CN112813013A

CN112813013A - 一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用

Info

Publication number: CN112813013A
Application number: CN202110176003.0A
Authority: CN
Inventors: 陈献忠; 刘春筱; 夏媛媛; 沈微; 杨海泉; 陈磊
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-02-06
Filing date: 2021-02-06
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2041-02-06
Also published as: CN112813013B

Abstract

本发明公开了一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明采用E.coli YMGR5A作为宿主菌株，表达了大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中4‑羟苯基乙酸羟化酶基因HpaBC(GenBank登录号：CP053601.1)，即在宿主菌株基因组中，删除poxB基因并在该位点整合HpaBC基因，获得羟基酪醇高产菌株E.coli YMGRD1H1。采用本发明提供的重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1在葡萄糖的培养基中发酵生产羟基酪醇的产量可高达2.95g/L。

Description

一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

羟基酪醇(hydroxytyrosol)是一种天然的多酚类化合物，主要来源于橄榄油中。众所周知，橄榄油被称为“液体黄金”。橄榄油是目前为止最易于人体健康的油类物质，具有多种营养价值。橄榄油中一种重要的作用物质，即为羟基酪醇。羟基酪醇由于具有多种生理和药理活性，使其应用范围广泛，如食品、药品、化妆品等领域。

目前已知的羟基酪醇作用就有多种：(1)心血管药物的合成：对动脉硬化、高血压、心脏病、脑溢血等预防与治疗；(2)安全高效的抗氧剂：应用于美容产品保健品；(3)抗衰老、对骨骼系统有益处：有助于人体对矿物质的吸收，减少骨骼疏松；(4)提高内分泌系统功能，促进新陈代谢，促进伤口愈合，消除体内自由基，恢复人体脏腑器官的健康状态，延缓衰老；(5)抗癌防癌：促进癌症后期恢复和提高化疗效果；(6)降低和抑制吸烟对人体的危害：防治因吸烟导致的多种病变。因此，大规模生产羟基酪醇成为必然的一种趋势。

目前我国对羟基酪醇的生产仍然处于天然提取和化学合成阶段；天然提取主要是从橄榄果、叶以及在橄榄油制备过程中产生的残渣和废水中进行的，其优点是原始材料便宜且丰富，但缺点是使用强酸性水蒸汽，回收率低，且易产生二次污染；而化学合成的缺点就更为明显，使用基质相对昂贵，并且这些过程通常需要保护和脱保护步骤，降低总收率；成本高、污染严重、安全性低，不能应用于食品及药品的添加。

目前，在现有报道当中，虽然有采用安全高效的生物法合成羟基酪醇，例如：通过表达埃及糖精的Sam5进行生产羟基酪醇(记载于Production of three phenylethanoids,tyrosol,hydroxytyrosol,and salidroside,using plant genes expressing inEscherichia coli论文中)，但是其转化效率不如采用羟化酶基因HpaBC；而现有技术中，诸如粘质沙雷氏菌，铜绿假单胞菌，恶臭假单胞菌F6和盐单胞菌等含有的羟化酶具有同样的功能，如何选择合适的羟化酶基因HpaBC以高效的制备羟基酪醇，成为研究的热点。

发明内容

技术问题

本发明所要解决的技术问题是：提供一种安全高效、价格低廉并且不需要用诱导剂、抗生素的生物法合成羟基酪醇的方法。

技术方案

在现有技术的基础上，本发明提供了一种生物合成羟基酪醇的方法。利用现代生物基因工程的技术，在已有酪醇高产菌株的基础上构建了一株高产羟基酪醇的方法(代谢途径的改造方法如图4所示)，且发酵不需要诱导剂和抗生素。

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组大肠杆菌，以大肠杆菌CCTCC NO：M2019390为宿主细胞，并且表达了来源于大肠杆菌的羟化酶基因HpaBC。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌CCTCC NO：M2019390记载于公开号为CN110452865A的中国专利申请文本中，命名为E.coli YMGR5A。

