JP6585839B2

JP6585839B2 - 触媒反応によるｌ−アロイソロイシンの形成におけるアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼの応用

Info

Publication number: JP6585839B2
Application number: JP2018518432A
Authority: JP
Inventors: 建華鞠; 青連李; 湘静秦; 静劉
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2015-10-10
Filing date: 2015-12-11
Publication date: 2019-10-02
Anticipated expiration: 2035-12-11
Also published as: CN108486028A; JP2018530335A; CN105154487B; CN108587991B; CN105154487A; WO2017059626A1; CN108587991A; CN108486028B

Description

本発明は、遺伝子工学及び生物触媒反応技術分野に関し、特にピリドキサールリン酸（ｐｙｒｉｄｏｘａｌ５’−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＰＬＰ）依存性アミノトランスフェラーゼ（ＰＬＰ−ｌｉｎｋｅｄａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と新型イソメラーゼ（ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）からなる酵素のペアが協力して触媒反応によりＬ−アロイソロイシン（Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）を形成する応用に関する。

イソロイシンは２つの非対称中心を有することにより、Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｌ−アロイソロイシン（Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）及びＤ−アロイソロイシン（Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）との４種の立体異性体があり、その対応関係を図１に示す。Ｌ−Ｉｌｅ以外の、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ及びＤ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅは何れも非タンパク質アミノ酸であり、これらが自然界に存在することについて、既に報道されたことがある。ここで、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅは自然界における広範囲の存在、及び重要な科学上の意義のため、科学者に特別に注目されている。Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅは１９８５年に初めて発見されて報道され、その後の研究において、植物に存在するほかに、構造単位としてたくさんの環状ペプチド抗生物質、例えば真菌由来のａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎＡ、ｃｏｒｄｙｈｅｐｔａｐｅｐｔｉｄｅｓ及びａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｃｉｎＥと、放線菌由来のｇｌｏｂｏｍｙｃｉｎ、ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ、ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ及びｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓ（構造は図２を参照）とに存在できることが見出された。興味深いことに、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅは人体の血漿にも存在すると発見された。健康な人々の血漿においては、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの濃度が非常に低く、ぎりぎり検出可能なレベルである一方、常染色体劣性遺伝病であるメープルシロップ尿症（ｍａｐｌｅｓｙｒｕｐｕｒｉｎｅｄｉｓｅａｓｅ）患者の血漿においては、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅは患者の代謝欠陥によって蓄積され、濃度が５μＭ以上となり、そのため、血漿中のＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの濃度レベルはもうメープルシロップ尿症を診断するための重要な手法の一つとなっている。

Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅとタンパク質アミノ酸Ｌ−Ｉｌｅの構造が非常に類似するが、β位の炭素原子におけるメチルの配座が異なる点がＬ−ａｌｌｏ−ＩｌｅとＬ−Ｉｌｅで相違する。Ｌ−ａｌｌｏ−ＩｌｅはＬ−Ｉｌｅと構造的に非常に類似し、かつ自然界中に広く存在しているにもかかわらず、これまで、生体がＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅという非タンパク質アミノ酸を如何に生合成するか、及びこの過程に関する酵素及び酵素反応メカニズムについては、まだ解明されていない謎である。

Ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ及びｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓそれぞれは中国南海の深海からのストレプトマイセス（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｃｏｐｕｌｉｒｉｄｉｓＳＣＳＩＯＺＪ４６）及び（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１）を分離精製して得た二種の環状ペプチド抗生物質である。研究によると、ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓはグラム陽性菌に対して良い阻害活性を有し、ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓはプロピオニバクテリウムアクネス菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ）に対して良い阻害作用を持ち、にきび治療によい薬のリード化合物である。さらに重要なことは、これらの二種の環状ペプチド化合物の構造には、何れも非タンパク質アミノ酸構造単位であるＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅが含有される。現在、ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ及びｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成遺伝子クラスターはクローニングされた。上記研究結果は、酵素学レベルでＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの生合成メカニズムを解釈することの基礎となる。Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ生合成酵素学メカニズムの解釈は、グリーンの酵素学方法でのＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ調製、及びメープルシロップ尿症の診断並びに治療について、重要な実用的意義がある。

本発明は、Ｌ−イソロイシンを触媒反応してＬ−アロイソロイシンを形成するか、又はＬ−アロイソロイシンを触媒反応してＬ−イソロイシンを形成することにおけるアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼからなる酵素ペアの応用を提供することを目的とする。

本発明に係るＬ−イソロイシンを触媒反応してＬ−アロイソロイシンを形成するか、又はＬ−アロイソロイシンを触媒反応してＬ−イソロイシンを形成することにおけるアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼからなる酵素ペアの応用であって、前記アミノトランスフェラーゼは、アミノトランスフェラーゼＤｓａＤ又はアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯであり、前記イソメラーゼは、イソメラーゼＤｓａＥ又はイソメラーゼＭｆｎＨであり、前記アミノトランスフェラーゼＤｓａＤのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．７に示しており、前記イソメラーゼＤｓａＥのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．８に示しており、前記アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．５に示しており、前記イソメラーゼＭｆｎＨのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６に示している。

好ましくは、前記アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯのコーディング遺伝子であるｍｆｎＯ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示している。

好ましくは、前記イソメラーゼＭｆｎＨのコーディング遺伝子であるｍｆｎＨ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示している。

好ましくは、前記アミノトランスフェラーゼＤｓａＤのコーディング遺伝子であるｄｓａＤ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．３に示している。

好ましくは、前記イソメラーゼＤｓａＥのコーディング遺伝子であるｄｓａＥ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．４に示している。

本発明は主として三つの様態の内容に関する。第一様態としては、バイオインフォマティクス分析法を用い、それぞれｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ及びｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成遺伝子クラスターからＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ生合成に関与したアミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼであるＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨを識別する。第二様態としては、インビボでの遺伝子ノックアウト方法により、アミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼであるＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨに対してインビボ欠失突然変異させて、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物７、９及び１１（図２）を高収率で製造する培養株△ｍｆｎＨ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯを取得する。第三様態としては、本発明は識別したアミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼであるＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨを用いＬ−Ｉｌｅを触媒反応してＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを変換生成する応用に関するものであり、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの生成に２つの酵素が協力して作用することが必要となり、単なるアミノトランスフェラーゼ又はイソメラーゼは何れもＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの生成を触媒反応できず、この触媒反応中に何ら補因子を添加する必要がなくなることを特徴とする。

