化的方法替代现有技术中的化学方法，使用原料成本降低，生产工艺更加环境友好，所制备得到的产品立体选择性高。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在反应体系中，利用酮还原酶催化式2化合物即得式1化合物：(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇；

较佳地，所述酮还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae S288C的酮还原酶。更佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或其突变所示；其中所述突变在如SEQID NO:7所示的氨基酸序列上具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入，并且保持或改善了所述酮还原酶的功能；所述突变的氨基酸序列优选与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％更优选至少99％的序列同源性。进一步更佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列由如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列编码。

较佳地，所述酮还原酶的浓度为0.5-5U/mL，更佳地，所述酮还原酶的浓度为1.90U/mL。

较佳地，所述式2化合物的浓度为10-100g/L；更佳地，所述式2化合物的浓度为50g/L。

较佳地，所述反应体系中还包括还原型辅酶。

更佳地，所述还原型辅酶优选NADH、NADPH和/或FADH₂。

更佳地，所述还原型辅酶的浓度优选0.5～5mM；更优选1mM。

更佳地，所述NADH和/或NADPH由以下步骤制备：在脱氢酶以及供氢体的存在下，将NAD⁺和/或NADP⁺进行还原反应即可。其中：

所述的脱氢酶优选为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；和/或，所述的供氢体优选为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐。

进一步更佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。

较佳地，所述的脱氢酶的浓度为10-100U/mL，优选20-30U/mL，例如26.48U/mL。

较佳地，所述氧化型辅酶NAD⁺或NADP⁺的浓度为0.5-5mM，优选1mM。

较佳地，所述的供氢体与所述式2化合物的摩尔比为1:1-10:1，优选5:1。

较佳地，所述醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

较佳地，所述反应体系还包括缓冲液。

更佳地，所述缓冲液为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

更佳地，所述缓冲液的浓度为20-200mM。

更佳地，所述缓冲液的pH 6.5-7.5。

进一步更佳地，所述缓冲液的浓度为100mM，

进一步更佳地，所述缓冲液的pH为7.0。

较佳地，所述反应体系还包括助溶剂，例如DMSO(二甲基亚砜)，所述助溶剂的体积在反应体系中占5-10％。本发明中，所述助溶剂的添加量越少越好，因为所述助溶剂有时候可能会破坏酶的活性，使酶活降低。

较佳地，所述制备方法还包括以下条件：

所述催化的温度为20-40℃，优选30℃；

和/或，所述催化在摇床进行，所述摇床的转速为50-300rpm，优选200rpm；

和/或，所述催化的时间为10-72小时，优选22小时；

和/或，所述催化后还包括萃取并旋干的过程，所述萃取优选用乙酸乙酯萃取。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇、乳酸乙酯、上述的酮还原酶和/或上述的式2化合物在制备(S)-1,1-二(4-氟苯基-2-丙醇)中的用途。

较佳地，所述的酮还原酶通过催化上述式2化合物制备得到所述的(S)-1,1-二(4-氟苯基-2-丙醇)。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇、乳酸乙酯、上述的酮还原酶和/或上述的式2化合物在制备吡啶酰胺类杀菌剂Florylpicoxamid中的用途。

较佳地，所述的酮还原酶通过催化上述式2化合物制备得到(S)-1,1-二(4-氟苯基-2-丙醇)；再由(S)-1,1-二(4-氟苯基-2-丙醇)制备得到所述的吡啶酰胺类杀菌剂Florylpicoxamid。

以上化合物所述浓度若无特殊说明，均为反应前所述化合物占整个反应体系的终浓度。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述的制备方法用酶催化的方法替代现有技术中的化学方法，使用原料成本降低，生产工艺更加环境友好，所制备得到的产品立体选择性高。

附图说明

图1为现有技术中Florylpicoxamid的制备方法的具体过程图。

图2为式1化合物消旋体(1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇)对照品的手性HPLC图谱。

图3为实施例5中反应结束后产物ee值测定HPLC图谱。

图4为底物式2化合物的HPLC图谱。

图5为产物消旋体的HPLC图谱。

图6为反应结束后反应液的HPLC图谱。

图7为合成的式1化合物(1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇)的消旋体的HNMR图谱。

图8为实施例2和实施例4中的电泳图结果。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中，式1化合物((S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇)的手性分析通过高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)进行，具体的分析方法为：

色谱柱：Daicel Chiralpak IG(4.6mm*250mm，5μm)；流动相为：正己烷：乙醇＝90:10；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；25mg样品，乙醇稀释至50ml，进样5μL分析。

反应液中底物式2化合物(1,1-二(4-氟苯基)-2-丙酮)浓度的检测通过高效液相色谱进行，具体的分析方法为：

色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(3.5μm，150×4.6mm)，流动相A：0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液，流动相B：0.1％TFA乙腈溶液，梯度洗脱：0min(90％A+10％B)，10min(100％B)，11min(100％B)，11.5min(90％A+10％B)，16min(90％A+10％B)；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃。

pET28a购买自Novagen公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；NAD+，NADP+，NADH，NADPH购买自深圳邦泰生物工程有限公司。乳酸乙酯，对氟苯基溴化镁购买自上海泰坦化学有限公司。

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

实施例1底物式2化合物的合成

在0-5℃下，向含有1.5g乳酸乙酯(1.0eq)的THF(四氢呋喃，15mL)溶液中滴加0.8mol/L的对氟苯基溴化镁55.6mL(3.5eq)，加毕，加热回流1.5h，随后降温至室温(一般为10-30℃，优选25℃)并在该温度下搅拌过夜。TLC(薄层色谱分析)显示原料消失反应结束，将反应液倒入冰水预冷好的40％(质量比)乙酸水溶液(10mL)淬灭并搅拌10min，接着加入EA(乙酸乙酯，20mL)分两次萃取，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到4.6g粗品式3化合物(1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇)。无需纯化直接投下一步。