在本发明的一种实施方式中，所述羟化酶HpaBC包括羟化酶HpaB和羟化酶HpaC，其中，羟化酶HpaB的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，羟化酶HpaC的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述羟化酶HpaBC的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。

本发明还提供了一种构建上述重组大肠杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)重组质粒pEtac-HpaBC的构建：以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组为模板，进行PCR获得HpaBC基因，并插入到质粒pEtac中，获得重组质粒pEtac-HpaBC；所述pEtac的构建方法记载于：沈微等“古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达”当中；

(2)poxB∷HpaBC删除表达盒的构建：设计引物，采用PCR扩增得到片段poxBUP、poxBDown、tac-HpaBC-T7 terminater，并上述片段进行连接，获得poxB∷HpaBC删除表达盒；

(3)采用CRISPR-cas9的方法，先将pCas质粒采用电转化的方法转化进入大肠杆菌CCTCC NO：M2019390感受态细胞中，然后将带有sgRNA的质粒sg-pTarget及poxB∷HpaBC的删除表达盒电转化进入大肠杆菌CCTCC NO：M2019390感受态细胞中；挑取转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的菌株，利用IPTG进行诱导，消除sg-pTarget质粒，构建得到重组大肠杆菌，命名为E.coli YMGRD1H1。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，HpaBC基因从大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组中经PCR的方法获得，并插入到质粒pEtac的EcoR I与Hind III位点，获得重组质粒pEtac-HpaBC。

本发明还提供了一种生产羟基酪醇的方法，所述方法为采用上述重组大肠杆菌发酵生产羟基酪醇。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将所述重组大肠杆菌接种至种子培养基中培养，制备得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，发酵制备羟基酪醇。

在本发明的一种实施方式中，将所述重组大肠杆菌接种至LB固体培养基上培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于35～39℃、180-220r/min条件下培养10～14h，制备得到种子液。

在本发明的一种实施方式中，将述重组大肠杆菌接种至LB固体培养基上划线培养，挑取单菌落接种于装有20mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，于35～39℃、180-220r/min条件下培养10～14h，制备得到种子液。

在本发明的一种实施方式中，将制备得到的种子液接种至LB液体培养基中，在35～39℃、180-220r/min条件下培养10～14h后收集菌体；将收集得到的菌体接种至M9Y液体培养基中进行发酵培养，制备得到羟基酪醇。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液按照接种量为1％(v/v)的比例接种于LB液体培养基。

在本发明的一种实施方式中，摇瓶发酵条件：按1％(v/v)接种量接入到装有50mLLB液体培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养10h后收集菌体，并用生理盐水清洗菌体一次。转入装有50mL M9Y液体培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、200r/min培养48h。

在本发明的一种实施方式中，发酵罐发酵条件：按1％(v/v)的接种量接入到装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养至OD₆₀₀＝1，按照10％(v/v)的接种量转入装有2L M9Y液体培养基的5L发酵罐中，通气量1VVM，转速600r/min于37℃培养14h后转为30℃继续培养至48h。发酵过程中适量补加葡萄糖和酵母粉。

本发明还提供了上述重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1在制备羟基酪醇及含有羟基酪醇的产品中的应用。

有益效果

(1)采用本发明提供的重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1能够实现将葡萄糖转化为羟基酪醇，并且，在发酵过程中无需添加诱导剂及抗生素；因此本发明的原材料廉价易得，无危害人体健康的添加剂、重金属和抗生素，为后期的产物提纯奠定良好的基础，更能够达到商业应用的要求。

(2)采用本发明提供的重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1在葡萄糖的培养基中发酵生产羟基酪醇的产量可高达2.95g/L，高于目前绝大多数研究团队的结果。

(3)采用本发明构建的重组菌株YMGRD1H1发酵生产羟基酪醇，在48小时羟基酪醇的产量是采用YMGR5A/pEtac-HpaBC发酵生产羟基酪醇的产量的12倍。

