CN105154487B - 氨基转移酶和异构酶在催化形成L-allo-Ile中的应用 - Google Patents

氨基转移酶和异构酶在催化形成L-allo-Ile中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了氨基转移酶和异构酶在催化形成L‑allo‑Ile中的应用。所述的氨基转移酶为氨基转移酶DsaD或氨基转移酶MfnO，所述的异构酶为异构酶DsaE或异构酶MfnH，所述的氨基转移酶DsaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的异构酶DsaE的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的氨基转移酶MfnO的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的异构酶MfnH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明公开了由氨基转移酶和异构酶组成的酶对在催化形成L‑别异亮氨酸或L‑异亮氨酸中的应用。从而在酶学水平上解释L‑allo‑Ile的生物合成机制奠定了重要的基础。L‑allo‑Ile生物合成酶学机制的解释，将为利用绿色的酶学方法制备L‑allo‑Ile，以及对枫糖尿症的诊断和治疗具有重要的实用意义。

Description

氨基转移酶和异构酶在催化形成L-allo-Ile中的应用
技术领域：
本发明属于基因工程和生物催化技术领域，具体涉及一类由磷酸吡哆醛(pyridoxal5’-phosphate,PLP)依赖的氨基转移酶(PLP-linked aminotransferase)和一种新型异构酶(isomerase)组成的酶对，在共同协作催化形成L-别异亮氨酸(L-allo-Ile)中的应用。
背景技术：
异亮氨酸具有两个不对称中心，因此存在着4种立体异构体：L-异亮氨酸(L-Ile)、D-异亮氨酸(D-Ile)、L-别异亮氨酸(L-allo-Ile)和D-别异亮氨酸(D-allo-Ile)，其对应关系如图1所示。除L-Ile之外，D-Ile，L-allo-Ile和D-allo-Ile均属于非蛋白质氨基酸，其在自然界中的存在已有相关报道。其中，L-allo-Ile由于其在自然界中的广泛存在及重要科学意义，而引起了科学家们的特别关注。L-allo-Ile于1985年首次被报道发现，在随后的研究中，发现其除了存在于植物中，还可以作为结构单元存在于大量的环肽抗生素，如来源于真菌的aureobasidin A，cordyheptapeptides和aspergillicin E，以及来源于放线菌的globomycin，cypemycin，desotamides和marformycins(结构如图2)。有趣的是，L-allo-Ile还被发现存在于人体血浆中，在健康人群的血浆中，L-allo-Ile的浓度很低，处于几乎可以被检测的浓度水平；然而，在患有常染色体隐性遗传病——枫糖尿症(maple syrup urinedisease)的病人血浆中，L-allo-Ile却因为病人的代谢缺陷而得到累积，浓度达到5μM以上，因此，L-allo-Ile在血浆中的浓度水平已经作为诊断枫糖尿症的重要手段之一。
L-allo-Ile与蛋白质氨基酸L-Ile的结构非常相似，L-allo-Ile与L-Ile的差别在β位的碳原子上的甲基的构象不同。尽管L-allo-Ile在结构上与L-Ile非常相似，以及在自然界中广泛存在，但目前为止，生命体是如何生物合成L-allo-Ile这种非蛋白质氨基酸，以及在此过程当中涉及的酶和酶促反应机制，还是一个未解之谜。
Desotamides和marformycins从分别从南海深海来源的链霉菌Streptomycesscopuliridis SCSIO ZJ46和Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141分离纯化得到的两类环肽类抗生素，研究表明，desotamides对革兰氏阳性细菌具有较好的抑制活性，而marformycins对痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)具有较好的抑制作用，是较好的用于治疗痤疮药物的先导化合物。更为重要的是，这两类环肽化合物结构中，均含有非蛋白质氨基酸结构单元L-allo-Ile。目前，desotamides和margormycins的生物合成基因簇己经被克隆，以上研究结果为我们在酶学水平上解释L-allo-Ile的生物合成机制奠定了重要的基础。L-allo-Ile生物合成酶学机制的解释，将为利用绿色的酶学方法制备L-allo-Ile，以及对枫糖尿症的诊断和治疗具有重要的实用意义。
发明内容：
本发明的目的是提供氨基转移酶和异构酶形成的酶对在催化L-异亮氨酸形成L-别异亮氨酸或者催化L-别异亮氨酸形成L-异亮氨酸中的应用。
本发明的氨基转移酶和异构酶形成的酶对在催化L-异亮氨酸形成L-别异亮氨酸或者催化L-别异亮氨酸形成L-异亮氨酸中的应用，所述的氨基转移酶为氨基转移酶DsaD或氨基转移酶MfnO，所述的异构酶为异构酶DsaE或异构酶MfnH，所述的氨基转移酶DsaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的异构酶DsaE的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的氨基转移酶MfnO的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的异构酶MfnH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选，所述的氨基转移酶MfnO的编码基因mfnO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选，所述的异构酶MfnH的编码基因mfnH