本発明は、Ｌ−ａｌｌｏ−ＩｌｅとＬ−Ｉｌｅの構造上の相違を観察し比較すると、見出した相違点としてβ位の炭素原子におけるメチルの配座が異なり、ここで、Ｌ−Ｉｌｅのβ位の炭素原子が３Ｓ型である一方、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅのβ位の炭素原子が３Ｒ型である。よって、本発明者は、Ｌ−ａｌｌｏ−ＩｌｅがＬ−Ｉｌｅから変換されてなる可能性があり、この変化プロセスは、アミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼの２つ酵素分子が協力して両者間の変換を完了した可能性があると推定する。まず、Ｌ−Ｉｌｅはアミノトランスフェラーゼの作用で、アミノ基が除去され、カルボニルになり、α位の炭素原子を回転自在不可になるように平面において固定させる。次に、イソメラーゼの作用で、β位の炭素原子におけるメチルフリップを完了する。本発明は、ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ及びｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成遺伝子クラスターのうち、アミノトランスフェラーゼとして注釈されるＤｓａＤ及びＭｆｎＯそれぞれに対してバイオインフォマティクス分析を行い、多重配列アラインメントによると、ＤｓａＤ／ＭｆｎＯが報道された分岐鎖アミノ酸トランスフェラーゼ（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＢＣＡＴｓ）と非常に高い配列相同性を有するとともに、ＩＶ−型アミノ酸トランスフェラーゼと同一のシグネチャーモチーフである「ＥＸＧＸＸＮＬＦＸｎＬＸＴＸｎＬＸＧＶＸＲ」を持ち、かつＰＬＰに共有結合した触媒リジン残基（Ｌｙｓｉｎｅ）（図３を参照）を有すると表され、ＤｓａＤ／ＭｆｎＯがＰＬＰ−依存性アミノトランスフェラーゼ活性を有するように提示する。また、本発明は、タンパクに対し構造相同性解析を行うオンラインリソースＨＨｐｒｅｄを用いて、ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ及びｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成遺伝子クラスターのうち、イソメラーゼとして注釈されるＤｓａＥ及びＭｆｎＨそれぞれに対して構造解析を行い、核輸送因子２スーパーファミリー（ｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｆａｃｔｏｒ２，ＮＴＦ２）に属するタンパクと類似な二次構造の折り畳み方式を持つと表され、核輸送因子２スーパーファミリーは機能が異なり互いのアミノ酸配列の相似性が低い多量のタンパクを含有し、報道された△^５−３−ケトステロイドイソメラーゼ（ｄｅｌｔａ^５−３−ｋｅｔｏｓｔｅｒｏｉｄｉｓｏｍｅｒａｓｅ）が含まれ、△^５−３−ケトステロイドを触媒反応して△^４−３−ケトステロイドを異性化生成することが可能となり、本発明者は、ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ遺伝子クラスターにおけるＤｓａＥ及びｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓ遺伝子クラスター中のＭｆｎＨが、Ｌ−Ｉｌｅのβ炭素原子におけるメチルを異性化しＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを生成することに関与する可能性があると推定する。ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓ及びｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターから、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ合成に関与する可能性があるアミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼ酵素のペア（図４を参照）がそれぞれ識別され、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ生合成メカニズムの保守性を提示する。

本発明は、ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓ野生型産生株であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１においてアミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼＭｆｎＯ／ＭｆｎＨの遺伝子をノックアウトして突然変異させて（図５及び６を参照）、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物７を高収率で生成する培養株△ｍｆｎＨを構築する。ＨＰＬＣを用いて変異株である△ｍｆｎＯ及び△ｍｆｎＨの発酵生成物を分析した結果、△ｍｆｎＨはＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物３及び４を完全に生産しないが、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物５及び７を生成し、かつ化合物７の生産量が野生型培養株よりも約１００倍程度向上し（図７を参照）、△ｍｆｎＯもＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物４を完全に生産しないが（図７を参照）、それでもＬ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物５及び７を生成可能となる。これらのデータは、ＭｆｎＯ／ＭｆｎＨがＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの合成中に不可欠の役割を果たしたと確認し、ＭｆｎＯ／ＭｆｎＨの欠失突然変異によって前駆体Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅが合成不可になるため、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅと類似な構造を有するＬ−Ｖａｌは、ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの合成中に競争優位性なしにｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓペプチド骨格に統合されることができ、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物７を高収率で生成する培養株△ｍｆｎＨが取得される。

したがって、本発明は、化合物７を高収率で生成する培養株△ｍｆｎＨであって、前記培養株△ｍｆｎＨは、野生型ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１のｍｆｎＨ遺伝子をノックアウトして欠失させ突然変異させて得たものであり、
前記化合物７は構造式が化１に示すことを特徴とする、化合物７を高収率で生成する培養株△ｍｆｎＨを提供することを第二の目的とする（但し、Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＣＨ_３、Ｒ_３＝ＯＨ）。

本発明はさらに、ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ遺伝子クラスターにおけるアミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼであるＤｓａＤ／ＤｓａＥの遺伝子に対しインフレームノックアウト突然変異させてから（ｉｎ−ｆｒａｍｅｄｅｌｅｔｉｏｎ）、異種宿主であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２において発現させ（図８及び９を参照）、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物９及び１０を高収率で生成する培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯを構築することに関する。ＨＰＬＣを用いてＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯの発酵生成物を分析した結果、ｄｓａＥ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯは、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物８及び１０を完全に生産しないが、それでもＬ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物９及び１１を生産することができ、かつこれら２つの化合物の生産量は対照培養株に比べてともに大きく向上する（化合物９が約１００倍になり、化合物１１が約１４０倍程度になる）（図１０を参照）。ｄｓａＤ遺伝子がインフレーム欠失突然変異された異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯは、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物８及び１０を生成することができるが、生産量が大きく低下したため、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物９及び１１を生成することができ、かつ生産量が大幅に向上する（化合物９が約８０倍になり、化合物１１が約５０倍になる）（図１０を参照）。これらのデータも、ＤｓａＤ／ＤｓａＥがＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの合成中に不可欠な役割を果たすと示す。

したがって、本発明は、化合物９及び１１を高収率で生成する培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯであって、前記培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯは、ＤｓａＥ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターを培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２に導入し発現させて得たものであり、前記ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯは、ＤｓａＤ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターを培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２に導入し発現させて得たものであり、
前記化合物９及び１１の構造は化２に示すことを特徴とする、化合物９及び１１を高収率で生成する培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯを提供することを第三の目的とする（但し、化合物９：Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＮＨ_２、化合物１１：Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＯＨ）。

本発明はさらに、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＥ３）においてアミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼであるＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨを発現させ、精製（図１１を参照）し、取得した酵素のペアは、何ら補因子を添加しない条件で、基質であるＬ−Ｉｌｅを触媒反応してＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅに転換し形成させることができる。ｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸塩緩衝液において、何ら補因子を添加しない条件で、ＤｓａＤ／ＤｓａＥ又はＭｆｎＯ／ＭｆｎＨは、協力して基質であるＬ−Ｉｌｅを触媒反応しＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅに変換し生成させ、変換率が約６７％になる（図１２を参照）が、単なるアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ／ＭｆｎＯ又は単なるイソメラーゼＤｓａＥ／ＭｆｎＨは、Ｌ−Ｉｌｅを触媒反応しＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅに変換し生成させることができない。ＤｓａＤ／ＤｓａＥ又はＭｆｎＯ／ＭｆｎＨが協力してＬ−Ｉｌｅを触媒反応してＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅに変換し生成させることは、可逆反応である。Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを基質とする場合に、上記同一反応条件で、生成物であるＬ−Ｉｌｅを取得することができる（図１４を参照）。Ｌ−Ｉｌｅを基質とする場合に、ＤｓａＤ／ＤｓａＥの触媒反応の可逆反応は平衡定数が１．３７である（図１５を参照）。Ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓとｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成途中でのアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼにより、機能的相補性を達成することができ、ＤｓａＤ／ＭｆｎＨ及びＭｆｎＯ／ＤｓａＥは、協力してＬ−ＩｌｅとＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅとの間の相互の変換を触媒反応することができる（図１６を参照）。