附图说明

图1：本发明所构建的菌株E.coli YMGRD1H1与出发菌株YMGR5A发酵的酪醇产量结果。

图2：本发明所构建的菌株E.coli YMGRD1H1发酵的羟基酪醇产量结果。

图3：本发明所构建的菌株E.coli YMGRD1H1发酵罐发酵的OD₆₀₀及羟基酪醇产量结果。

图4：本发明所构建的菌株E.coli YMGRD1H1主要代谢途径改造。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的重组质粒pEtac的构建方法记载于：沈微等“古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达”，江南大学文献当中。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基配方(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，固体培养基另加1.5％-2.0％琼脂粉。

M9Y培养基配方(g/L)：Na₂HPO₄·12H₂O 17.1，KH₂PO₄ 3，NaCl 0.5，NH₄Cl 1，葡萄糖20，酵母粉0.25，补加终浓度MgSO₄ 5mmol·L-1。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

酪醇及羟基酪醇检测方法，采用高效液相色谱(HPLC)检测。色谱检测条件具体如下：Agela Innoval C18色谱柱(4.6×250mm，孔径为5μm)；流动相为80％的0.1％甲酸水溶液，20％的甲醇；流速1mL/min；进样量10μL；紫外检测器，检测波长280nm；柱温为28℃。

下述实施例中所涉及的引物如表1所示：

表1引物序列

实施例1：羟化酶基因HpaBC游离表达菌株的构建

具体步骤如下：

1、pEtac-HpaBC质粒的构建

HpaBC基因(核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示)是从大肠杆菌E.coli BL21(DE3)基因组中经PCR的方法获得，并将EcoR I与Hind III酶切位点设计在引物HpaBC-L和HpaBC-R中，将目的片段与pEtac质粒进行两位点的酶切纯化后，用Solution I连接酶进行连接，经过化学转化法转入E.coli JM109中，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上，于37℃培养箱培养10-12h，将长出的单菌落进行酶切验证，将正确的菌株进行培养后重组质粒pEtac-HpaBC的提取。

2、羟化酶基因HpaBC游离表达菌株的构建

(1)制备E.coli YMGR5A感受态细胞：将E.coli YMGR5A菌株接种至LB固体培养基上划线培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于装有20mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，于37℃、200r/min进行活化培养12h，制备得到种子液。将制备得到的种子液以1％(v/v)的接种量接种至装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，在37℃、200r/min条件下培养至OD₆₀₀＝0.5得到发酵液，将发酵液冰浴30min后于4℃下6000r/min离心5min收集菌体，将获得的菌体用预冷超纯水洗涤1次，用0.1mol/L的预冷CaCl₂溶液洗涤3次，向所收得的菌体中加入2mL浓度为0.1mol/L的CaCl₂溶液和2mL 30％的甘油。每份100μL分装与于1.5mL的EP管中于-70℃储存备用，制备得到E.coli YMGR5A感受态细胞。

(2)将步骤1制备得到的重组质粒pEtac-HpaBC采用化学法导入步骤(1)得到的E.coli YMGR5A感受态细胞中，得到转化产物，将转化产物涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基中，于37℃培养至长出转化子。将转化子进行养菌提质粒，将质粒进行EcoR I与HindIII酶切验证，验证正确的菌株进行甘油管保藏，得到游离型重组大肠杆菌E.coli YMGR5A/pEtac-HpaBC。

实施例2：重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1的构建

具体步骤如下：

(1)poxB∷HpaBC删除表达盒的构建：根据poxB(Gene ID 946132)基因以及实施例1制备得到的重组质粒pEtac-HpaBC的基因序列设计引物700poxB-U-L、700poxB-U-R，poxB-HpaBC-L、poxB-HpaBC-R，700poxB-D-L、700poxB-D-R(如表1所示)；以大肠杆菌E.coliMG1655基因组以及质粒pEtac-HpaBC为模板分别扩增，得到片段poxBUP、poxBDown、tac-HpaBC-T7 terminater；以500poxB-U-L，500poxB-D-R为引物，采用巢式PCR的方法将三个片段进行连接，获得poxB∷HpaBC删除表达盒。