将上述得到的粗品式3化合物在冰水浴下冷却到0-5℃，然后慢慢滴加浓H₂SO₄(20mL)，加毕，在该温度下搅拌2h。TLC显示原料消失反应结束，将反应液倒入碎冰中(20g)，搅拌10min，随后加入乙酸乙酯(100mL)分三次萃取，有机相合并，且用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得粗品，经快速柱纯化得式2化合物(2.4g)，两步收率77％。

式2化合物的HNMR图谱数据为：¹HNMR(400MHz,CHCl₃-d6)δ7.25-7.15(m，4H)，7.04-7.00(m，4H)，5.08(s，1H)，2.24(s，3H)。图4为式2化合物的HPLC图谱。从HNMR数据判断该实施例得到的是式2化合物。

实施例2 KRED酶的制备

2.1KRED酶(Ketoreductase，酮还原酶)基因的获取

根据编码NCBI上已报道的酮还原酶的基因序列(详见表1)SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14全基因合成KRED基因。

表1不同来源的KRED酶氨基酸序列和核苷酸序列

2.2KRED酶的制备

合成的KRED基因连接到pET28a载体上，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有KRED基因的工程菌株。

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

将含有KRED基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。

将收集到的上述菌体2g，用50mM pH 7.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于30mL的50mM pH 7.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，均质液离心去除沉淀，得到的上清液为KRED粗酶液，置于-20℃冰箱中保存，待用。

分别取5μL均质液和均质液上清进行蛋白电泳检测，电泳图如图8的左侧部分所示。蛋白电泳方法参考《分子克隆实验指南》(科学出版社第三版)。

MK：标准分子量蛋白；A：均质液即全菌；S：均质上清即可溶蛋白

根据电泳图可以看出，只有K083表达较弱，其他蛋白表达量都很好且都为可溶性蛋白，可以进行酶催化反应。

2.3酶活测定

将2.2中制备的均质液上清用于酶活测定。

酶活检测方法：1mL反应体系，30℃条件下，先加980μL的pH 7.0 50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含实施例1中制得的底物式2化合物50mM和助溶剂DMSO 10％)，再加10μL NADPH(25mM)，最后加10μL适量的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值。计算KRED的酶活，结果见表2。

单位酶活定义：在特定反应条件(30℃，pH 7.0)下，每分钟消耗1μmol NADPH所需要的酶量。

表2酶活结果

实施例3醇脱氢酶基因的获取和表达

根据来源于枯草芽胞杆菌(LactobacillusbrevisKB290)(Genbank登录号为BAN05992.1)的Cyclopentanol dehydrogenase基因序列(如SEQ ID NO:15所示)，全基因合成醇脱氢酶基因。

醇脱氢酶基因连接pET28a载体，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有醇脱氢酶基因的工程菌株。将含有醇脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。

实施例4醇脱氢酶粗酶液的制备及酶活测定

将实施例3中收集到的菌体6g，用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于30mL的50mM pH 7.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，均质液离心去除沉淀，得到的上清液为含醇脱氢酶粗酶液。

分别取5μL均质液和均质液上清进行蛋白电泳检测，电泳图如图8的右侧所示。根据电泳图可以看出，醇脱氢酶很好的表达，可以进行酶催化反应。

酶活检测方法：1mL反应体系，25℃条件下，先加980μL的pH 7.0 50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(含异丙醇200mM)，再加10μL NADP⁺(25mM)，最后加10μL适量的酶液，紫外分光光度计测定340nm处OD值。根据此方法测得酶活为132.4U/mL。

单位酶活定义：在特定反应条件(25℃，pH 7.0)下，每分钟产生1μmol NADPH所需要的酶量。

实施例5 KRED酶用于制备式1化合物

10mL反应体系中，加入0.5g实施例1中制得的底物式2化合物，异丙醇0.63g，DMSO500μL，NAD⁺/NADP⁺的终浓度为1mM，实施例4中制得的醇脱氢酶(酶活为132.4U/mL)2mL，实施例2中制得的KRED酶液2mL，加入0.1M pH为7.0的磷酸缓冲液，30℃摇床200rpm反应，反应22h后，HPLC检测产物生成量及ee值(对映体过量)。乙酸乙酯萃取并旋干产物。

图3是为以K014为例，测得的反应结束后，所得产物的手性HPLC图谱，保留时间8.307min为其出峰位置。式1化合物(1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇)的消旋体对照品(为本实验室自行合成，其HNMR图谱见图7)的手性HPLC图谱为图2，保留时间为8.311min和11.197min。8.307min和8.311min出峰位置一致，因此可知该反应得到了1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇。

图4为底物式2化合物(实施例1中合成)的HPLC图谱，保留时间9.551min为其出峰位置，图5为产物消旋体(即式1化合物的消旋体对照品)的HPLC图谱，保留时间8.873min为其出峰位置，图6为反应结束后反应液的HPLC图谱，保留时间分别为9.551min和8.871min，与底物、产物的出峰位置相一致，也同样说明反应得到了1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇，且测得转化率为51％。

以甲醇和氯仿分别为溶剂，测定所得产物的旋光值为-33°和-17.9°，根据参考文献Journal of Organic Chemistry,Vol.68，nb.11，2003，4600-4603和Tetrahedron，vol.33，1977，507-510，进一步可知所得产物为S构型，即产物为(S)-1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇。因此，使用KRED酶K014制得的式1化合物构型正确。

表3不同来源的KRED酶制备式1化合物的转化率和ee值比较

结论：如上表3所示，Saccharomyces cerevisiae S288C的KRED酶K014获得了51％的转化率与99.7％的ee值。其他六种KRED酶均无法转化获得目标产物式1化合物。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司

<120> 酮还原酶在制备(S)-1, 1-二（4-氟苯基）-2-丙醇的用途及制备

<130> P19010683C

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 282

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae S228C

<400> 1

Met Val Pro Lys Phe Tyr Lys Leu Ser Asn Gly Phe Lys Ile Pro Ser

1 5 10 15

Ile Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Ile Pro Arg Ser Gln Thr Ala Glu Ile