本発明は、触媒反応によるＬ−アロイソロイシン（Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）又はＬ−イソロイシンの形成におけるアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼからなる酵素のペアの応用を開示している。よって、酵素学レベルでＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの生合成メカニズムを解釈することの基礎を築くことになった。Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ生合成酵素学メカニズムの解釈は、グリーンの酵素学方法でのＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ調製、及びメープルシロップ尿症の診断並びに治療について、重要な実用的意義がある。

本発明のストレプトマイセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｃｏｐｕｌｉｒｉｄｉｓＳＣＳＩＯＺＪ４６は、文献：「ＹｏｎｇｘｉａｎｇＳｏｎｇ，ＱｉｎｇｌｉａｎＬｉ，ＸｕｅＬｉｕ，ＹｕｃｈａｎＣｈｅｎ，ＹｕｎＺｈａｎｇ，ＡｉｊｕｎＳｕｎ，ＷｅｉｍｉｎＺｈａｎｇ，ＪｉｎｇｒｅｎＺｈａｎｇ，ａｎｄＪｉａｎｈｕａＪｕ，ＣｙｃｌｉｃＨｅｘａｐｅｐｔｉｄｅｓｆｒｏｍｔｈｅＤｅｅｐＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＳｅａ−ＤｅｒｉｖｅｄＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｃｏｐｕｌｉｒｉｄｉｓＳＣＳＩＯＺＪ４６ＡｃｔｉｖｅＡｇａｉｎｓｔＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＧｒａｍ−ＰｏｓｉｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉａ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，２０１４，７７（８），ｐｐ１９３７−１９４１」に開示されている。この培養株についても、本出願人は持っており、２０年間以内に公衆へ提供するように保証する。

本発明に係るＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１培養株は、「ＸｉａｏＺｈｏｕ，ＨｏｎｇｂｏＨｕａｎｇ，ＪｉｅＬｉａ，ＹｏｎｇｘｉａｎｇＳｏｎｇ，ＲｅｎｗａｎｇＪｉａｎｇ，ＪｉｎｇＬｉｕ，ＳｉＺｈａｎｇ，ＹａｎＨｕａ，ＪｉａｎｈｕａＪｕ．Ｎｅｗａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｇｅｎｅｒｓａｎｄａｂｓｏｌｕｔｅｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｆｒｏｍｔｈｅｄｅｅｐｓｅａ−ｄｅｒｉｖｅｄＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｖｏｌｕｍｅ７０，Ｉｓｓｕｅ４２，２１Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１４，Ｐａｇｅｓ７７９５−７８０１」に開示されている。この培養株についても、本出願人は持っており、２０年間以内に公衆へ提供するように保証する。

本発明に係るコエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ｍ１１５２は、修士論文：「夏娟．マングローブ由来のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．ＯＵＣ６８１９におけるＤｒｉｍｅｎｔｉｎｅｓ系化合物生合成研究．中国海洋大学．２０１３年」に開示されている。この培養株についても、本出願人は持っており、２０年間以内に公衆へ提供するように保証する。

Ｌ−イソロイシン（Ｌ−Ｉｌｅ）、Ｄ−イソロイシン（Ｄ−Ｉｌｅ）、Ｌ−アロイソロイシン（Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）及びＤ−アロイソロイシン（Ｄ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ）の化学構造式である。ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓ及びｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの化学構造式である（但し、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１はそれぞれ化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１を表す）。アミノトランスフェラーゼＤｓａＤ／ＭｆｎＯと報道された分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼとの多重配列アライメントである。矢印に指すものは、保守的なＰＬＰに共有結合したリシン触媒参与であり、ボックスが示すものは、ＩＶ−アミノトランスフェラーゼのシグネチャーモチーフである「ＥＸＧＸＸＮＬＦＸｎＬＸＴＸｎＬＸＧＶＸＲ」である。ｍａｆｏｒｍｙｃｉｎｓ及びｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターにおけるアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼの存在位置である。アミノトランスフェラーゼＤｓａＤ／ＭｆｎＯは赤色でマークされ、イソメラーゼＤｓａＥ／ＭｆｎＨは緑色でマークされた。ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ技術を用いｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓ産生株においてアミノトランスフェラーゼ遺伝子ｍｆｎＯを欠失突然変異させる様子である。（Ａ）突然変異プロセスの概要図、（Ｂ）変異株△ｍｆｎＯに対するＰＣＲ同定、Ｗ：野生型培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１の遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、Ｍ：変異株△ｍｆｎＯ遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、ｍａｋｅｒ：ＮＤＡ分子量標準品。ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ技術を用いｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓ産生株においてアミノトランスフェラーゼ遺伝子ｍｆｎＨを欠失突然変異させる様子である。（Ａ）突然変異プロセスの概要図、（Ｂ）変異株△ｍｆｎＨに対するＰＣＲ同定、Ｗ：野生型培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１の遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、Ｍ：変異株△ｍｆｎＨ遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、ｍａｋｅｒ：ＮＤＡ分子量標準品。変異株△ｍｆｎＯ及び△ｍｆｎＨ発酵生成物のＨＰＬＣ分析である。ｄｓａＤ遺伝子のインフレーム欠失突然変異、及び異種宿主であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２における発現である。（Ａ）示意図、（Ｂ）欠失突然変異のＰＣＲ同定、ＷＴ：対照培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２の遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、ＤＫＯ：異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、Ｍ：ＤＮＡ分子量標準品。ｄｓａＥ遺伝子のインフレーム欠失突然変異、及び異種宿主であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２における発現である。（Ａ）示意図、（Ｂ）欠失突然変異のＰＣＲ同定、ＷＴ：対照培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２の遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、ＥＫＯ：異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ遺伝子群ＤＮＡをテンプレートとすること、Ｍ：ＤＮＡ分子量標準品。ｄｓａＤ及びｄｓａＥ遺伝子がインフレーム欠失突然変異された異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯの発酵生成物のＨＰＬＣ分析である。ｉ：対照培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２、ｉｉ：ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターを含有する異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ、ｉｉｉ：ｄｓａＤがインフレーム欠失突然変異された異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ、ｉｖ：ｄｓａＥがインフレーム欠失突然変異された異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ。ＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨが大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＥ３）において発現、精製されてからＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析される様子である。精製したリストラＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨがインビトロでＬ−Ｉｌｅを触媒反応してＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅに変換し生成させる様子である。ＤｓａＤ／ＤｓａＥで酵素生成物であるＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを調製し取得する^１ＨＮＭＲ図録である。Ａ：酵素生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの^１ＨＮＭＲ図録、Ｂ：Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ標準品の^１ＨＮＭＲ図録。精製したリストラＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨがインビトロでＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを触媒反応してＬ−Ｉｌｅに変換し生成させる様子である。ＤｓａＤ／ＤｓａＥ触媒反応の可逆反応の平衡定数の測定である。但し、Ｌ−Ｉｌｅを基質とする場合に、平衡定数Ｋｅｑは公式によってＫｅｑ＝（［ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ］／［ｌ−Ｉｌｅ］）＝（２．８９／２．１１）＝１．３７と算出されて得る。異なる生合成経路由来のアミノトランスフェラーゼ／イソメラーゼ酵素のペアであるＤｓａＤ／ＭｆｎＨ及びＭｆｎＯ／ＤｓａＥは、協力してＬ−ＩｌｅとＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅとの間の相互の変換を触媒反応することができる。