(2)利用CRISPR-cas9的方法，按照实施例1中的步骤(2)的方法将E.coli YMGR5A制备成电转感受态，将携带转运蛋白基因的质粒pCas电转化进入感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性的LB固体培养基平板上，长出的单菌落即为YMGR5A/pCas。

(3)设计poxB位点sgRNA引物Sg-poxB、pTarget-R，以pTarget质粒为模板进行PCR，将获得的基因片段进行Bcu I酶切纯化，采用Solution I酶将片段连接后采用化学转化法转入E.coli JM109感受态细胞中，得到转化产物，将转化产物涂布于壮观霉素的LB固体培养基平板上，将长出的单菌落采用引物testSg-poxB、pTarget-R进行菌落PCR验证，验证正确的菌株即为sg-pTarget质粒。

(4)将sg-pTarget质粒及上述的poxB∷HpaBC的删除表达盒共同电转化进入YMGR5A/pCas感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素和壮观霉素双抗性的LB固体培养基平板上，于30℃培养24h，将长出的转化子用引物700poxB-U-L、700poxB-D-R进行菌落PCR验证，菌株YMGR5A/pCas作为对照。

(5)挑取正确的菌株利用IPTG进行诱导后，涂布于含有卡那霉素单抗性的LB固体培养基平板上，于30℃培养。挑取生长的单菌落进行点板验证，仅在卡那霉素单抗性的平板上生长而双抗性平板上不生长的菌落视为消除sg-pTarget质粒的菌株。将该菌株于无抗性的LB固体培养基的平板上划线，于42℃下培养至长出单菌落，同样进行点板验证，仅在无抗性的平板上生长而卡那霉素抗性平板上不生长的菌落视为消除pCas质粒的菌株，即为无抗性的稳定菌株E.coli YMGRD1H1。

实施例3：摇瓶发酵生产羟基酪醇

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1制备得到的重组大肠杆菌E.coli YMGR5A/pEtac-HpaBC和实施例2制备得到的E.coli YMGRD1H1菌株在LB固体培养基上划线培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于装有20mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养12h；制备得到种子液。

(2)将步骤(1)制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量接入到装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养10h后收集菌体；

(3)将步骤(2)得到的菌体采用生理盐水清洗菌体一次后，转入装有50mL M9Y液体培养基的250mL锥形瓶中，于30℃、200r/min培养48h。

每隔12h取样检测产物含量，结果如表2～3和图1～2所示。其中，酪醇产量结果如图1所示，羟基酪醇产量结果如图2所示。

表2：不同的重组大肠杆菌的酪醇产量

时间h	YMGR5A	YMGRD1H1(g/L)
			0	0.00	0.00
12	0.58	0.33
			24	0.91	0.47
36	1.048	0.25
			48	1.04	0.20

表3：不同的重组大肠杆菌的羟基酪醇产量

时间h	YMGR5A/pEtac-HpaBC(g/L)	YMGRD1H1(g/L)
			0	0.00	0.00
12	0.11	0.35
			24	0.13	0.84
36	0.13	1.51
			48	0.15	1.81

由表2和表3可知，采用本发明构建的重组菌株YMGRD1H1发酵生产羟基酪醇，在48小时羟基酪醇的产量是采用YMGR5A/pEtac-HpaBC发酵生产羟基酪醇的产量的12倍。

实施例4：5-L发酵罐发酵生产羟基酪醇

具体步骤如下：

(1)将实施例2制备得到的E.coli YMGRD1H1菌株在LB固体培养基上划线培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于装有20mL LB液体培养基的100mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养12h，制备得到种子液；

(2)将步骤(1)制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量接入到装有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，于37℃、200r/min培养至OD₆₀₀＝1，得到发酵液；