20 25 30

Val Tyr Glu Gly Val Lys Cys Gly Tyr Arg His Phe Asp Thr Ala Val

35 40 45

Leu Tyr Gly Asn Glu Lys Glu Val Gly Asp Gly Ile Ile Lys Trp Leu

50 55 60

Asn Glu Asp Pro Gly Asn His Lys Arg Glu Glu Ile Phe Tyr Thr Thr

65 70 75 80

Lys Leu Trp Asn Ser Gln Asn Gly Tyr Lys Arg Ala Lys Ala Ala Ile

85 90 95

Arg Gln Cys Leu Asn Glu Val Ser Gly Leu Gln Tyr Ile Asp Leu Leu

100 105 110

Leu Ile His Ser Pro Leu Glu Gly Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Trp

115 120 125

Arg Ala Met Gln Glu Ala Val Asp Glu Gly Leu Val Lys Ser Ile Gly

130 135 140

Val Ser Asn Tyr Gly Lys Lys His Ile Asp Glu Leu Leu Asn Trp Pro

145 150 155 160

Glu Leu Lys His Lys Pro Val Val Asn Gln Ile Glu Ile Ser Pro Trp

165 170 175

Ile Met Arg Gln Glu Leu Ala Asp Tyr Cys Lys Ser Lys Gly Leu Val

180 185 190

Val Glu Ala Phe Ala Pro Leu Cys His Gly Tyr Lys Met Thr Asn Pro

195 200 205

Asp Leu Leu Lys Val Cys Lys Glu Val Asp Arg Asn Pro Gly Gln Val

210 215 220

Leu Ile Arg Trp Ser Leu Gln His Gly Tyr Leu Pro Leu Pro Lys Thr

225 230 235 240

Lys Thr Val Lys Arg Leu Glu Gly Asn Leu Ala Ala Tyr Asn Phe Glu

245 250 255

Leu Ser Asp Glu Gln Met Lys Phe Leu Asp His Pro Asp Ala Tyr Glu

260 265 270

Pro Thr Asp Trp Glu Cys Thr Asp Ala Pro

275 280

<210> 2

<211> 846

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae S228C

<400> 2

atggttccga aattttataa actgagcaat ggttttaaaa ttcctagcat tgcactgggt 60

acctatgata ttccgcgtag ccagaccgcc gaaattgttt atgaaggtgt gaaatgtggt 120

tatcgtcatt ttgataccgc agttctgtat ggtaatgaaa aagaagttgg tgatggtatt 180

attaaatggc tgaatgaaga tccgggcaat cataaacgtg aagaaatctt ttataccacc 240

aaactgtgga atagccagaa tggttataaa cgtgcaaaag cagccattcg tcagtgtctg 300

aatgaagtta gtggtctgca gtatattgat ctgctgctga ttcatagccc gctggaaggc 360

agtaaactgc gtctggaaac ctggcgcgca atgcaggaag cagttgatga aggcctggtg 420

aaaagcattg gtgttagcaa ttatggtaaa aaacatattg atgaactgct gaattggccg 480

gaactgaaac ataaaccggt ggttaatcag attgaaatta gcccgtggat tatgcgtcag 540

gaactggccg attattgtaa aagtaaaggt ctggttgttg aagcatttgc accgctgtgt 600

catggttata aaatgaccaa tccggatctg ctgaaagttt gtaaagaagt tgatcgtaat 660

ccgggtcagg ttctgattcg ttggagcctg cagcatggtt atctgccgct gccgaaaacc 720

aaaaccgtta aacgtctgga aggtaatctg gcagcctata attttgaact gagtgatgaa 780

cagatgaaat ttctggatca tccggatgcc tatgaaccga ccgattggga atgtaccgat 840

gcaccg 846

<210> 3

<211> 312

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<213> Saccharomyces cerevisiae S228C

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Asn Asp Ala Tyr Lys Ala Val Leu Thr Ala Leu Lys Asp Gly Tyr Arg

35 40 45

His Ile Asp Thr Ala Ala Ile Tyr Arg Asn Glu Asp Gln Val Gly Gln

50 55 60

Ala Ile Lys Asp Ser Gly Val Pro Arg Glu Glu Ile Phe Val Thr Thr

65 70 75 80

Lys Leu Trp Cys Thr Gln His His Glu Pro Glu Val Ala Leu Asp Gln

85 90 95

Ser Leu Lys Arg Leu Gly Leu Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Met His

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Trp Pro Ala Arg Leu Asp Pro Ala Tyr Ile Lys Asn Glu Asp Ile Leu

115 120 125

Ser Val Pro Thr Lys Lys Asp Gly Ser Arg Ala Val Asp Ile Thr Asn

130 135 140

Trp Asn Phe Ile Lys Thr Trp Glu Leu Met Gln Glu Leu Pro Lys Thr

145 150 155 160

Gly Lys Thr Lys Ala Val Gly Val Ser Asn Phe Ser Ile Asn Asn Leu

165 170 175

Lys Asp Leu Leu Ala Ser Gln Gly Asn Lys Leu Thr Pro Ala Ala Asn

180 185 190

Gln Val Glu Ile His Pro Leu Leu Pro Gln Asp Glu Leu Ile Asn Phe

195 200 205

Cys Lys Ser Lys Gly Ile Val Val Glu Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser

