CN107723306A - 一种生物生产羟基酪醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物生产羟基酪醇的方法，包括如下步骤：全化学合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因kdc和带tac启动子的4‑羟基苯乙酸‑3‑单加氧酶基因hpaBC，全化学合成载体骨架pBPE004，用酶切连接的方法将kdc和hpaBC连接到pBPE004上得到重组载体pKB，将pKB转入底盘菌株SyBE‑002447中，得到SyBE‑KB1菌株；将kdc基因和hpaBC基因整合至SyBE‑002447染色体上，得到SyBE‑KB2菌株。以葡萄糖为前体，对SyBE‑KB1和SyBE‑KB2菌株进行发酵生产羟基酪醇。本发明使用工程大肠杆菌生产羟基酪醇，可解决羟基酪醇的来源问题，降低成本。

Description

一种生物生产羟基酪醇的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及产羟基酪醇的重组菌及构建方法及羟基酪醇的生物生产方法。
背景技术
羟基酪醇(hydroxytyrosol，HT)是一种天然多酚类化合物，化学名为3,4-二羟基苯乙醇，具有很强的抗氧化活性，主要以酯类的形式存在于橄榄的果实和枝叶中，橄榄苦苷经水解后得到HT单体。研究表明羟基酪醇具有抗癌、抗菌、抗炎等多种生物和药理活性，已经受到国内外研究者的广泛关注。
目前羟基酪醇的主要通过化学降解与合成的方法获得，但是化学降解收率较低，而化学合成反应过程复杂，收率低，且催化剂昂贵，化学试剂有毒，环境污染严重，不适用于工业化生产。生物法合成羟基酪醇途径具有稳定、安全、无污染的优点，因此，通过使用合成生物学技术，在工程微生物中构建全新的生物合成通路，实现羟基酪醇的从头合成。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种产羟基酪醇的重组菌。
本发明的第二个目的是提供一种产羟基酪醇的重组菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供用产羟基酪醇的重组菌生物生产羟基酪醇的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种产羟基酪醇的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因kdc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成带tac启动子的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；全合成载体骨架pBPE004，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示核苷酸序列通过酶切连接方式与SEQ ID No.3所示核苷酸序列连接，筛选阳性克隆得到重组载体pKB；
(3)将重组载体pKB转化到宿主菌SyBE-002447中，得到产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB1菌株。
上述方法构建的产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB1菌株。
SyBE-KB1菌株生物生产羟基酪醇的方法，包括如下步骤：将重组菌SyBE-KB1接种在LB培养基中，35-38℃，200-250rpm，震荡培养2-4h，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵生产羟基酪醇。
另一种产羟基酪醇的重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因kdc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成带tac启动子的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
(2)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-002447中，得到SyBE-KDC菌株；
(3)将SEQ ID No.2所示核苷酸序列，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-KDC菌株中，得到产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB2菌株。
上述方法构建的产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB2菌株。
SyBE-KB2菌株生物生产羟基酪醇的方法，其特征是包括如下步骤：将重组菌SyBE-KB2接种在LB培养基中，35-38℃，200-250rpm，震荡培养2-4h，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵生产羟基酪醇。
本发明的优点：
本发明构建的产羟基酪醇的重组菌，以葡萄糖为碳源，通过发酵生产羟基酪醇。本发明可解决羟基酪醇的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。
附图说明
图1为羟基酪醇的合成路线。
图2为羟基酪醇的HPLC验证图。(a)为标准品羟基酪醇(b)为重组菌SyBE-KB1的发酵液(c)为重组菌SyBE-KB2的发酵液
具体实施方式
利用毕赤酵母菌(Pichia pastoris GS115)中酮基脱羧酶基因kdc以及大肠杆菌(Escherichia coli)的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC，在工程大肠杆菌中实现了低成本以葡萄糖为生物质碳源合成羟基酪醇。
原始底盘大肠杆菌为SyBE-002447，建议的分类命名为：大肠埃希氏菌(Escherichia Coli)现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.7962。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明所用大肠杆菌菌株E.coli BL21(DE3)和E.coli DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司。