以下の実施例は、本発明をさらに説明するもので、本発明を制限するものではない。

（実施例１）
ｍｆｎＯ遺伝子（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示し、そのコードされたアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．５に示す）及びｍｆｎＨ遺伝子（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示し、そのコードされたイソメラーゼＭｆｎＨのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６に示す）は、野生型産生株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１における欠失突然変異である。

ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ法でインビトロノックアウト変異株を取得する。取得したｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成遺伝子クラスター配列に基づいて、文献にレポートされたＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇシステムを参照して、一対のｍｆｎＯ及びｍｆｎＨ遺伝子のノックアウトプライマーをデザインし、プライマー配列について表１におけるｍｆｎＯ及びｍｆｎＨノックアウトプライマーを参照する。そして、インビトロノックアウトプラスミドを、ＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ法を参照することによって構築してから、共役移転したコンジュゲーションドナー株に移す。具体的なステップを以下に示す。
（１）ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成遺伝子クラスターを含有するｃｏｓｍｉｄプラスミド（プラスミドｃｏｓｍｉｄ２４７Ｅ，ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＫＰ７１５１４５．１）を大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０に移して、標的プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０培養株を取得し、１０ｍＭのＬ−アラビノースでλ／ｒｅｄリストラシステム発現を誘導し、それをコンピテントセルとして調製し用意した。
（２）エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＩＪ７７８を制限し、そのうち約１．４ｋｂの移転元（ｏｒｉＴ）及びスペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含有するＤＮＡ断片を回収し、それをＰＣＲテンプレートとし、プライマーであるｍｆｎＯｄｅｌＦ／ｍｆｎＯｄｅｌＲ及びｍｆｎＨｄｅｌＦ／ｍｆｎＨｄｅｌＲを用いてＰＣＲによってそれぞれ１．４ｋｂのＰＣＲ生成物まで増幅される。５０μＬのＰＣＲ反応系：高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ３Ｕ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ，ｄＮＴＰｓ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＭＳＯ２．５μＬ，プライマーのそれぞれが０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡテンプレートが約１ｎｇであり、水を加えて５０μＬに達した。ＰＣＲ反応条件としては、９４℃で５ｍｉｎプレ変性し、９４℃で増幅サイクルし、４５ｓ変性し、５８℃で４５ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸ばし、３０回サイクルし、最後に７２℃で１０ｍｉｎ伸ばした。１．４ｋｂのＰＣＲ生成物をすぐに使えるようにそれぞれ回収、精製した。
（３）ＰＣＲ生成物を、ステップ（１）で調製したコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０にそれぞれ電気穿孔し、リストラを発生させ、ＬＢスクリーニングプレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含有する）に塗布し、３７℃で一晩培養する。スクリーニングプレートからポジティブなモノクローナルを選び出し、プラスミドを抽出し、リストラプラスミドはｄｅｌｍｆｎＯ及びｄｅｌｍｆｎＨと名付けられ、ｄｅｌｍｆｎＯ及びｄｅｌｍｆｎＨにおけるｍｆｎＯ及びｍｆｎＯ遺伝子の一部断片はそれぞれ移転元及びスペクチノマイシン耐性遺伝子に置き換えられた。
（４）構築したリストラ突然変異プラスミドであるｄｅｌｍｆｎＯ及びｄｅｌｍｆｎＨを、それぞれＥ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に変換し、リストラ培養株Ｅ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｄｅｌｍｆｎＯ及びＥ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｄｅｌｍｆｎＨを、接合伝達のドナー株として取得した。

野生型ストレプトマイセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１培養株を、ＩＳＰ２培養基（モルトエキス４ｇ、酵母エキス４ｇ、グルコース４ｇ、海塩３０ｇ、寒天粉末２０ｇ、１Ｌまで水添加、ｐＨ７．２）プレートで、ストリーキングによる培養を３−５日間行い、生成した胞子用無菌綿棒をＴＳＢ培養基に収集し、渦振動して、胞子を分散させた。菌系体及び胞子を濾過し分離し、胞子が５ｍＬのＴＳＢ培養基において浮遊し、５０℃で１０ｍｉｎ熱衝撃してから、２８℃で２−４時間発芽して、接合伝達の受容株となった。ドナー株Ｅ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｄｅｌｍｆｎＯ及びＥ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／ｄｅｌｍｆｎＨは、それぞれ５０μｇ／ｍＬカナマイシン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含有する５０ｍＬのＬＢ液体培養基において、３７℃でＯＤ６００値が約０．６となるまで生長した時に、菌体（４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）が遠心収集され、ＬＢによって菌体が３回清浄され、３００μＬのＬＢ培養基において浮遊し、接合伝達のドナー株となった。上記受容株４００μＬ及びドナー株１００μＬを取って均等に混合し、何ら抗生物質が含まれないＭ−ＩＳＰ４固体培養基（可溶性デンプン１０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ペプトン１ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１ｇ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４２ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４１ｇ、ＣａＣＯ_３２ｇ、海塩３０ｇ、微量元素１００μＬ、１Ｌまで水添加、ｐＨ７．２）に塗布し、乾燥後、２８℃で１８−２０ｈ培養した。その後、プレートを取り出し、抗生物質を含有する水でプレートをカバーし、最終的な濃度が１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍＬトリメトプリムとなり、乾燥後、２８℃のインキュベータ内に置いて、３−４日間培養してから観察した。

接合伝達プレートに小さなコロニーが生長した後、無菌爪楊枝によって１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシン及び５０μｇ／ｍＬトリメトプリムを含有するＩＳＰ２プレートに移送し、２８℃で２−３日間培養してから、各変異株の遺伝子群ＤＮＡを抽出し、検出プライマー（プライマー配列について表２中のｍｆｎＯ及びｍｆｎＨの検出プライマー配列を参照）を利用して、ＰＣＲ検出により陽性クローンを取得し、即ちアミノトランスフェラーゼｍｆｎＯ遺伝子ノックアウト二重交換突然変異培養株△ｍｆｎＯ及びイソメラーゼｍｆｎＨ遺伝子ノックアウト二重交換突然変異培養株△ｍｆｎＨを取得した。

（実施例２）
ｄｓａＤ遺伝子（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．３に示し、そのコードされたアミノトランスフェラーゼＤｓａＤのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．７に示す）及びｄｓａＥ遺伝子（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．４に示し、そのコードされたイソメラーゼＤｓａＥのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．８に示す）のインフレーム欠失突然変異、及び異種宿主であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２における発現。