(3)将步骤(2)制备得到的发酵液按照10％(v/v)的接种量转入装有2L M9Y液体培养基的5L发酵罐中，通气量1VVM，转速600r/min，于37℃培养14h后，转为30℃继续培养至48h；

发酵过程中适量补加葡萄糖和酵母粉。每隔4h取样检测OD₆₀₀和羟基酪醇产量。结果如图3和表4所示。

表4：重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1不同时间生产羟基酪醇产量

时间h	OD<sub>600</sub>	羟基酪醇g/L
			0	0.017	0.002
4	1.49	0.11
			8	6.84	0.31
12	16.64	1.14
			16	24.88	2.17
20	26.64	2.76
			24	36.48	2.95
28	33.6	2.89
			32	33.8	2.80
36	35.4	2.91
			40	38.4	2.59
44	35.1	2.50
			48	33	2.63

由表4可知，采用本发明提供重组大肠杆菌E.coli YMGRD1H1在发酵24h发酵生产羟基酪醇的产量可达2.95g/L，并且在反应过程中，菌体的生长并没有得到抑制，因此，本发明的技术方案更加适合于工业生产。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用

<130> BAA210115A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Pro Glu Asp Phe Arg Ala Ser Thr Gln Arg Pro Phe Thr Gly

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Asp Gly Arg Glu Ile Tyr Ile Tyr

20 25 30

Gly Glu Arg Val Lys Asp Val Thr Thr His Pro Ala Phe Arg Asn Ala

35 40 45

Ala Ala Ser Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Leu His Lys Pro Glu Met

50 55 60

Gln Asp Ser Leu Cys Trp Asn Thr Asp Thr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr

65 70 75 80

His Lys Phe Phe Arg Val Ala Lys Ser Ala Asp Asp Leu Arg Gln Gln

85 90 95

Arg Asp Ala Ile Ala Glu Trp Ser Arg Leu Ser Tyr Gly Trp Met Gly

100 105 110

Arg Thr Pro Asp Tyr Lys Ala Ala Phe Gly Cys Ala Leu Gly Ala Asn

115 120 125

Pro Gly Phe Tyr Gly Gln Phe Glu Gln Asn Ala Arg Asn Trp Tyr Thr

130 135 140

Arg Ile Gln Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Asn His Ala Ile Val Asn Pro

145 150 155 160

Pro Ile Asp Arg His Leu Pro Thr Asp Lys Val Lys Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Lys Leu Glu Lys Glu Thr Asp Ala Gly Ile Ile Val Ser Gly Ala Lys

180 185 190

Val Val Ala Thr Asn Ser Ala Leu Thr His Tyr Asn Met Ile Gly Phe

195 200 205

Gly Ser Ala Gln Val Met Gly Glu Asn Pro Asp Phe Ala Leu Met Phe

210 215 220

Val Ala Pro Met Asp Ala Asp Gly Val Lys Leu Ile Ser Arg Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Glu Met Val Ala Gly Ala Thr Gly Ser Pro Tyr Asp Tyr Pro Leu

245 250 255

Ser Ser Arg Phe Asp Glu Asn Asp Ala Ile Leu Val Met Asp Asn Val

260 265 270

Leu Ile Pro Trp Glu Asn Val Leu Ile Tyr Arg Asp Phe Asp Arg Cys

275 280 285

Arg Arg Trp Thr Met Glu Gly Gly Phe Ala Arg Met Tyr Pro Leu Gln

290 295 300

Ala Cys Val Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Phe Ile Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Gly Thr Leu Glu Phe Arg Gly Val Gln

325 330 335

Ala Asp Leu Gly Glu Val Val Ala Trp Arg Asn Thr Phe Trp Ala Leu

340 345 350

Ser Asp Ser Met Cys Ser Glu Ala Thr Pro Trp Val Asn Gly Ala Tyr

355 360 365

Leu Pro Asp His Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Val Leu Ala Pro Met