本发明所用pKD46质粒和pCP20质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。
LB培养基组成为：10g/L NaCl、10g/L蛋白胨和5g/L酵母粉，余量为水，0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。
含有葡萄糖的M9培养基组成为：0.5g/L NaCl、1.0g/L NH4Cl、3.0g/L KH2PO4、17.1g/L Na2HPO4·12H2O、0.025％酵母粉，余量为水，培养基在0.1Mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入过膜的终浓度为5mM MgSO4、0.1mM CaCl2以及灭菌的10g/L葡萄糖。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明设计的羟基酪醇生物合成途径见图1：
以葡萄糖或者其他生物质为碳源，经过莽草酸途径合成对羟基苯丙酮酸。对羟基苯丙酮酸在酮基脱羧酶kdc的催化作用下合成对羟基苯乙醛，对羟基苯乙醛在大肠杆菌内源脱氢酶催化下生成对羟基苯乙醇(酪醇)，在4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶HpaBC催化下，酪醇羟化生成羟基酪醇，生物合成途径示意图如图1所示。
实施例1酮基脱羧酶基因kdc和4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC的设计
优选毕赤酵母GS115酮基脱羧酶基因，使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长kdc基因，并在基因前加入trc启动子。
带trc启动子的酮基脱羧酶基因kdc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选大肠杆菌的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因，使用JCAT在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合OPTIMIZER在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长hpaBC基因，并在基因前加入tac启动子。
带tac启动子的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
实施例2重组表达载体pKB的构建
全化学合成表达载体骨架pBPE004,其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
将SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示核苷酸序列通过酶切连接方式与SEQ ID No.3所示核苷酸序列连接，筛选阳性克隆得到重组载体pKB；
将通过化学全合成得到的SEQ ID No.1所示核苷酸，通过PCR方法在片段两端分别加上EcoRI和HindIII酶切位点，使用FastDigest内切酶EcoRI和HindIII进行酶切，反应体系为：5μL 10*FD buffer，2.5μL EcoRI、2.5μL PstI、30μL加酶切位点的SEQ ID No.1所示核苷酸和10μL超纯水。反应条件为：37℃，2h。使用PCR纯化试剂盒，将50μL酶切产物中，加入250μL Bingding Buffer溶液，混匀后加入吸附柱中，静置一分钟，10,000g离心1分钟，弃出流出液。加入650μL Wash Buffer,10，000g离心1分钟，弃出流出液。10,000g离心2分钟，去除残留的Wash Buffer。将吸附柱置于一个干净的离心管中，在柱的中央加入30μL ElutionBuffer(Elution Buffer提前在65℃水浴锅中预热)，室温静置1分钟，10，000g离心1分钟，洗脱酶切后的SEQ ID No.1所示核苷酸片段。同样将人工合成的pBPE004质粒用FastDigest内切酶EcoRI和HindIII进行酶切，PCR纯化试剂盒纯化回收。将酶切后的SEQ ID No.1所示核苷酸和pBPE004质粒进行连接反应。反应体系为：1μL 10*T4 DNA Ligase Buffer,1μL T4DNA Ligase,6μL酶切后的核苷酸片段和2μL酶切后的pBPE004质粒。反应条件为：22℃，0.5h。酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆提质粒，测序验证，得到SEQ ID No.1所示核苷酸连接到表达载体pBPE004的第一个启动子下游的质粒pKDC。
将化学全合成得到的SEQ ID No.2所示核苷酸，通过PCR方法在片段两端分别加上NdeI和KpnI酶切位点，使用FastDigest内切酶NdeI和KpnI分别将它和pKDC质粒进行双酶切，然后通过DNA连接酶将SEQ ID No.2所示核苷酸连接到pKDC上，酶切连接反应体系及反应条件按照pKDC载体构建方法。酶切连接后转化感受态细胞E.coli DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组载体pKB，测序验证。
实施例3重组表达载体pKB转化到大肠杆菌底盘菌株SyBE-002447
重组载体pKB转化到大肠杆菌SyBE-002447中的详细构建步骤如下：
1、将活化的大肠杆菌菌株SyBE-002447 100μL，接种于10ml LB培养基中，37℃，220rpm，培养至OD600为0.8-1.0时，转入10ml离心管中，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体；
2、用5ml预冷的灭过菌的10％甘油洗涤菌体，在预冷的4℃离心机中，4500rpm/min，离心5min，去上清，收集菌体，重复洗涤三次；
3、尽量倒尽上清，加入100μL10％甘油重悬菌体，制成SyBE-002447感受态细胞；
4、将实施例2中构建的pKB质粒2.5μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物分别加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。迅速分别加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布对应抗性的平板，过夜培养；
5、挑选菌落PCR验证的阳性转化子到5ml LB培养基中过夜培养，得到重组菌株SyBE-KB1，保存菌株。