210 215 220

Thr Asp Ala Pro Leu Leu Lys Glu Pro Val Ile Leu Glu Ile Ala Lys

225 230 235 240

Lys Asn Asn Val Gln Pro Gly His Val Val Ile Ser Trp His Val Gln

245 250 255

Arg Gly Tyr Val Val Leu Pro Lys Ser Val Asn Pro Asp Arg Ile Lys

260 265 270

Thr Asn Arg Lys Ile Phe Thr Leu Ser Thr Glu Asp Phe Glu Ala Ile

275 280 285

Asn Asn Ile Ser Lys Glu Lys Gly Glu Lys Arg Val Val His Pro Asn

290 295 300

Trp Ser Pro Phe Glu Val Phe Lys

305 310

<210> 4

<211> 936

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae S228C

<400> 4

atgccggcca ccctgcatga tagcaccaaa attctgagcc tgaataccgg tgcacagatt 60

ccgcagattg gtctgggtac ctggcagtca aaagaaaatg atgcctataa agcagtgctg 120

acagccctga aagatggtta tcgccatatt gataccgcag caatttatcg caatgaagat 180

caggttggtc aggcaattaa agatagcggt gttccgcgtg aagaaatttt tgtgaccacc 240

aaactgtggt gtacgcagca tcatgaaccg gaagtggccc tggatcagtc actgaaacgt 300

ctgggtctgg attatgtgga tctgtatctg atgcattggc cggcacgtct tgatccggcc 360

tatattaaaa atgaagatat tctgagcgtt ccgacgaaaa aagatggtag ccgtgccgtt 420

gatattacca attggaattt tattaaaacc tgggaactga tgcaggaact gccgaaaacc 480

ggtaaaacga aagccgtggg tgtttcaaat ttttcaatta ataatctgaa agatctgctg 540

gccagccagg gtaataaact gaccccggca gccaatcagg ttgaaattca tccgctgctg 600

ccgcaggatg aactgattaa tttttgtaaa agcaaaggca ttgttgttga agcatatagc 660

ccgctgggta gcaccgatgc cccgctgctg aaagaaccgg tgattctgga aattgcgaag 720

aaaaataatg ttcagccggg tcatgtggtt attagctggc atgtgcagcg cggttatgtt 780

gttctgccga aaagcgtgaa tccggatcgc attaaaacca atcgtaaaat ttttaccctg 840

agcaccgaag attttgaagc aattaataat attagcaaag aaaaaggtga aaaacgcgtg 900

gtgcatccga attggagccc gtttgaagtt tttaaa 936

<210> 5

<211> 347

<212> PRT

<213> Gordonia rubripertincta NBRC 101908

<400> 5

Met Lys Ala Ile Gln Ile Ile Gln Pro Gly Lys Pro Pro Glu Leu Arg

1 5 10 15

Glu Val Glu Lys Pro Thr Pro Arg Pro Gly Gln Val Leu Leu Lys Val

20 25 30

Thr Ala Ala Gly Ala Cys His Ser Asp Asp Phe Val Leu Asn Leu Pro

35 40 45

Glu Glu Gly Phe Pro Tyr Pro Leu Pro Met Thr Leu Gly His Glu Gly

50 55 60

Ala Gly Val Val Ala Glu Val Gly Thr Gly Val Thr Gly Ile Ser Glu

65 70 75 80

Gly Thr Ser Val Ala Val Tyr Gly Ala Trp Gly Cys Gly Val Cys His

85 90 95

Phe Cys Ala Arg Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gly Glu Leu

100 105 110

Gly Ile Thr Pro Pro Gly Leu Gly Asn Pro Gly Ala Met Ala Glu Tyr

115 120 125

Leu Leu Val Asp Asp Ala Arg His Leu Val Pro Leu Gly Asp Leu Asp

130 135 140

Pro Val Ala Ala Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His

145 150 155 160

Ala Ile Lys Pro Ser Leu Pro Lys Leu Val Gly Gly Thr Thr Ala Val

165 170 175

Val Ile Gly Ala Gly Gly Leu Gly His Val Gly Ile Gln Leu Leu Arg

180 185 190

His Leu Thr Pro Ser Arg Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Asp Asp Lys

195 200 205

Leu Ala Phe Ala Arg Glu Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp

210 215 220

Ala Asp Ala Val Ala Asn Val Arg Lys Ile Thr Gly Asn Asp Gly Ala

225 230 235 240

Thr Ala Val Phe Asp Phe Val Gly Leu Gln Pro Thr Leu Asp Ile Ala

245 250 255

Met Gly Val Val Gly Thr Met Gly Asp Val Val Ile Val Gly Ile Gly

260 265 270

Asp Met Val Ala Thr Ala Lys Val Gly Phe Phe Thr Gln Pro Tyr Glu

275 280 285

Val Ser Val Arg Ala Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asp Glu Leu Ile Glu

290 295 300

Val Leu Asp Leu Ala Arg Asp Gly Val Leu Glu Val Ala Val Glu Arg

305 310 315 320

Phe Ser Leu Asp Asp Gly Val Glu Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Ala Asn