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选，所述的氨基转移酶DsaD的编码基因dsaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选，所述的异构酶DsaE的编码基因dsaE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明主要涉及三方面的内容：一是利用生物信息学分析方法分别从desotamides和marformycins的生物合成基因簇中鉴定了参与L-allo-Ile生物合成的氨基转移酶/异构酶—DsaD/DsaE和MfnO/MfnH；二是通过体内基因敲除的方法，对氨基转移酶/异构酶—DsaD/DsaE和MfnO/MfnH进行体内缺失突变，获得生产含有L-Val结构单元的化合物7，9和11(图2)的高产菌株△mfnH和Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO，Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO；三是本发明涉及利用鉴定的氨基转移酶/异构酶—DsaD/DsaE和MfnO/MfnH在催化L-Ile转化生成L-allo-Ile中的应用，其特点在于，L-allo-Ile的生成需要的两个酶协同作用，单独的氨基转移酶或者是异构酶均不能催化L-allo-Ile的生成，并且此催化过程不需要添加任何的辅因子。
本发明通过观察比较L-allo-Ile与L-Ile结构上的差别，发现的差别在β位的碳原子上的甲基的构象不同，其中，L-Ile的β位的碳原子为3S型，而L-allo-Ile的β位的碳原子为3R型，因此本发明人推测L-allo-Ile可能由L-Ile转化形成，此转化过程能是氨基转移酶和异构酶两个酶分子协作完成两者之间的转变。首先是L-Ile在氨基转移酶的作用下，脱去氨基，变为羰基将α位碳原子固定在平面内，使其不能自由旋转。其次在异构酶的作用下，完成β位的碳原子上甲基的翻转。本发明对desotamides和marformycins生物合成基因簇中分别被注释为氨基转移酶的DsaD和MfnO进行了生物信息学分析，多序列比对显示，DsaD/MfnO与已经报道的支链氨基酸转移酶(branched-chain aminotransferase,BCATs)具有很高的序列同源性，并且具有与IV-型氨基酸转移酶相同的特征基序“EXGXXNLFXnLXTXnLXGVXR”，以及具有与PLP共价相连的催化赖氨酸残基(Lysine)(如图3)，提示DsaD/MfnO具有PLP-依赖的氨基转移酶活性。本发明还利用对蛋白进行结构同源性分析的在线资源HHpred分别对desotamides和marformycins的生物合成基因簇中被注释为异构酶的DsaE和MfnH进行了结构分析，显示其与属于核转运因子2超家族(nuclear transport factor 2,NTF2)的蛋白具有类似的二级结构折叠方式，核转运因子2超家族含有许多具有不同功能且彼此的氨基酸序列相似性很低的蛋白，包括已报道的△5-3-酮类固醇异构酶(delta5-3-ketosteroidisomerse)，其能够催化△5-3-酮固醇异构化生成△4-3-酮类固醇，本发明人推测desotamides基因簇中的DsaE和marformycins基因簇中的MfnH可能参与L-Ile的β碳原子上的甲基进行异构化生成L-allo-Ile。在marformycins和desotamides的生物合成基因簇中分别鉴定到可能参与L-allo-Ile合成的氨基转移酶/异构酶酶对(如图4)，提示L-allo-Ile生物合成机制的具有保守性。
本发明涉及在marformycins野生型产生菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141中对氨基转移酶/异构酶MfnO/MfnH的基因进行敲除突变(如图5和6)，构建了产生含有L-Val结构单元的化合物7的高产菌株△mfnH。通过HPLC对突变株△mfnO和△mfnH的发酵产物进行分析，发现△mfnH完全不生产含有L-allo-Ile结构单元的化合物3和4，但产生含有L-Val结构单元的化合物5和7，且化合物7的产量与野生型菌株相比提高约100倍左右(如图7)；△mfnO也完全不生产含有L-allo-Ile结构单元的化合物4(如图7)，但仍能产生含有L-Val结构单元的化合物5和7。这些数据证实了MfnO/MfnH在合成L-allo-Ile过程中的起到必不可少的作用，由于MfnO/MfnH的缺失突变，导致前体L-allo-Ile不能合成，因此，与L-allo-Ile具有相似结构的L-Val能够在合成marformycin的过程中以毫无竞争的优势整合到marformycins肽链骨架中，从而获得产生含有L-Val结构单元的化合物7的高产菌株△mfnH。
因此，本发明的第二个目的是提供一种高产化合物7的菌株△mfnH，其特征在于，所述的菌株△mfnH是将野生型Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141的mfnH基因进行敲除缺失突变而获得的；
所述的化合物7的结构式如式1所示，其中R1＝H，R2＝CH3，R3＝OH；