まず、ｄｓａＤ及びｄｓａＥ遺伝子に対してインフレーム欠失突然変異を行う。具体的な操作プロセスを以下に示す。
（１）文献にレポートされたＰＣＲ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇシステムを参照し、まず、エンドヌクレアーゼであるＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによりプラスミドｐＩＪ７７３を制限し、そのうち移転元（ｏｒｉＴ）及びアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含有する約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅によるｄｓａＤ及びｄｓａＥ遺伝子のノックアウトに所要のＤＮＡ断片として回収した。
（２）ｄｓａＤ及びｄｓａＥ遺伝子の配列に応じて、一対のノックアウトプライマーをそれぞれデザインし、このプライマーの特徴として、３９個のヌクレオチドが標的欠失突然変異遺伝子に相同（表３を参照、大文字に示す）し、１９又は２０個のヌクレオチドが耐性遺伝子断片の左端又は右端に相同（表３を参照、小文字に示す）し、また、３９個のヌクレオチドと１９／２０個のヌクレオチドとの間にエンドヌクレアーゼＳｐｅＩ部位を追加した（表３を参照、ＳｐｅＩ部位をアンダーラインで示す）。このプライマーを利用して、回収した移転元（ｏｒｉＴ）及びアプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含有する１．４ｋｂのＤＮＡ断片をテンプレートとし、ＰＣＲ増幅を行って１．４ｋｂのＰＣＲ生成物を取得した。５０μＬのＰＣＲ反応系：高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ３Ｕ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、ｄＮＴＰｓ０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＳＯ２．５μＬ、プライマーのそれぞれが０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＤＮＡテンプレートが約１ｎｇ、５０μＬまで水添加した。ＰＣＲ反応条件としては、９４℃で５ｍｉｎプレ変性し、９４℃で増幅サイクルし、４５ｓ変性し、５８℃で４５ｓアニーリングし、７２℃で９０ｓ伸ばし、３０回サイクルし、最後に７２℃で１０ｍｉｎ伸ばした。１．４ｋｂのＰＣＲ生成物をすぐに使えるようにそれぞれ回収、精製した。
（３）次に、ＳｕｐｅｒＣｏｓ１プラスミド由来のコスミド０７−６Ｈを、ｄｓａＤ及びｄｓａＥをインフレーム欠失突然変異させる開始コスミドとして選択した。このコスミドはｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスター（ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターのヌクレオチド配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＫＰ７６９８０７．１）を含有する。コスミド０７−６Ｈを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０に移してＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／０７−６Ｈを取得し、１０ｍＭのＬ−アラビノースを用いてλ／ｒｅｄリストラシステムの発現を誘導し、それをすぐに使えるようにコンピテントセルとして調製した。
（４）ステップ（２）で取得した１．４ｋｂのＰＣＲ生成物を、ステップ（３）で調製したコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／０７−６Ｈにそれぞれ電気穿孔し、リストラを発生させ、ＬＢスクリーニングプレート（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、５０μｇ／ｍＬアプラマイシンを含有する）に塗布し、３７℃で一晩培養した。プレート上からポジティブなモノクローナルを選び出し、プラスミドを抽出し、リストラコスミドは０７−６Ｈ−ＤＫＯ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯと名付けられ、０７−６Ｈ−ＤＫＯ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯにおけるｄｓａＤ及びｄｓａＥ遺伝子の一部断片はそれぞれ移転元及びアプラマイシン耐性遺伝子に置き換えられた。
（５）ＳｐｅＩによってリストラコスミド０７−６Ｈ−ＤＫＯ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯを制限し、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿を介してから、Ｔ４リガーゼにより接続し、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉＤＨ５を変換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養した。検出プライマー（表４を参照）によりクローンに対してＰＣＲ同定を行い、移転元及びアプラマイシン耐性遺伝子ＤＮＡ断片を損失して自己接続したコスミドを選び出して、０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＩＦ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＩＦと名付けた。

次に、ｄｓａＤ及びｄｓａＥ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたコスミド０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＩＦ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＩＦを、異種宿主ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２に導入して発現させた。ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２を導入する前に、まずコスミド０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＩＦ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＩＦを、異種発現に適応させるように改良した。改良の策略としては、大腸菌のλ／ｒｅｄリストラシステムによって、コスミド０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＩＦ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＩＦ上のプラスミドＳｕｐｅｒＣｏｓ１由来のカナマイシン耐性遺伝子を、それぞれアプラマイシン耐性遺伝子ａａｃ（３）ＩＶ、接合伝達元オリジナルｏｒｉＴ、インテグラーゼ遺伝子及びｉｎｔψＣ３１整合部位を含有するＮＤＡ断片として置き換えた。このａａｃ（３）ＩＶ−ｏｒｉＴ−ｉｎｔψＣ３のＤＮＡ断片は本実験室で構築したプラスミドｐＳＥＴ１５２ＡＢに由来し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを用いてプラスミドｐＳＥＴ１５２ＡＢを完全に制限した後、５．５ｋｂ程度の断片を回収し、この断片にａａｃ（３）ＩＶ−ｏｒｉＴ−ｉｎｔψＣ３ＤＮＡ断片及び置き換えられたカナマイシン遺伝子両側に相同の１．０ｋｂのＤＮＡ断片が含まれる。０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＩＦ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＩＦを、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０に移して、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＩＦ及びＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＩＦを取得した。約１００ｍｇの回収した５．５ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｅ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＩＦ及びＥ．ｃｏｌｉＢＷ２５１１３／ｐＩＪ７９０／０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＩＦコンピテントセルにそれぞれ加入し、ショットカップに移して、１．４ｋｖの電圧で電気穿孔を行った。ショックが完了した直後に、予め冷却した０．５ｍＬのＬＢ培養基に追加し、３７℃で１時間回復してから１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬアプラマイシンを含有するＬＢプレートに塗布した。１２時間後、形質転換体が成長した後に、検出プライマー（表４を参照）がＰＣＲにより陽性のリストラプラスミドを検証することで、陽性リストラプラスミドは、０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＡＢ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＡＢと名付けられた。構築したリストラプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２に電気穿孔して、Ｅ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＡＢ及びＥ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＡＢを、接合伝達のドナー株として取得した。

次に、Ｅ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＡＢ及びＥ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＡＢとＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２を接合伝達した。培養株Ｅ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＡＢ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＡＢを、３ｍＬのＬＢ液体培養基（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、５０μｇ／ｍＬアプラマイシン、２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコール及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する）にそれぞれ接種し、３７℃で１２時間培養した後、４０μＬ菌液を取って４ｍＬの同一培養基に転送してＯＤが０．６となるまで培養し、菌体を遠心収集し、何ら抗生物質が含まれないＬＢ液体培養基洗で２回清浄して、抗生物質を洗い流し、菌体をすぐに使えるように遠心濃縮した。それとともに、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２胞子を１０％グリセリンで集め、フィルターによって濾過した後、３６００ｒｐｍで８ｍｉｎ遠心し、上清を捨て、適量のＬＢ培養基に添加して胞子を浮遊させ、５０℃の水浴に置いて１０分間熱衝撃した。形質転換培養株Ｅ．ｃｏｌｉＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ−ＡＢ及び０７−６Ｈ−ＥＫＯ−ＡＢのそれぞれとＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２胞子とを体積比２：１の割合で混合させ、ＭＳ＋ＭｇＣｌ_２（最終濃度１０ｍＭ）固体プレートに塗布した。２０〜２４時間後、プレートを取り出して、抗生物質が含まれる水によりプレートをカバーし、最終濃度が１００μｇ／ｍＬアプラマイシン及び５０μｇ／ｍＬトリメトプリムとなり、乾燥後、２８℃のインキュベータ内に置いて、３−４日間培養してから観察した。接合伝達プレートに小さなコロニーが成長した後、無菌爪楊枝を用いて１００μｇ／ｍＬアプラマイシン及び５０μｇ／ｍＬトリメトプリムを含有するＭＳ培養基（大豆粉２０ｇ、マンニトール２０ｇ、寒天粉末２０ｇ、１Ｌまで水添加、ｐＨ７．２）プレートに移し、２８℃で２−３日間培養してから、各変異株の遺伝子群ＤＮＡを抽出し、検出プライマー（プライマー配列は表４を参照）を用いてＰＣＲ検出により陽性クローンを取得し、ｄｓａＤ及びｄｓａＥ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ生合成遺伝子クラスターの異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯをそれぞれ取得した。