325 330 335

Asp Leu Arg Gly Arg Ala Val Val Val Pro Asp

340 345

<210> 6

<211> 1041

<212> DNA

<213> Gordonia rubripertincta NBRC 101908

<400> 6

atgaaggcca ttcagatcat ccagccgggc aaaccgccgg agctgcgcga ggtcgagaaa 60

cccacgccgc gtcccgggca ggtgttgctg aaggtgacgg cagccggcgc ctgccattcg 120

gacgacttcg tcctcaacct gcccgaggaa ggattcccct atcccctgcc gatgacgctc 180

ggccacgaag gggccggcgt ggtcgccgag gtcggtaccg gcgtcaccgg catctccgag 240

ggcacctcgg tggccgtgta cggagcctgg ggttgcggcg tctgtcactt ctgcgcccgc 300

ggcctggaga actactgcag ccgagccggc gaactcggca tcaccccacc gggtctcggc 360

aacccgggcg cgatggccga gtacctgctc gtggacgacg cacggcatct ggtgccgctc 420

ggtgacctcg acccggtggc tgcagtccca ctcaccgatg ccggcctcac gccctaccac 480

gcgatcaaac cctcgcttcc gaagctggtc ggcggcacca cggcagtggt catcggagcc 540

ggtggtctcg ggcatgtcgg gatccaactg cttcgccacc tgaccccgtc ccgggtgatc 600

gctctcgacg tgagcgacga caagctcgcg ttcgcgcgcg aggtcggggc tcacgaggtg 660

gtgctctccg acgccgatgc cgtcgcgaac gtccgcaaga tcaccggcaa cgatggtgcg 720

accgccgtct tcgacttcgt cgggctgcaa cccacgctcg acatcgcgat gggcgtcgtc 780

gggaccatgg gtgacgtggt gatcgtgggc atcggtgaca tggtcgccac ggcgaaggtc 840

ggcttcttca cccagcccta cgaggtgtcg gtacgcgcgc cgtactgggg ggcgcgcgac 900

gaactcatcg aggtgctgga tctcgcacgc gatggggttc tcgaggtggc ggtcgaacga 960

ttctcactcg atgacggcgt cgaggcctac cggcgactgg ccgccaatga ccttcgaggg 1020

cgagcagtcg tggtgcctga c 1041

<210> 7

<211> 376

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae S288C

<400> 7

Met Thr Asp Leu Phe Lys Pro Leu Pro Glu Pro Pro Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Arg Leu Arg Val Leu Ser Lys Thr Ala Gly Ile Arg Val Ser Pro Leu

20 25 30

Ile Leu Gly Gly Ala Ser Ile Gly Asp Ala Trp Ser Gly Phe Met Gly

35 40 45

Ser Met Asn Lys Glu Gln Ala Phe Glu Leu Leu Asp Ala Phe Tyr Glu

50 55 60

Ala Gly Gly Asn Cys Ile Asp Thr Ala Asn Ser Tyr Gln Asn Glu Glu

65 70 75 80

Ser Glu Ile Trp Ile Gly Glu Trp Met Ala Ser Arg Lys Leu Arg Asp

85 90 95

Gln Ile Val Ile Ala Thr Lys Phe Thr Gly Asp Tyr Lys Lys Tyr Glu

100 105 110

Val Gly Gly Gly Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Gly Asn His Lys Arg Ser

115 120 125

Leu His Val Ser Val Arg Asp Ser Leu Arg Lys Leu Gln Thr Asp Trp

130 135 140

Ile Asp Ile Leu Tyr Ile His Trp Trp Asp Tyr Met Ser Ser Ile Glu

145 150 155 160

Glu Val Met Asp Ser Leu His Ile Leu Val Gln Gln Gly Lys Val Leu

165 170 175

Tyr Leu Gly Val Ser Asp Thr Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala Asn