本发明还涉及对desotamides基因簇中的氨基转移酶/异构酶——DsaD/DsaE的基因进行同框敲除突变(in-frame deletion)，然后在异源宿主Steptomyces coelicolorM1152中进行表达(如图8和9)，构建了产生含L-Val结构单元的化合物9和10的高产菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO和Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO。通过HPLC对Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO和Streptomycescoelicolor M1152/07-6H-DKO的发酵产物进行分析，发现dasE基因已经被同框缺失突变的Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO完全不生产含有L-allo-Ile结构单元的化合物8和10，但仍能生产含有L-Val结构单元的化合物9和11，且这两个化合物的产量与对照菌株相比均大大提高(化合物9约100倍，化合物11约140倍左右)(如图10)。dsaD基因已经被同框缺失突变的异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO虽然仍能产生含有L-allo-Ile结构单元的化合物8和10，但其产量大大降低，其仍能产生的含有L-Val结构单元的化合物9和11，且产量却大大提高(化合物9约80倍；化合物11约50倍)(如图10)。这些数据也同样说明DsaD/DsaE在合成L-allo-Ile过程中的起到必不可少的作用。
因此，本发明的第三个目的是提供一种高产化合物9和11的菌株Streptomycescoelicolor M1152/07-6H-EKO或Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO，其特征在于，所述的菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO是将DsaE基因同框缺失突变的desotamides的生物合成基因簇导入菌株Streptomyces coelicolor M1152中并进行表达而获得的，所述的Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO是将DsaD基因同框缺失突变的desotamides的生物合成基因簇导入菌株Streptomyces coelicolor M1152中并进行表达而获得的；
所述的化合物9和11的结构如式2所示，其中化合物9：R1＝H，R2＝NH2；化合物11：R1＝H，R2＝OH；
本发明还涉及到在大肠杆菌E.coli(DE3)中对氨基转移酶/异构酶—DsaD/DsaE和MfnO/MfnH进行表达、纯化(如图11)，获得的酶对能够在不添加任何辅因子的条件下，催化底物L-Ile转化形成L-allo-Ile。在pH 8.0的50mM磷酸盐缓冲液中，在不添加任何辅因子的条件下，DsaD/DsaE或者MfnO/MfnH协作催化底物L-Ile转化生成L-allo-Ile，转化率达到约67％(如图12)，但单独的氨基转移酶DsaD/MfnO或者单独的异构酶DsaE/MfnH不能催化L-Ile转化生成L-allo-Ile。DsaD/DsaE或者MfnO/MfnH协作催化L-Ile转化生成L-allo-Ile属于可逆反应，当以L-allo-Ile为底物时，在以上相同反应条件下，可以获得产物L-Ile(如图14)。以L-Ile为底物时，DsaD/DsaE催化的可逆反应的平衡常数为1.37(如图15)。Desotamides与marformycins生物合成途径中的氨基转移酶和异构酶可以实现功能上的互补，DsaD/MfnH和MfnO/DsaE可以协作催化L-Ile与L-allo-Ile之间的相互转化(如图16)。
本发明公开了由氨基转移酶和异构酶组成的酶对在催化形成L-别异亮氨酸(L-allo-Ile)或L-异亮氨酸中的应用。从而在酶学水平上解释L-allo-Ile的生物合成机制奠定了重要的基础。L-allo-Ile生物合成酶学机制的解释，将为利用绿色的酶学方法制备L-allo-Ile，以及对枫糖尿症的诊断和治疗具有重要的实用意义。
本发明的链霉菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46公开于文献：Yongxiang Song,Qinglian Li,Xue Liu,Yuchan Chen,Yun Zhang,Aijun Sun,WeiminZhang,Jingren Zhang,and Jianhua Ju，Cyclic Hexapeptides from the Deep SouthChina Sea-Derived Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46 Active AgainstPathogenic Gram-Positive Bacteria.J.Nat.Prod.,2014,77(8),pp 1937–1941。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。
本发明的Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141菌株公开于Xiao Zhou,Hongbo Huang,Jie Lia,Yongxiang Song,Renwang Jiang,Jing Liu,Si Zhang,Yan Hua,Jianhua Ju.New anti-infective cycloheptadepsipeptide congeners and absolutestereochemistry from the deep sea-derived Streptomyces drozdowiczii SCSIO10141.Tetrahedron.Volume 70,Issue 42,21October 2014,Pages 7795–7801。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。
本发明的天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)M1152公开于硕士论文：夏娟.红树林来源Streptomyces sp.OUC6819中Drimentines类化合物生物合成研究.中国海洋大学.2013年。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。
附图说明：