（実施例３）
ｍａｒｆｏｒｍｙｃｉｎｓの生物発酵及び検出。
海洋ストレプトマイセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１野生菌又は変異株△ｍｆｎＯ及び△ｍｆｎＨを、ＩＳＰ２培養基（モルトエキス４ｇ、酵母エキス４ｇ、グルコース４ｇ、海塩３０ｇ、寒天粉末２０ｇ、１Ｌまで水添加、ｐＨ７．２）プレートにおいて活性化し芽胞生産した後、等量の胞子を２５０ｍＬ三角瓶の５０ｍＬｍ−ＡＭ２ａｂ発酵培養基（大豆粉１０ｇ、デンプン５ｇ、ペプトン２ｇ、グルコース２０ｇ、酵母エキス２ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、海塩３０ｇ、１Ｌまで水添加、ｐＨ７．０）にそれぞれ接種し、２８℃、２００ｒｐｍの条件で振盪発酵した。７日間培養した後、１００ｍＬのブタノンを加入して抽出を行い、３０ｍｉｎの超音波で細胞を破壊してから、静的層化する。ブタノン抽出液と水とが分離した後、上清抽出液を吸い取ってロータリーエバポレーターによってブタノンを乾燥するまで蒸発させ、残渣がメタノールに溶解してサンプルを形成し、効率よく液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）検出を行った。

検出条件としては、流動相Ａを１５％アセトニトリルとし、０．０３％酢酸を含み、流動相Ｂを８５％アセトニトリルとするＡｌｌｔｉｍａＣ１８（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）逆相カラムであって、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２１５ｎｍ及び２７５ｎｍである。

ＨＰＬＣ注入プログラム：０−２０ｍｉｎ，０％−１００％Ｂ相；２０−２５ｍｉｎ，１００％Ｂ相；２５．０１−３０ｍｉｎ，１００％−０％Ｂ相。

結果として図７に示すように、野生型産生株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１から化合物３、４及び５を生成し、△ｍｆｎＨはＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物３及び４を完全に生産しないが、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物５及び７を生成し、かつ化合物７の生産量が野生型培養株よりも約１００倍程度向上し（図７を参照）、△ｍｆｎＯもＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物４を完全に生産しないが、それでもＬ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物５及び７を生成可能となる（図７を参照）。

（実施例４）
ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生物発酵及び検出。
ｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓ野生型産生株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｃｏｐｕｌｉｒｉｄｉｓＳＣＳＩＯＺＪ４６をＩＳＰ４培養基プレートに塗布し、活性化して芽胞生産し、かつ異種発現対照培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２と、ｄｓａＤ及びｄｓａＥ欠失突然変異異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯを、ＭＳ培養基（大豆粉２０ｇ、マンニトール２０ｇ、寒天粉末２０ｇ、１Ｌまで水添加、ｐＨ７．２）プレートに塗布し、活性化して芽胞生産した。等量の胞子を、２５０ｍＬ三角瓶の５０ｍＬｍ−ＡＭ２ａｂ発酵培養基（大豆粉１０ｇ、デンプン５ｇ、ペプトン２ｇ、グルコース２０ｇ、酵母エキス２ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、炭酸カルシウム２ｇ、海塩３０ｇ、１Ｌまで水添加、ｐＨ７．０）に接種し、２８℃、２００ｒｐｍの条件で振盪発酵した。７日間培養した後、１００ｍＬのブタノンを加入して抽出を行い、３０ｍｉｎの超音波で細胞を破壊してから、静的層化する。ブタノン抽出液と水相とが分離した後、上層抽出液を吸い取ってロータリーエバポレーターによってブタノンを乾燥するまで蒸発させ、残渣がメタノールに溶解してサンプルを形成し、効率よく液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）検出を行った。

結果としては図１０に示すように、ｄｓａＥ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯはＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物８及び１０を生産しないが、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物９及び１１を生産することができ、かつこれら２つの化合物の生産量は対照培養株に比べてともに大きく向上する（化合物９が約１００倍になり、化合物１１が約１４０倍程度になる）（図１０を参照）。ｄｓａＤ遺伝子がインフレーム欠失突然変異された異種発現培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯは、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ構造単位を含有する化合物８及び１０を生成することができるが、生産量が大きく低下したため、Ｌ−Ｖａｌ構造単位を含有する化合物９及び１１を生成することができ、かつ生産量が大幅に向上する（化合物９が約８０倍になり、化合物１１が約５０倍になる）。

（実施例５）
アミノトランスフェラーゼＤｓａＤ（そのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．７に示す）、イソメラーゼＤｓａＥ（そのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．８に示す）、アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ（そのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．５に示す）及びイソメラーゼＭｆｎＨ（そのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６に示す）のＥ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）における発現及び精製。

ｄｓａＤ（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．３に示す）、ｄｓａＥ（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．４に示す）、ｍｆｎＯ（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示す）、ｍｆｎＨ（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示す）遺伝子を、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ｄｓａＤ、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ｄｓａＥ、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ｍｆｎＯ、ｐＥＴ２８ａ（＋）／ｍｆｎＨを取得するように、一般的な方法でキャリアｐＥＴ２８ａ（＋）のＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位の間にクローニングし、シーケンシングされて正しいと、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し発現させた。取得した形質転換培養株からモノクローナルを選び出して一晩培養した後、１％の接種量で仕様１Ｌの三角瓶において５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２００ｍＬのＬＢ培養液体（培養株ごとに合計１ＬのＬＢ培養基に接種した）に接種し、３７℃のシェーカーで２００ｒｐｍ／ｍｉｎにてＯＤ６００が約０．６となるまで培養した時に、培養液に最終濃度０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、２５℃で１２−１５ｈ続けて誘導し発現させた。菌体を遠心収集し、５０ｍＬｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて菌体を２回清浄してから、再び３０ｍＬのｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒにおいて浮遊させ、超音波で破壊してタンパクを放出してから、高速で冷凍し低温で不溶性部分を遠心除去した。可溶性の上清部分をニッケル柱ＨｉｓＴｒａｐＨＴｃｏｌｕｍｎ（１ｍＬ，ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に積載し、濾液が全て濾過された後、１０ｍＬのｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ１（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で清浄して、２ｍＬのｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ２（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、９０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で清浄して、最後に５ｍＬのｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出させた。限外濾過管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，１０ｍＬ，３ｋＤ）によって２．５ｍＬまで濃縮させ、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を介して脱塩した後、１０％グリセリンを含有するリン酸ナトリウムｌ緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）に保存し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を採用してタンパク質濃度の測定を行い、すぐに使えるように−８０℃で分けて保管することで、精製したアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、イソメラーゼＤｓａＥ、アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ及びイソメラーゼＭｆｎＨをそれぞれ取得した。精製後のタンパク電気泳動図は図１１に示す。