180 185 190

Tyr Tyr Ala Thr Ser His Gly Lys Thr Pro Phe Ser Val Tyr Gln Gly

195 200 205

Lys Trp Asn Val Leu Asn Arg Asp Phe Glu Arg Asp Ile Ile Pro Met

210 215 220

Ala Arg His Phe Gly Met Ala Leu Ala Pro Trp Asp Val Met Gly Gly

225 230 235 240

Gly Arg Phe Gln Ser Lys Lys Ala Met Glu Glu Arg Lys Lys Asn Gly

245 250 255

Glu Gly Leu Arg Thr Phe Val Gly Gly Pro Glu Gln Thr Glu Leu Glu

260 265 270

Val Lys Ile Ser Glu Ala Leu Thr Lys Ile Ala Glu Glu His Gly Thr

275 280 285

Glu Ser Val Thr Ala Ile Ala Ile Ala Tyr Val Arg Ser Lys Ala Lys

290 295 300

Asn Val Phe Pro Leu Ile Gly Gly Arg Lys Ile Glu His Leu Lys Gln

305 310 315 320

Asn Ile Glu Ala Leu Ser Ile Lys Leu Thr Pro Glu Gln Ile Glu Tyr

325 330 335

Leu Glu Ser Ile Val Pro Phe Asp Val Gly Phe Pro Lys Ser Leu Ile

340 345 350

Gly Asp Asp Pro Ala Val Thr Lys Lys Leu Ser Pro Leu Thr Ser Met

355 360 365

Ser Ala Arg Ile Ala Phe Asp Asn

370 375

<210> 8

<211> 1128

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae S228C

<400> 8

atgaccgacc tgtttaaacc gctgccggaa ccgccgaccg aactgggtcg tctgcgtgtt 60

ctgagtaaaa ccgcgggcat tcgtgtgagc ccgctgattc tgggcggcgc cagcattggt 120

gatgcctgga gcggttttat gggtagcatg aataaagaac aggcctttga actgctggat 180

gcgttttatg aagccggcgg caattgtatt gataccgcga atagctatca gaatgaagaa 240

agcgaaattt ggattggtga atggatggca agccgtaaac tgcgtgatca gattgtgatt 300

gccaccaaat ttaccggtga ttataaaaaa tatgaagtgg gcggtggtaa aagcgcgaat 360

tattgcggta atcataaacg tagcctgcat gttagcgttc gtgatagcct gcgtaaactg 420

cagaccgatt ggattgatat tctgtatatt cattggtggg attatatgtc tagcattgaa 480

gaagttatgg atagtctgca tattctggtg cagcagggca aagttctgta tctgggtgtt 540

agtgataccc cggcctgggt tgttagcgca gccaattatt atgcaacctc acatggtaaa 600

accccgttta gcgtttatca gggtaaatgg aatgtgctga atcgtgattt tgaacgcgat 660

attattccga tggcccgcca ttttggtatg gccctggccc cgtgggatgt gatgggtggt 720

ggtcgctttc agagcaaaaa agcgatggaa gaacgtaaga aaaatggtga aggcctgcgt 780

acctttgttg gtggtccgga acagaccgaa ctggaagtta aaattagcga agccctgacc 840

aaaattgccg aagaacatgg caccgaaagc gttaccgcga ttgccattgc gtatgtgcgt 900

agcaaagcca aaaatgtttt tccgctgatt ggtggtcgca aaattgaaca tctgaaacag 960

aatattgaag ccctgagcat taaactgacc ccggaacaga ttgaatatct ggaatcaatt 1020

gtgccgtttg atgttggttt tccgaaaagc ctgattggtg atgatccggc ggtgaccaaa 1080

aaactgagcc cgctgaccag catgagcgcc cgtattgcct ttgataat 1128

<210> 9

<211> 278

<212> PRT

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 9

Met Lys Arg Val Asn Ala Phe Asn Asp Leu Lys Arg Ile Gly Asp Asp

1 5 10 15

Lys Val Thr Ala Ile Gly Met Gly Thr Trp Gly Ile Gly Gly Arg Glu

20 25 30

Thr Pro Asp Tyr Ser Arg Asp Lys Glu Ser Ile Glu Ala Ile Arg Tyr

35 40 45

Gly Leu Glu Leu Gly Met Asn Leu Ile Asp Thr Ala Glu Phe Tyr Gly

50 55 60

Ala Gly His Ala Glu Glu Ile Val Gly Glu Ala Ile Lys Glu Phe Glu

65 70 75 80

Arg Glu Asp Ile Phe Ile Val Ser Lys Val Trp Pro Thr His Phe Gly

85 90 95

Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Ala Ala Arg Ala Ser Ala Lys Arg Leu Gly