图1是L-异亮氨酸(L-Ile)、D-异亮氨酸(D-Ile)、L-别异亮氨酸(L-allo-Ile)和D-别异亮氨酸(D-allo-Ile)的化学结构式。
图2是marformycins和desotamides化学结构式，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别表示化合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11。
图3是氨基转移酶DsaD/MfnO与已经报道的支链氨基酸转移酶的多重序列比对。箭头所指为保守的与PLP共价结合的赖氨酸催化参加，方框所指的是IV-氨基转移酶的特征基序“EXGXXNLFXnLXTXnLXGVXR”。
图4是maformycins和desotamides的生物合成基因簇中氨基转移酶和异构酶的所在位置。氨基转移酶DsaD/MfnO用红色标出；异构酶DsaE/MfnH用绿色标出。
图5是利用PCR-targeting技术在marformtcins产生菌中对氨基转移酶基因mfnO进行缺失突变。(A)突变过程示意图；(B)对突变株△mfnO进行PCR鉴定，W：以野生型菌株Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141的基因组DNA为模板；M：以突变株△mfnO基因组DNA为模板，maker:DNA分子量标准品。
图6是利用PCR-targeting技术在marformtcins产生菌中对氨基转移酶基因mfnH进行缺失突变。(A)突变过程示意图；(B)对突变株△mfnH进行PCR鉴定，W：以野生型菌株Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141的基因组DNA为模板；M：以突变株△mfnH基因组DNA为模板，maker:DNA分子量标准品。
图7是突变株△mfnO和△mfnH发酵产物的HPLC分析。
图8是dsaD基因的同框缺失突变以及在异源宿主Streptomyces coelicolorM1152中的表达。(A)示意图；(B)缺失突变的PCR鉴定，WT：以对照菌株Streptomycescoelicolor M1152的基因组DNA为模板；DKO：以异源表达菌株Streptomyces coelicolorM1152/07-6H-DKO基因组DNA为模板，M:DNA分子量标准品。
图9是dsaE基因的同框缺失突变以及在异源宿主Streptomyces coelicolorM1152中的表达。(A)示意图；(B)缺失突变的PCR鉴定，WT：以对照菌株Streptomycescoelicolor M1152的基因组DNA为模板；EKO：以异源表达菌株Streptomyces coelicolorM1152/07-6H-EKO基因组DNA为模板，M:DNA分子量标准品。
图10是dsaD和dsaE基因已经被同框缺失突变的异源表达菌株Streptomycescoelicolor M1152/07-6H-DKO和Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO的发酵产物的HPLC分析。i：对照菌株Streptomyces coelicolor M1152；ii：含有desotamides的生物合成基因簇的异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H；iii：dsaD已经被同框缺失突变的异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO；iv：dsaE已经被同框缺失突变的异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO。
图11是DsaD/DsaE和MfnO/MfnH在大肠杆菌E.coli(DE3)中进行表达、纯化后利用SDS-PAGE进行分析。
图12是纯化的重组DsaD/DsaE和MfnO/MfnH在体外催化L-Ile转化生成L-allo-Ile。
图13是由利用DsaD/DsaE制备获得酶促产物L-allo-Ile的1H NMR图谱。A：酶促产物L-allo-Ile的1H NMR图谱；B：L-allo-Ile标准品的1H NMR图谱
图14是纯化的重组DsaD/DsaE和MfnO/MfnH在体外催化L-allo-Ile转化生成L-Ile。
图15是DsaD/DsaE催化的可逆反应的平衡常数的测定。但以L-Ile为底物时，平衡常数Keq根据公式计算可得Keq＝([l-allo-Ile]/[l-Ile])＝(2.89/2.11)＝1.37。
图16是来源于不同生物合成途径的氨基转移酶/异构酶酶对DsaD/MfnH和MfnO/DsaE可以协作催化L-Ile与L-allo-Ile之间的相互转化。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
mfnO基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基转移酶MfnO的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)和mfnH基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码的异构酶MfnH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)在野生型产生菌Streptomyces drozdowicziiSCSIO 10141中的缺失突变