实施例4λ-red同源重组方法整合SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示核苷酸到大肠杆菌SyBE-002447染色体
整合SEQ ID No.1所示核苷酸到大肠杆菌SyBE-002447染色体过程详细步骤如下：
1、以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，使用Fastpfu酶进行PCR反应克隆得到卡纳基因。
2、利用重叠延伸PCR，使SEQ ID No.1所示核苷酸加上卡纳抗性片段。
3、把pKD46质粒导入菌种SyBE-002447，获得SyBE-002447/pKD46，将活化的菌种SyBE-002447/pKD46，接种于10ml LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养至OD600为0.4-0.6。加入终浓度为10mM L-阿拉伯糖，继续培养3h，4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取本实施例步骤2获得的片段7.5μL，加入到100μL电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5KV电击4-6ms。然后加入1mL LB培养基，37℃复苏2h后涂布对应抗性的平板，42℃过夜培养。
4、挑取PCR验证正确单菌落，在42℃下卡那霉素抗性平板传代3次，氨苄卡那霉素抗性平板验证pKD46缺失，37℃培养保存，获得将SEQ ID No.1所示核苷酸整合到底盘菌株SyBE-002447染色体上的菌株。
5、利用本实施例步骤4获得的菌株制备感受态细胞，同样方法电转化质粒pCP20，30℃过夜培养。挑取单菌落，无抗性平板划线，42℃传代3次，筛选卡那霉素和氨苄青霉素抗性缺失的菌株，37℃培养保存，得到成功无痕整合的优化底盘菌株SyBE-KDC。
6、用同样的方法将SEQ ID No.2所示核苷酸整合至步骤5中得到的菌株SyBE-KDC中，获得菌株SyBE-KB2。
实施例5重组菌SyBE-KB1和重组菌SyBE-KB2的发酵及检测
将重组菌SyBE-KB1和SyBE-KB2分别接种在LB培养基中，37℃，220rpm，震荡培养3h，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵24h，生产羟基酪醇。
在发酵过程中不同时间点，取发酵液1ml，然后12000r/min离心10分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(HPLC)系统检测。色谱条件如下：C18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为20％甲醇-80％超纯水溶液-0.1％甲酸；流速1mL/min；进样量20μL；柱温室温；紫外检测器，检测波长280nm。
实施例6
试验证明：
将重组菌SyBE-KB1和SyBE-KB2分别接种在LB培养基中，35℃，250rpm，震荡培养2h，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵24h，生产羟基酪醇。或将重组菌SyBE-KB1和SyBE-KB2分别接种在LB培养基中，38℃，200rpm，震荡培养4h，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵24h，生产羟基酪醇。其产量与实施例5的产量相似。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种产羟基酪醇的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因kdc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成带tac启动子的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC，其核苷酸序列如SEQID No.2所示；全合成载体骨架pBPE004，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列和SEQ ID No.2所示核苷酸序列通过酶切连接方式与SEQ ID No.3所示核苷酸序列连接，筛选阳性克隆得到重组载体pKB；
(3)将重组载体pKB转化到宿主菌SyBE-002447中，得到产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB1菌株。
2.权利要求1的方法构建的产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB1菌株。
3.权利要求2的SyBE-KB1菌株生物生产羟基酪醇的方法，其特征是包括如下步骤：将重组菌SyBE-KB1接种在LB培养基中，35-38℃，200-250rpm，震荡培养2-4h，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵生产羟基酪醇。
4.一种产羟基酪醇的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因kdc，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；人工全合成带tac启动子的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC，其核苷酸序列如SEQID No.2所示；
(2)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-002447染色体中，得到SyBE-KDC菌株；
(3)将SEQ ID No.2所示核苷酸序列，通过λRed同源重组技术整合到大肠杆菌SyBE-KDC菌株中，得到产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB2菌株。
5.权利要求4的方法构建的产羟基酪醇的重组菌SyBE-KB2菌株。
6.权利要求5的SyBE-KB2菌株生物生产羟基酪醇的方法，其特征是包括如下步骤：将重组菌SyBE-KB2接种在LB培养基中，35-38℃，200-250rpm，震荡培养2-4h，转接到含有葡萄糖的M9培养基中进行发酵生产羟基酪醇。
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