100 105 110

Thr Tyr Ile Asp Leu Tyr Leu Leu His Trp Pro Val Asp Asp Phe Lys

115 120 125

Lys Ile Glu Glu Thr Leu His Ala Leu Glu Asp Leu Val Asp Glu Gly

130 135 140

Val Ile Arg Tyr Ile Gly Val Ser Asn Phe Asn Leu Glu Leu Leu Gln

145 150 155 160

Arg Ser Gln Glu Val Met Arg Lys Tyr Glu Ile Val Ala Asn Gln Val

165 170 175

Lys Tyr Ser Val Lys Asp Arg Trp Pro Glu Thr Thr Gly Leu Leu Asp

180 185 190

Tyr Met Lys Arg Glu Gly Ile Ala Leu Met Ala Tyr Thr Pro Leu Glu

195 200 205

Lys Gly Thr Leu Ala Arg Asn Glu Cys Leu Ala Lys Ile Gly Glu Lys

210 215 220

Tyr Gly Lys Thr Ala Ala Gln Val Ala Leu Asn Tyr Leu Ile Trp Glu

225 230 235 240

Glu Asn Val Val Ala Ile Pro Lys Ala Ser Asn Lys Glu His Leu Lys

245 250 255

Glu Asn Phe Gly Ala Met Gly Trp Arg Leu Ser Glu Glu Asp Arg Glu

260 265 270

Met Ala Arg Arg Cys Val

275

<210> 10

<211> 834

<212> DNA

<213> Pyrococcus furiosus

<400> 10

atgaaacgtg ttaatgcatt taatgatctg aaacgtattg gtgatgataa agttaccgcc 60

attggtatgg gtacctgggg tattggtggt cgtgaaaccc cggattatag ccgcgataaa 120

gaatcaattg aagcaattcg ctatggtctg gaactgggta tgaatctgat tgataccgca 180

gaattttatg gtgccggtca tgcagaagaa attgtgggtg aagcgattaa agaatttgaa 240

cgtgaagata tttttattgt tagcaaagtg tggccgaccc attttggtta tgaagaagcc 300

aaaaaagccg cccgtgccag cgcgaaacgc ctgggtacct atattgatct gtatctgctg 360

cattggccgg ttgatgattt taaaaagatt gaagaaaccc tgcatgcact ggaagatctg 420

gttgatgaag gtgtgattcg ctatattggt gttagcaatt ttaatctgga actgctgcag 480

cgtagccagg aagtgatgcg taaatatgaa attgttgcaa atcaggttaa atatagcgtt 540

aaagatcgct ggccggaaac caccggtctg ctggattata tgaaacgtga aggtattgca 600

ctgatggcct ataccccgct ggaaaaaggt accctggcac gtaatgaatg cctggccaaa 660

attggtgaaa aatatggtaa aaccgccgcc caggttgccc tgaattatct gatttgggaa 720

gaaaatgtgg ttgcaattcc gaaagccagc aataaagaac atctgaaaga aaattttggt 780

gcgatgggtt ggcgtctgag cgaagaagat cgtgaaatgg cacgtcgttg tgtt 834

<210> 11

<211> 333

<212> PRT

<213> Thermotoga maritima

<400> 11

Met Gly Ile Pro Lys Arg Lys Leu Gly Glu Arg Gly Pro Glu Val Ser

1 5 10 15

Ala Ile Gly Leu Gly Cys Met Arg Met Ser Phe Gly Gln Lys Lys Leu

20 25 30

Pro Asp Arg Lys Glu Met Ile Lys Leu Ile Arg Thr Ala Val Glu Leu

35 40 45

Gly Ile Asn Phe Phe Asp Thr Ala Glu Val Tyr Gly Pro Tyr Thr Asn

50 55 60

Glu Glu Leu Val Gly Glu Ala Leu Glu Pro Phe Lys Gly Glu Val Val

65 70 75 80

Ile Ala Thr Lys Phe Gly Phe Glu Leu Tyr Glu Asp Gly Arg Pro Gly

85 90 95

Trp Lys Gly Leu Asn Ser Asn Pro Glu His Ile Lys Lys Ala Val Glu

100 105 110

Gly Ser Leu Arg Arg Leu Arg Val Glu Ala Ile Asp Ile Leu Tyr Gln

115 120 125

His Arg Val Asp Pro Asn Val Pro Ile Glu Glu Val Ala Gly Ala Val

130 135 140

Lys Glu Leu Ile Glu Glu Gly Lys Val Lys His Phe Gly Leu Cys Glu

145 150 155 160

Ala Ser Ala Glu Thr Ile Arg Arg Ala His Lys Val Cys Pro Val Asp

165 170 175

Val Val Gln Tyr Glu Tyr Ser Met Trp Trp Arg Lys Pro Glu Glu Glu

180 185 190

Leu Leu Pro Thr Cys Glu Glu Leu Gly Ile Gly Phe Val Ala Tyr Ser

195 200 205

Pro Leu Gly Lys Gly Phe Leu Thr Gly Ala Ile Gly Glu Asn Ser Lys

210 215 220

Phe Asp Glu Glu Asp Ser Arg Ser Arg Ile Pro Arg Phe Gln Lys Glu

225 230 235 240

Asn Leu Arg Glu Asn Leu Ala Leu Val Glu Leu Arg Lys Thr Ile Ala

245 250 255

Glu Arg Lys Gly Ala Thr Pro Ser Gln Ile Ala Leu Ala Trp Leu Leu

260 265 270

Ala Gln Lys Pro Trp Ile Val Pro Ile Pro Gly Thr Thr Lys Leu Ser

275 280 285

His Leu Leu Glu Asn Ile Gly Gly Ala Phe Val Glu Leu Thr Pro Glu

290 295 300

Glu Leu Gln Glu Ile Asn Asp Ala Leu Ser Arg Ile Glu Ile Lys Gly

305 310 315 320

Ser Arg Tyr Pro Glu Asp Met Glu Lys Met Thr Tyr Leu

325 330

<210> 12

<211> 999

<212> DNA

<213> Thermotoga maritima

<400> 12

atgggtattc cgaaacgtaa actgggtgaa cgtggcccgg aagtgagcgc aattggtctg 60

ggttgcatgc gtatgagctt tggtcagaaa aaactgccgg atcgtaaaga aatgattaaa 120

ctgatccgca ccgcggttga actgggcatt aatttctttg ataccgccga agtgtatggc 180

ccgtatacca atgaagaact ggttggcgaa gcactggaac cgtttaaagg tgaagtggtg 240

attgccacca aatttggctt tgaactgtat gaagatggcc gtccgggttg gaaaggtctg 300

aatagtaatc cggaacatat taaaaaagcc gttgaaggta gcctgcgccg tctgcgtgtg 360

gaagcaattg atattctgta tcagcatcgt gttgatccga atgttccgat tgaagaagtt 420

gcaggcgcag tgaaagaact gattgaagaa ggtaaagtga aacattttgg tctgtgcgaa 480

gcaagcgccg aaaccattcg tcgtgcacat aaagtgtgcc cggtggatgt ggtgcagtat 540

gaatatagca tgtggtggcg taaaccggaa gaagaactgc tgccgacctg cgaagaactg 600

ggcattggct ttgtggcata ttctccgctg ggcaaaggct ttctgaccgg tgccattggt 660

gaaaatagca aatttgatga agaagatagc cgtagtcgca ttccgcgttt tcagaaagaa 720

aatctgcgtg aaaatctggc cctggttgaa ctgcgtaaaa ccattgcaga acgcaaaggt 780

gcgacgccga gccagattgc cctggcctgg ctgctggccc agaaaccgtg gattgtgccg 840

attccgggta ccaccaaact gagccatctg ctggaaaata ttggtggtgc atttgtggaa 900

ctgaccccgg aagaactgca ggaaattaat gatgccctga gccgtattga aattaaaggt 960

agccgttatc cggaagatat ggaaaaaatg acctatctg 999

<210> 13

<211> 347

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae S288C

<400> 13

Met Thr Thr Asp Thr Thr Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile

1 5 10 15

Ala Leu His Ile Met Asn Asp Leu Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Val Ile