利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的marformycins的生物合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对mfnO和mfnH基因的敲除引物，引物序列见于表1中的mfnO和mfnH敲除引物。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到接合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将含有marformycins的生物合成基因簇的cosmid质粒(质粒cosmid 247E，marformycins的生物合成基因簇的核苷酸序列的GenBank登录号为：KP715145.1)转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得含有目的质粒的E.coli BW25113/pIJ790菌株，用10mM的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ778，回收其中约1.4kb含有转移原点(oriT)和壮观霉素(spectinomycin)抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用引物mfnOdelF/mfnOdelR和mfnHdelF/mfnHdelR通过PCR分别扩增出1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs0.5mmol/L，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物分别回收纯化待用。(3)分别将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞E.coli BW25113/pIJ790中使其发生重组，涂布于LB筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素,50μg/mL壮观霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，重组质粒命名为delmfnO和delmfnH，delmfnO和delmfnH中的mfnO和mfnO基因的部分片段分别被转移原点和壮观霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒delmfnO和delmfnH分别转化到E.coli ET12567/pUZ8002中，获得重组菌株E.coliET12567/pUZ8002/delmfnO和E.coli ET12567/pUZ8002/delmfnH，作为接合转移的供体菌。
野生型链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141菌株在ISP2培养基(麦芽提取物4g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，海盐30g，琼脂粉20g，加水至1L，pH 7.2)平板中划线培养3-5天，长出的孢子用无菌棉签收集于的TSB培养基中，涡旋振荡，使孢子分散。过滤分离菌丝体和孢子，孢子悬浮于5mL的TSB培养基中，50℃热激10min，然后于28℃萌发2-4小时，作为接合转移的受体菌。当供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/delmfnO和E.coliET12567/pUZ8002/delmfnH分别在50mL含50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和50μg/mL壮观霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.6时，离心收集菌体(4000rpm，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μL LB培养基中，作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μL和供体菌100μL混合均匀，涂布于不含任何抗生素的M-ISP4固体培养基(可溶性淀粉10g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g，NaCl 1g，MgSO4·7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，K2HPO4 1g，CaCO3 2g，海盐30g，微量元素100μL，加水至1L，pH 7.2)上，吹干后，于28℃培养18-20h。然后将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为100μg/mL壮观霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养3-4天后观察。
当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有100μg/mL壮观霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的ISP2平板上，28℃培养2-3天后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物(引物序列见于表2中的mfnO和mfnH的检测引物序列)通过PCR检测获得阳性克隆，即获得氨基转移酶mfnO基因敲除双交换突变菌株△mfnO和异构酶mfnH基因敲除双交换突变菌株△mfnH。
表1：构建mfnO和mfnH基因突变株所需的敲除引物名称和序列
表2：构建mfnO和mfnH基因突变株所需的检测引物名称和序列
实施例2
dsaD基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基转移酶DsaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)和dsaE基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其编码的异构酶DsaE的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)的同框缺失突变及在异源宿主Streptomycescoelicolor M1152中的表达