370 375 380

Ala Tyr Ala Lys Ile Lys Asn Ile Ile Glu Arg Asn Val Thr Ser Gly

385 390 395 400

Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Ser Ala Arg Asp Leu Asn Asn Pro Gln Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Leu Ala Lys Tyr Val Arg Gly Ser Asn Gly Met Asp His

420 425 430

Val Gln Arg Ile Lys Ile Leu Lys Leu Met Trp Asp Ala Ile Gly Ser

435 440 445

Glu Phe Gly Gly Arg His Glu Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Ser Gly Ser

450 455 460

Gln Asp Glu Ile Arg Leu Gln Cys Leu Arg Gln Ala Gln Asn Ser Gly

465 470 475 480

Asn Met Asp Lys Met Met Ala Met Val Asp Arg Cys Leu Ser Glu Tyr

485 490 495

Asp Gln Asp Gly Trp Thr Val Pro His Leu His Asn Asn Asp Asp Ile

500 505 510

Asn Met Leu Asp Lys Leu Leu Lys

515 520

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gln Leu Asp Glu Gln Arg Leu Arg Phe Arg Asp Ala Met Ala Ser

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ala Val Asn Ile Ile Thr Thr Glu Gly Asp Ala Gly Gln

20 25 30

Cys Gly Ile Thr Ala Thr Ala Val Cys Ser Val Thr Asp Thr Pro Pro

35 40 45

Ser Leu Met Val Cys Ile Asn Ala Asn Ser Ala Met Asn Pro Val Phe

50 55 60

Gln Gly Asn Gly Lys Leu Cys Val Asn Val Leu Asn His Glu Gln Glu

65 70 75 80

Leu Met Ala Arg His Phe Ala Gly Met Thr Gly Met Ala Met Glu Glu

85 90 95

Arg Phe Ser Leu Ser Cys Trp Gln Lys Gly Pro Leu Ala Gln Pro Val

100 105 110

Leu Lys Gly Ser Leu Ala Ser Leu Glu Gly Glu Ile Arg Asp Val Gln

115 120 125

Ala Ile Gly Thr His Leu Val Tyr Leu Val Glu Ile Lys Asn Ile Ile

130 135 140

Leu Ser Ala Glu Gly His Gly Leu Ile Tyr Phe Lys Arg Arg Phe His

145 150 155 160

Pro Val Met Leu Glu Met Glu Ala Ala Ile

165 170

<210> 3

<211> 2093

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaaccag aagatttccg cgccagtacc caacgtcctt tcaccgggga agagtatctg 60

aaaagcctgc aggatggtcg cgagatctat atctatggcg agcgagtgaa agacgtcacc 120

actcatccgg catttcgtaa tgcggcagcg tctgttgccc agctgtacga cgcactgcac 180

aaaccggaga tgcaggactc tctgtgttgg aacaccgaca ccggcagcgg cggctatacc 240

cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccagcaacg cgacgccatc 300

gctgagtggt cacgcctgag ctatggctgg atgggccgta ccccagacta caaagccgct 360

ttcggttgcg cactgggcgc gaatccgggc ttttacggtc agttcgagca gaacgcccgt 420

aactggtaca cccgtattca ggaaactggc ctctacttta accacgcgat tgttaaccca 480

ccgatcgatc gtcatttgcc gaccgataaa gtgaaagacg tttacatcaa gctggaaaaa 540

gagactgacg ccgggattat cgtcagcggt gcgaaagtgg ttgccaccaa ctcggcgctg 600

actcactaca acatgattgg cttcggctcg gcacaagtga tgggcgaaaa cccggacttc 660

gcactgatgt tcgttgcgcc aatggatgcc gatggcgtga aattaatctc ccgcgcctct 720

tatgagatgg tcgcgggtgc taccggctcg ccatacgact acccgctctc cagccgcttc 780

gatgagaacg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga ttccatggga aaacgtgctg 840

atctaccgcg attttgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt tgcccgtatg 900

tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaattag acttcattac ggcactgctg 960

aaaaaatcac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 1020

gaagtggtag cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttcagaagca 1080

acgccgtggg tcaacggggc ttatttaccg gatcatgccg cactgcaaac ctatcgcgta 1140

ctggcaccaa tggcctacgc gaagatcaaa aacattatcg aacgcaacgt taccagtggc 1200

ctgatctatc tcccttccag tgcccgtgac ctgaataatc cgcagatcga ccagtatctg 1260

gcgaagtatg tgcgcggttc gaacggtatg gatcacgtcc agcgcatcaa gatcctcaaa 1320

ctgatgtggg atgctattgg cagcgaattt ggtggtcgtc acgaactgta tgaaatcaac 1380

tactccggta gccaggatga gattcgcctg cagtgtctgc gccaggcaca aaactccggc 1440

aatatggaca agatgatggc gatggttgat cgctgcctgt cggaatacga ccaggacggc 1500

tggactgtgc cgcacctgca caacaacgac gatatcaaca tgctggataa gctgctgaaa 1560

taacgcagca ggaggttaag atgcaattag atgaacaacg cctgcgcttt cgtgacgcga 1620

tggccagcct gtcggcagcg gtaaatatta tcaccaccga gggcgacgcc ggacaatgcg 1680

ggattacggc aacggccgtc tgctcggtca cggatacacc accgtcgctg atggtgtgca 1740

ttaacgccaa cagtgcgatg aacccggttt ttcagggcaa cggcaagttg tgcgtcaacg 1800

tcctcaacca tgagcaggaa ctgatggcac gccacttcgc gggcatgaca ggcatggcga 1860

tggaagagcg ttttagcctc tcatgctggc aaaaaggtcc gctggcgcag ccggtgctaa 1920

aaggttcgct ggccagtctt gaaggtgaga tccgcgatgt gcaggcaatt ggcacacatc 1980

tggtgtatct ggtggagatt aaaaacatca tcctcagtgc agaaggtcat ggacttatct 2040

actttaaacg ccgtttccat ccggtgatgc tggaaatgga agctgcgatt taa 2093

Claims

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以大肠杆菌CCTCC NO：M2019390为宿主细胞，表达了来源于大肠杆菌的羟化酶基因HpaBC。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述羟化酶HpaBC包括羟化酶HpaB和羟化酶HpaC，其中，羟化酶HpaB的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，羟化酶HpaC的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。

3.如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述羟化酶HpaBC的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。

4.构建权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将HpaBC基因插入到质粒pEtac中，获得重组质粒pEtac-HpaBC；

(2将片段poxBUP、poxBDown、tac-HpaBC-T7 terminater连接，获得poxB∷HpaBC删除表达盒；

(3)采用CRISPR-cas9的方法，先将pCas质粒采用电转化的方法转化进入大肠杆菌CCTCC NO：M2019390感受态细胞中，然后将带有sgRNA的质粒sg-pTarget及poxB∷HpaBC的删除表达盒电转化进入大肠杆菌CCTCC NO：M2019390感受态细胞中；挑取转化成功的转化子，利用IPTG进行诱导，消除sg-pTarget质粒，构建得到重组大肠杆菌。

5.一种生产羟基酪醇的方法，其特征在于，采用权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌发酵生产羟基酪醇。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法为，将所述重组大肠杆菌接种至种子培养基中培养，制备得到种子液；将种子液接种至发酵培养基中，发酵制备羟基酪醇。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至LB固体培养基上培养，得到单菌落，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于35～39℃、180-220r/min条件下培养10～14h，制备得到种子液。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，将制备得到的种子液接种至LB液体培养基中，在35～40℃、180-220r/min条件下培养10～14h后收集菌体；将收集得到的菌体接种至M9Y液体培养基中进行发酵培养，制备得到羟基酪醇。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述种子液的接种量为1％。

10.权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌在制备羟基酪醇及含有羟基酪醇的产品中的应用。