20 25 30

Gly Ser Gly Arg Ser Gln Glu Lys Asn Asp Gly Leu Leu Lys Lys Phe

35 40 45

Asn Asn Asn Pro Lys Leu Ser Met Glu Ile Val Glu Asp Ile Ala Ala

50 55 60

Pro Asn Ala Phe Asp Glu Val Phe Lys Lys His Gly Lys Glu Ile Lys

65 70 75 80

Ile Val Leu His Thr Ala Ser Pro Phe His Phe Glu Thr Thr Asn Phe

85 90 95

Glu Lys Asp Leu Leu Thr Pro Ala Val Asn Gly Thr Lys Ser Ile Leu

100 105 110

Glu Ala Ile Lys Lys Tyr Ala Ala Asp Thr Val Glu Lys Val Ile Val

115 120 125

Thr Ser Ser Thr Ala Ala Leu Val Thr Pro Thr Asp Met Asn Lys Gly

130 135 140

Asp Leu Val Ile Thr Glu Glu Ser Trp Asn Lys Asp Thr Trp Asp Ser

145 150 155 160

Cys Gln Ala Asn Ala Val Ala Ala Tyr Cys Gly Ser Lys Lys Phe Ala

165 170 175

Glu Lys Thr Ala Trp Glu Phe Leu Lys Glu Asn Lys Ser Ser Val Lys

180 185 190

Phe Thr Leu Ser Thr Ile Asn Pro Gly Phe Val Phe Gly Pro Gln Met

195 200 205

Phe Ala Asp Ser Leu Lys His Gly Ile Asn Thr Ser Ser Gly Ile Val

210 215 220

Ser Glu Leu Ile His Ser Lys Val Gly Gly Glu Phe Tyr Asn Tyr Cys

225 230 235 240

Gly Pro Phe Ile Asp Val Arg Asp Val Ser Lys Ala His Leu Val Ala

245 250 255

Ile Glu Lys Pro Glu Cys Thr Gly Gln Arg Leu Val Leu Ser Glu Gly

260 265 270

Leu Phe Cys Cys Gln Glu Ile Val Asp Ile Leu Asn Glu Glu Phe Pro

275 280 285

Gln Leu Lys Gly Lys Ile Ala Thr Gly Glu Pro Ala Thr Gly Pro Ser

290 295 300

Phe Leu Glu Lys Asn Ser Cys Lys Phe Asp Asn Ser Lys Thr Lys Lys

305 310 315 320

Leu Leu Gly Phe Gln Phe Tyr Asn Leu Lys Asp Cys Ile Val Asp Thr

325 330 335

Ala Ala Gln Met Leu Glu Val Gln Asn Glu Ala

340 345

<210> 14

<211> 1041

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae S228C

<400> 14

atgaccaccg ataccaccgt ttttgtgagc ggcgccaccg gctttattgc actgcatatt 60

atgaatgatc tgctgaaagc aggctatacc gttattggtt caggtcgttc acaggaaaag 120

aatgatggtc tgctgaaaaa atttaataat aatccgaaac tgtctatgga aattgttgaa 180

gatattgcag ccccgaatgc gtttgatgaa gtttttaaaa aacatggtaa agaaattaaa 240

attgttctgc ataccgcgtc accgtttcat tttgaaacca ccaattttga aaaggatctg 300

ctgaccccgg cggtgaatgg taccaaatca attctggaag ccattaaaaa gtatgcggca 360

gatacagttg aaaaagttat tgtgacgtct agtaccgcag cactggtgac gccgaccgat 420

atgaataaag gtgatctggt gattaccgaa gaaagttgga ataaagatac atgggatagc 480

tgtcaggcta atgcagttgc agcctattgt ggtagtaaaa aatttgcaga aaaaaccgca 540

tgggaatttc tgaaagaaaa taaaagtagt gtgaagttta ccctgagcac aattaatccg 600

ggttttgttt ttggcccgca gatgtttgca gatagtctga aacatggtat taataccagc 660

tctggtattg tttccgaact gattcatagc aaagttggtg gggaatttta taattattgt 720

ggcccgttta ttgatgttcg tgatgttagc aaagcacatc tggttgcaat tgaaaaaccg 780

gaatgtaccg gtcagcgtct ggttctgagc gaaggtctgt tttgttgtca ggaaattgtt 840

gatattctga atgaagaatt tccgcagctg aaaggtaaaa ttgcgaccgg tgaaccggcg 900

acaggtccga gttttctgga gaaaaatagt tgtaaatttg ataatagtaa aaccaaaaaa 960

ctgctgggtt ttcagtttta taatctgaag gattgtattg tggataccgc cgcccagatg 1020

ctggaagttc agaatgaagc t 1041

<210> 15

<211> 774

<212> DNA

<213> Lactobacillus brevis

<400> 15

atggaggtcg ttcaaatgtc aaaccggtta gatggaaaag tagcaatcgt tacaggtggt 60

acgttgggta tcggtttagc tatcgccacg aagttcgttg aagaaggggc taaggtcatg 120

attaccggcc ggcacagcga tgttggtgaa aaagcagcta agagtgtcgg cactcctgat 180

cagattcaat ttttccaaca tgattcttcc gatgaagacg gctggacgaa attattcgat 240

gcaacggaaa aagcctttgg cccagtttct acattagtta ataacgctgg gatcgcggtt 300

aacaagagtg tcgaagaaac cacgactgct gaatggcgta aactattagc cgtcaacctt 360

gatggtgtct tcttcggtac ccgattaggg attcaacgga tgaagaacaa aggcttaggg 420

gcttccatca tcaacatgtc ttcgatcgaa ggctttgtgg gtgatcctag cttaggggct 480

tacaacgcat ctaaaggggc cgtacggatt atgtccaagt cagctgcctt agattgtgcc 540

ctaaaggact acgatgttcg ggtaaacact gttcaccctg gctacatcaa gacaccattg 600

gttgatgact taccaggggc cgaagaagcg atgtcacaac ggaccaagac gccaatgggc 660

catatcggtg aacctaacga tattgcctac atctgtgttt acttggcttc taacgaatct 720

aaatttgcaa cgggttctga atttgtagtt gatggtggtt ataccgctca ataa 774

Claims (10)

1.一种(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：在反应体系中，利用酮还原酶催化式2化合物即得式1化合物(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇；

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶为来源于Saccharomycescerevisiae S288C的酮还原酶；较佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或其突变所示；其中所述突变在如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列上具有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入，并且保持或改善了所述酮还原酶的功能；所述突变的氨基酸序列优选与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少99％的序列同源性；更佳地，所述酮还原酶的氨基酸序列由如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列编码。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶的浓度为0.5-5U/mL，和/或，所述式2化合物的浓度为10-100g/L；

较佳地，所述酮还原酶的浓度为1.90U/mL，和/或，所述式2化合物的浓度为50g/L。

4.如权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系中还包括还原型辅酶，所述还原型辅酶优选NADH、NADPH和/或FADH₂，和/或，所述还原型辅酶的浓度优选0.5-5mM；更优选1mM。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述NADH和/或所述NADPH由以下步骤制备：在脱氢酶以及供氢体的存在下，将NAD⁺和/或NADP⁺进行还原反应即可；

较佳地，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐；

更佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，

所述的脱氢酶的浓度为10-100U/mL，优选20-30U/mL，例如26.48U/mL；

和/或，所述NAD⁺或NADP⁺的浓度为0.5-5mM，优选1mM；

和/或，所述的供氢体与所述式2化合物的摩尔比为1:1-10:1，优选5:1。

和/或，所述醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

7.如权利要求1-6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系还包括缓冲液；所述缓冲液优选为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液的浓度优选为20-200Mm，更优选为100mM，所述缓冲液的pH优选为6.5-7.5，更优选为7.0；

和/或，所述反应体系还包括助溶剂，例如DMSO，所述助溶剂的体积优选在反应体系中占5-10％。

8.如权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下条件：

所述催化的温度为20-40℃，优选30℃；

和/或，所述催化在摇床进行，所述摇床的转速为50-300rpm，优选200rpm；

和/或，所述催化的时间为10-72小时，优选22小时；

和/或，所述催化后还包括萃取并旋干的过程，所述萃取优选用乙酸乙酯萃取。

9.一种1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇、乳酸乙酯、如权利要求1-8中任一项所述的酮还原酶和/或所述的式2化合物在制备(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇中的用途；

较佳地，所述的酮还原酶通过催化式2化合物制备得到所述的(S)-1,1-二(4-氟苯基)-2-丙醇。

10.一种1,1-二(4-氟苯基)-1,2-丙二醇、乳酸乙酯、如权利要求1-8任一项中所述的酮还原酶和/或所述的式2化合物在制备吡啶酰胺类杀菌剂Florylpicoxamid中的用途。

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