首先是对dsaD和dsaE基因进行同框缺失突变。具体操作过程如下：(1)参照文献报道的PCR-targeting系统，首先通过内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，回收其中约1.4kb含有转移原点(oriT)和阿普拉霉素(apramycin)抗性基因的DNA片段，作为PCR扩增敲除dsaD和dsaE基因所需的DNA片段。(2)根据dsaD和dsaE基因的序列，分别设计一对敲除引物，此引物特点在于，有39个核苷酸与目标缺失突变基因同源(见表3，大写字母所示)，有19或者20个核苷酸与抗性基因片段左端或者右端同源(见表3，小写字母所示)，此外，在39个核苷酸和19/20个核苷酸之间加入了内切酶SpeI位点(见表3，SpeI位点用下划线标出)。利用此引物，以回收的1.4kb含有转移原点(oriT)和阿普拉霉素(apramycin)抗性基因的DNA片段作为模板，进行PCR扩增获得1.4kb的PCR产物，50μL的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μL，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μL，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水补至50μL。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物分别回收纯化待用。(3)接下来选择SuperCos1质粒来源的粘粒07-6H作为对dsaD和dsaE进行同框缺失突变的起始粘粒，此粘粒含有desotamides的生物合成基因簇(desotamides的生物合成基因簇的核苷酸序列的GenBank登录号为：KP769807.1)。将粘粒07-6H转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中获得E.coli BW25113/pIJ790/07-6H，用10mM的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(4)分别将(2)步骤中获得的1.4kb PCR产物电转入(3)步骤中制备的感受态细胞E.coli BW25113/pIJ790/07-6H中使其发生重组，涂布于LB筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素,50μg/mL阿普拉霉素)上，37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，重组粘粒命名为07-6H-DKO和07-6H-EKO，07-6H-DKO和07-6H-EKO中的dsaD和dsaE基因的部分片段分别被转移原点和阿普拉霉素抗性基因取代。(5)利用SpeI对重组粘粒07-6H-DKO和07-6H-EKO进行酶切，经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀后，用T4连接酶进行连接，转化感受态细胞E.coli DH5，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素,50μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃过夜培养。利用检测引物(见表4)对克隆进行PCR鉴定，挑取丢失转移原点和阿普拉霉素抗性基因DNA片段而自连的粘粒，命名为07-6H-DKO-IF和07-6H-EKO-IF。
接下来是将dsaD和dsaE基因已经被同框缺失突变的粘粒07-6H-DKO-IF和07-6H-EKO-IF导入到异源宿主Streptomyces coelicolor M1152中进行表达。在导入Streptomyces coelicolor M1152之前，首先要对粘粒07-6H-DKO-IF和07-6H-EKO-IF进行改造，以适合进行异源表达。改造的策略是利用大肠杆菌的λ/red重组系统将粘粒07-6H-DKO-IF和07-6H-EKO-IF上的来源于质粒SuperCos1的卡那霉素抗性基因分别用含有阿普拉霉素抗性基因aac(3)IV，接合转移原点原件oriT，整合酶基因和intψC31整合位点的DNA片段替换。此aac(3)IV-oriT-intψC3的DNA片段来源于本实验室构建的质粒pSET152AB，利用BamH I/EcoR I完全酶切质粒pSET152AB后，回收5.5kb左右片段，此片段含有aac(3)IV-oriT-intψC3DNA片段以及与被替换的卡那霉素基因两侧同源的1.0kb DNA片段)。将07-6H-DKO-IF和07-6H-EKO-IF转入到E.coli BW25113/pIJ790中，获得E.coli BW25113/pIJ790/07-6H-DKO-IF和E.coli BW25113/pIJ790/07-6H-EKO-IF。将约100mg回收的5.5kb DNA片段分别加入到E.coli BW25113/pIJ790/07-6H-DKO-IF和E.coli BW25113/pIJ790/07-6H-EKO-IF感受态细胞中，转入电击杯中，1.4kv电压进行电转化。电击完成后迅速加入预冷的0.5mL的LB培养基，37℃复苏1小时后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL阿普拉霉素的LB平板。12小时后待转化子长出后，通过检测引物(表4)利用PCR验证阳性的重组质粒，阳性重组质粒命名为07-6H-DKO-AB和07-6H-EKO-AB。将构建好的重组质粒电转到E.coliET12567/pUZ8002中，获得E.coli ET12567/pUZ8002/07-6H-DKO-AB和E.coli ET12567/pUZ8002/07-6H-EKO-AB作为接合转移的供体菌。