（実施例６）
ＤｓａＤ／ＤｓａＥ及びＭｆｎＯ／ＭｆｎＨインビトロ酵素反応及び検出。
（１）Ｌ−Ｉｌｅを基質とする場合にアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ／イソメラーゼＤｓａＥ及びアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ／イソメラーゼＭｆｎＨの酵素活性を検出した。即ち、１００μＬリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ又はＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥ又はＭｆｎＨを加え、３０℃の条件で４時間反応させた。

（２）Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを基質とする場合にアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ／イソメラーゼＤｓａＥ及びアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ／イソメラーゼの酵素活性を検出した。即ち、１００μＬリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ又はＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥ又はＭｆｎＨを加え、３０℃の条件で４時間反応させた。

反応終了後、２００μＬのメタノールを加えて反応を終了させ、渦振動し、室温でそのまま２０分間置いてから、１，２０００×ｇで２０分間遠心させ、上清を取ってロータリーエバポレーターによって乾燥するまで蒸発させ、残渣を４０μＬの２ｍＭＣｕＳＯ_４溶液に溶解し、２５μＬ取ってキラルＨＰＬＣ分析を行うことで、酵素反応を検出した。キラルＨＰＬＣ分析条件：ＭＣＩＧＥＬＣＲＳ１０Ｗｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ，５０×４．６ｍｍ，３μｍ）キラル分析カラムを用い、流動相が２ｍＭのＣｕＳＯ_４溶液、流動速度が１ｍＬ／ｍｉｎ、検出時間が３０分間、検出波長が２５４ｎｍである。

（実施例７）
一、Ｌ−Ｉｌｅを基質として触媒反応を行う。
（１）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、５μＭイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させた。反応終了後、２０ｍＬのメタノールを加えて反応を終了させ、渦振動し、室温でそのまま２０分間置いてから、１，２０００×ｇで２０分間遠心し、上清を取って乾燥するまで蒸発させ、残渣を２ｍＭのＣｕＳＯ_４溶液に溶解し、キラルＨＰＬＣによって精製し、条件としては、ＭＣＩＧＥＬＣＲＳ１０Ｗｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ、５０×４．６ｍｍ、３μｍ）キラル分析カラムを用い、流動相が２ｍＭのＣｕＳＯ_４溶液、流動速度が１ｍＬ／ｍｉｎ、検出時間が３０分間、検出波長が２５４ｎｍである。保持時間が１３分間であるフラクションを出し合併してから、エチレンジアミンテトラデカン酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）を最終濃度が２ｍＭとなるまで添加するとともに、上記混合液のｐＨを４．０となるまで調整した。同体積のＮ−ヘプタン及び二−（２−エチルヘキシルホスホン酸）の混合液（７：３）を用いて上記ｐＨ４．０溶液に対し２回抽出を行い、有機相を収集し合併した。同体積の５％のＨＣｌ溶液で、上記収集し合併した有機相に対して逆抽出を２回行い、水相を収集し合併した。収集し合併した水相を乾燥するまで蒸発させ、残渣をさらに陽性シリカゲルカラムによって精製させ（ブタノール−氷酢酸−水（４：１：５）によりアイソクラティック溶出を行う）、純粋な酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを取得した（図１２Ａ中のＶ、図１２Ａ及び１２Ｂにおいてｉ及びｉｉはそれぞれＬ−Ｉｌｅ及びＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの標準品である）。その^１ＨＮＭＲ図は図１３に示す。

酵素反応生成物ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ：ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］^＋＝１３２．１０３８（ｃａｌｃ．ｆｏｒＣ_６Ｈ_１３ＮＯ_２，１３２．１０１９）； ^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ），δ０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），０．８３（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．１９〜１．４０（２Ｈ，ｍ），１．９６（１Ｈ，ｍ），３．６２（１Ｈ，ｍ）．［α］_Ｄ ^２５＋２３．４^ｏ（ｃ０．０５７５，ａｑＨＣｌ，ｐＨ２．５）．ＣＤ［θ］_２０２＋１６５．７° （ｃ０．０５７５，ａｑ．ＨＣｌ，ｐＨ２．５）．
ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ標準品：^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ），δ０．８６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），０．８４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），１．２０〜１．４０（２Ｈ，ｍ），１．９８（１Ｈ，ｍ），３．６４（１Ｈ，ｍ）．［α］_Ｄ ^２５＋２３．２^ｏ（ｃ０．１，ａｑＨＣｌ，ｐＨ２．５）．ＣＤ［θ］_２０２＋３３３．３^ｏ（ｃ０．１，ａｑ．ＨＣｌ，ｐＨ２．５）．

（２）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）に１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭアミノトランスフェラーゼＤｓａＤを添加し、３０℃の条件で４時間反応させた。ステップ（１）により分析及び構造同定を行って、酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１２Ａにおけるｉｉｉ）を取得しなかった。

（３）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させた。ステップ（１）により分析及び構造同定を行って、酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１２ＡにおけるｉＶ）を取得しなかった。

（４）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅを添加し、何ら酵素を加えず、３０℃の条件で４時間反応させた。ステップ（１）により分析及び構造同定を行って、酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１２ＡにおけるＶｉ）を取得しなかった。

（５）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させた。ステップ（１）により分析及び構造同定を行い、純粋な酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１２ＢにおけるＶ）を取得した。

（６）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯを添加し、３０℃の条件で４時間反応させた。ステップ（１）により分析及び構造同定を行い、酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１２Ｂにおけるｉｉｉ）を取得しなかった。

（７）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させた。ステップ（１）により分析及び構造同定を行い、酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１２ＢにおけるｉＶ）を取得しなかった。

（８）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅを添加し、何ら酵素を添加せず、３０℃の条件で４時間反応させた。ステップ（１）により分析及び構造同定を行い、酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１２ＢにおけるＶｉ）を取得しなかった。

二、Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを基質とする。
（１）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４ＡにおけるＶ、図１４Ａ及び１４Ｂにおけるｉ及びｉｉはそれぞれＬ−Ｉｌｅ及びＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの標準品である）を取得した。

（２）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤを取得し、３０℃の条件で４時間反応させ、反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４Ａにおけるｉｉｉ）を取得しなかった。

（３）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４ＡにおけるｉＶ）を取得しなかった。

（４）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを添加し、何ら酵素を添加せず、３０℃の条件で４時間反応させ、酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４ＡにおけるＶｉ）を取得しなかった。