接下是将E.coli ET12567/pUZ8002/07-6H-DKO-AB和E.coli ET12567/pUZ8002/07-6H-EKO-AB与Streptomyces coelicolor M1152进行接合转移。将菌株E.coli ET12567/pUZ8002/07-6H-DKO-AB和07-6H-EKO-AB分别接种于3mL的LB液体培养基(含有含有100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL阿普拉霉素，25μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素)中，37℃培养12小时后，取40μL菌液转接于4mL相同培养基中培养至OD为0.6，离心收集菌体，用不含任何抗生素的LB液体培养基洗涤2次，洗去抗生素，离心浓缩菌体，备用。与此同时，10％甘油收集S.coelicolor M1152孢子，经过滤器过滤后，3600rpm离心8min，弃上清，加入适量LB培养基悬浮孢子，置于50℃水浴中热激10分钟。将转化菌株E.coli ET12567/pUZ8002/07-6H-DKO-AB和07-6H-EKO-AB分别与S.coelicolor M1152孢子按照体积比2:1比例混合，涂布于MS+MgCl2(终浓度为10mM)固体平板上。20～24小时后，将平板取出，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为100μg/mL阿普拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于28℃培养箱中，培养3-4天后观察。当接合转移平板上长出小菌落后，用无菌牙签将其转接到含有100μg/mL阿普拉霉素和50μg/mL甲氧苄氨嘧啶的MS培养基(大豆粉20g，甘露醇20g，琼脂粉20g，加水至1L，pH 7.2)平板上，28℃培养2-3天后，抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物(引物序列见于表4)通过PCR检测获得阳性克隆，分别获得dsaD和dsaE基因已经被同框缺失突变的desotamides生物合成基因簇异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO和Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO。
表3：构建dsaD和dsaE基因突变株所需的敲除引物名称和序列
表4：构建dsaD和dsaE基因突变株所需的检测引物名称和序列
实施例3
marformycins的生物发酵与检测：
将海洋链霉菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141野生菌或突变株△mfnO和△mfnH在ISP2培养基(麦芽提取物4g，酵母提取物4g，葡萄糖4g，海盐30g，琼脂粉20g，加水至1L，pH 7.2)平板上活化产孢后，将等量的孢子分别接种到250mL三角瓶的50mL m-AM2ab发酵培养基(大豆粉10g，淀粉5g，蛋白胨2g，葡萄糖20g，酵母膏2g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，碳酸钙2g，海盐30g，加水至1L，pH 7.0)中，于28℃，200rpm条件下摇菌发酵。培养第7天后加入100mL的丁酮进行萃取，超声30min破碎细胞，然后静置分层。待丁酮萃取液与水相分离后，吸取上清萃取液用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行高效液相色谱(HPLC)检测。
检测条件为：Alltima C18(250×4.6mm，5μm)反相柱，流动相A相为15％乙腈，含0.03％乙酸，流动相B相为85％乙腈；流速为1mL/min，检测波长为215nm和275nm。
HPLC进样程序：0-20min,0％-100％B相；20-25min,100％B相；25.01-30min,100％-0％B相。
结果如图7所示，野生型产生菌Streptomyces drozdowiczii SCSIO 10141产生化合物3，4和5，△mfnH完全不生产含有L-allo-Ile结构单元的化合物3和4，但产生产含有L-Val结构单元的化合物5和7，且化合物7的产量与野生型菌株相比提高约100倍左右(如图7)；△mfnO也完全不生产含有L-allo-Ile结构单元的化合物4，但仍产生含有L-Val结构单元的化合物5和7(如图7)。
实施例4
desotamides的生物发酵与检测：
将desotamides野生型产生菌Streptomyces scopuliridis SCSIO ZJ46涂布于ISP4培养基平板上活化产孢，以及将异源表达对照菌株Streptomyces coelicolor M1152，dsaD和dsaE缺失突变异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO和Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-EKO涂布于MS培养基(大豆粉20g，甘露醇20g，琼脂粉20g，加水至1L，pH 7.2)平板上活化产孢。将等量的孢子分别接种到250mL三角瓶的50mL m-AM2ab发酵培养基(大豆粉10g，淀粉5g，蛋白胨2g，葡萄糖20g，酵母膏2g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，碳酸钙2g，海盐30g，加水至1L，pH 7.0)中，于28℃，200rpm条件下摇菌发酵。培养第7天后加入100mL的丁酮进行萃取，超声30min破碎细胞，然后静置分层。待丁酮萃取液与水相分离后，吸取上层丁酮萃取液用旋转蒸发仪将丁酮蒸干，残留物溶解于甲醇形成样品，进行高效液相色谱(HPLC)检测。