（５）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４ＢにおけるＶ）を取得した。

（６）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４Ｂにおけるｉｉｉ）を取得しなかった。

（７）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４ＢにおけるｉＶ）を取得しなかった。

（８）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを添加し、何ら酵素を添加せず、３０℃の条件で４時間反応させ、酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１４ＢにおけるＶｉ）を取得しなかった。

三、
（１）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１６Ａにけるｉｉｉ、図１６Ａ及び１６Ｂにおけるｉ及びｉｉはそれぞれＬ−Ｉｌｅ及びＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅの標準品である）を取得した。

（２）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１６ＡにおけるｉＶ）を取得した。

（３）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１６ＡにおけるＶ）を取得した。

（４）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１６ＡにおけるＶｉ）を取得した。

（５）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅを添加し、何ら酵素を添加せず、３０℃の条件で４時間反応させ、酵素反応生成物Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（図１６ＡにおけるＶｉｉ）を取得しなかった。

（６）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１６Ｂにおけるｉｉｉ）を取得した。

（７）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１６ＢにおけるｉＶ）を取得した。

（８）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＭｆｎＨを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１６ＢにおけるＶ）を取得した。

（９）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させ、純粋な酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１６ＢにおけるＶｉ）を取得した。

（１０）１０ｍＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、１ｍＭの基質Ｌ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅを添加し、何ら酵素を添加せず、３０℃の条件で４時間反応させ、酵素反応生成物Ｌ−Ｉｌｅ（図１６ＢにおけるＶｉｉ）を取得しなかった。

（実施例８）
ＤｓａＤ／ＤｓａＥ触媒反応の可逆反応平衡定数の測定。
５０μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）において、２．５ｍＭの基質Ｌ−Ｉｌｅ又はＬ−ａｌｌｏ−Ｉｌｅ、０．１ｍＭのＰＬＰ、５μＭのアミノトランスフェラーゼＤｓａＤ、５μＭのイソメラーゼＤｓａＥを添加し、３０℃の条件で４時間反応させた。反応終了後、２００μＬのメタノールを加えて反応を終了させ、渦振動し、室温でそのまま２０分間置いてから、１，２０００×ｇで２０分間遠心させ、上清を取ってロータリーエバポレーターによって乾燥するまで蒸発させ、残渣を４０μＬの２ｍＭのＣｕＳＯ_４溶液に溶解し、２５μＬ取ってキラルＨＰＬＣ分析を行うことで、酵素反応を検出した。キラルＨＰＬＣ分析条件：ＭＣＩＧＥＬＣＲＳ１０Ｗｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ，５０×４．６ｍｍ，３μｍ）キラル分析カラムを用い、流動相が２ｍＭのＣｕＳＯ_４溶液、流動速度が１ｍＬ／ｍｉｎ、検出時間が３０分間、検出波長が２５４ｎｍである。基質及び生成物の最終濃度は対応するＨＰＬＣピーク値を積分算出して得た。平衡定数（Ｋｅｑ）は下記の算出式から算出してＫｅｑ＝（［生成物濃度］／［基質濃度］）を得た。

測定した結果、Ｌ−Ｉｌｅを基質とする場合に、ＤｓａＤ／ＤｓａＥ触媒反応の可逆反応の平衡定数は１．３７である（図１５を参照）。

（付記）
（付記１）
Ｌ−イソロイシンを触媒反応してＬ−アロイソロイシンを形成するか、又はＬ−アロイソロイシンを触媒反応してＬ−イソロイシンを形成することにおけるアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼからなる酵素ペアの応用であって、前記アミノトランスフェラーゼは、アミノトランスフェラーゼＤｓａＤ又はアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯであり、前記イソメラーゼは、イソメラーゼＤｓａＥ又はイソメラーゼＭｆｎＨであり、前記アミノトランスフェラーゼＤｓａＤのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．７に示しており、前記イソメラーゼＤｓａＥのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．８に示しており、前記アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．５に示しており、前記イソメラーゼＭｆｎＨのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６に示している応用。

（付記２）
前記アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯのコーディング遺伝子であるｍｆｎＯ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示していることを特徴とする付記１に記載の応用。

（付記３）
前記イソメラーゼＭｆｎＨのコーディング遺伝子であるｍｆｎＨ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示していることを特徴とする付記１に記載の応用。

（付記４）
前記アミノトランスフェラーゼＤｓａＤのコーディング遺伝子であるｄｓａＤ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．３に示していることを特徴とする付記１に記載の応用。

（付記５）
前記イソメラーゼＤｓａＥのコーディング遺伝子であるｄｓａＥ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．４に示していることを特徴とする付記１に記載の応用。

（付記６）
化合物７を高収率で生成する培養株△ｍｆｎＨであって、前記培養株△ｍｆｎＨは、野生型ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｄｒｏｚｄｏｗｉｃｚｉｉＳＣＳＩＯ１０１４１のｍｆｎＨ遺伝子をノックアウトして欠失させ突然変異させて得たものであり、
前記化合物７の構造式が化３に示すことを特徴とする、化合物７を高収率で生成する培養株△ｍｆｎＨ（但し、Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＣＨ_３、Ｒ_３＝ＯＨ）。

（付記７）
化合物９及び１１を高収率で生成する培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯであって、前記培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯは、ＤｓａＥ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターを培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２に導入し発現させて得たものであり、前記ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯは、ＤｓａＤ遺伝子がインフレーム欠失突然変異されたｄｅｓｏｔａｍｉｄｅｓの生合成遺伝子クラスターを培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２に導入し発現させて得たものであり、
前記化合物９及び１１の構造は化４に示すことを特徴とする、化合物９及び１１を高収率で生成する培養株ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＥＫＯ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒＭ１１５２／０７−６Ｈ−ＤＫＯ（但し、化合物９：Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＮＨ_２、化合物１１：Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＯＨ）。

Claims

Ｌ−イソロイシンを触媒反応してＬ−アロイソロイシンを形成するか、又はＬ−アロイソロイシンを触媒反応してＬ−イソロイシンを形成することにおけるアミノトランスフェラーゼ及びイソメラーゼからなる酵素ペアの応用であって、前記アミノトランスフェラーゼは、アミノトランスフェラーゼＤｓａＤ又はアミノトランスフェラーゼＭｆｎＯであり、前記イソメラーゼは、イソメラーゼＤｓａＥ又はイソメラーゼＭｆｎＨであり、前記アミノトランスフェラーゼＤｓａＤのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．７に示しており、前記イソメラーゼＤｓａＥのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．８に示しており、前記アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．５に示しており、前記イソメラーゼＭｆｎＨのアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．６に示している応用。
前記アミノトランスフェラーゼＭｆｎＯのコーディング遺伝子であるｍｆｎＯ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１に示していることを特徴とする請求項１に記載の応用。
前記イソメラーゼＭｆｎＨのコーディング遺伝子であるｍｆｎＨ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．２に示していることを特徴とする請求項１に記載の応用。
前記アミノトランスフェラーゼＤｓａＤのコーディング遺伝子であるｄｓａＤ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．３に示していることを特徴とする請求項１に記載の応用。
前記イソメラーゼＤｓａＥのコーディング遺伝子であるｄｓａＥ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ．４に示していることを特徴とする請求項１に記載の応用。