检测条件为：Alltima C18(250×4.6mm，5μm)反相柱，流动相A相为15％乙腈，含0.03％乙酸，流动相B相为85％乙腈；流速为1mL/min，检测波长为215nm和275nm。
HPLC进样程序：0-20min,0％-100％B相；20-25min,100％B相；25.01-30min,100％-0％B相；
结果如图10所示，dasE基因已经被同框缺失突变的Streptomyces coelicolorM1152/07-6H-EKO完全不生产含有L-allo-Ile结构单元的化合物8和10，但仍能生产含有L-Val结构单元的化合物9和11，且这两个化合物的产量与对照菌株相比均大大提高(化合物9约100倍，化合物11约140倍左右)(如图10)。dsaD基因已经被同框缺失突变的异源表达菌株Streptomyces coelicolor M1152/07-6H-DKO虽然仍能产生含有L-allo-Ile结构单元的化合物8和10，但其产量大大降低；此外，其仍能产生的含有L-Val结构单元的化合物9和11，且产量却大大提高(化合物9约80倍；化合物11约50倍)。
实施例5
氨基转移酶DsaD(其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)、异构酶DsaE(其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)、氨基转移酶MfnO(其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)和异构酶MfnH(其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)在E.coli BL21(DE3)中的表达和纯化：
将dsaD(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、dsaE(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、mfnO(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)、mfnH(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)基因按照常规方法克隆至载体pET28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间以得到pET28a(+)/dsaD，pET28a(+)/dsaE，pET28a(+)/mfnO，pET28a(+)/mfnH，经测序正确后，然后转化至E.coliBL21(DE3)以表达。将得到的转化菌株挑取单克隆过夜培养后按1％的接种量接入到规格为1L的三角瓶中含有50μg/mL卡那霉素的200mL LB培养液体(每个菌株共接种1L LB培养基)，于37℃摇床200rpm/min培养至OD600约为0.6时，往培养液中加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于25℃继续诱导表达12-15h。离心收集菌体，用50mLbinding buffer(50mM磷酸钠，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)洗涤菌体2遍后，重悬于30mLbinding buffer中，进行超声波破碎以释放蛋白，然后高速冷冻低温离心除去不溶部分。将可溶性上清部分上样到镍柱HisTrap HT column(1mL，GE Healthcare)上，待滤液全部过滤完后，用10mL wash buffer 1(50mM磷酸钠，500mM NaCl，50mM咪唑，pH 8.0)冲洗，再用2mLwash buffer 2(50mM磷酸钠，500mM NaCl，90mM咪唑，pH 8.0)冲洗，然后用5mL elutionbuffer(50mM磷酸钠，500mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱。用超滤管(Millipore,10mL，3kD)浓缩至2.5mL，经PD-10脱盐柱(GE Healthcare)脱盐后，储存于含10％甘油的磷酸钠l缓冲液(50mM，pH 8.0)，采用Bradford方法进行测定蛋白浓度测定，分装保存于-80℃备用，由此分别得到纯化的氨基转移酶DsaD,异构酶DsaE,氨基转移酶MfnO和异构酶MfnH。纯化后的蛋白电泳图如图11所示。
实施例6
DsaD/DsaE和MfnO/MfnH体外酶促反应及检测：
(1)以L-Ile为底物时检测氨基转移酶DsaD/异构酶DsaE和氨基转移酶MfnO/异构酶MfnH的酶活性：在100μL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶DsaD或者MfnO，5μM异构酶DsaE或者MfnH，置于30℃条件下反应4小时。
(2)以L-allo-Ile为底物时检测氨基转移酶DsaD/异构酶DsaE和氨基转移酶MfnO/异构酶的酶活性：在100μL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶DsaD或者MfnO，5μM异构酶DsaE或者MfnH，置于30℃条件下反应4小时。
反应结束后，加入200μL的甲醇以终止反应，涡旋震荡，于室温静置20分钟后，1,2000×g离心20分钟，取上清用旋转蒸发仪蒸干，残留物溶于40μL 2mM CuSO4溶液，取25μL进行手性HPLC分析，以检测酶促反应情况。手性HPLC分析条件为：使用MCI GEL CRS10Wcolumn(Mitsubishi,50×4.6mm,3μm)手性分析柱；流动为2mM CuSO4溶液；流速为1mL/min，检测时间为30分钟，检测波长为254nm。
实施例7
一、以L-Ile作为底物进行催化
(1)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时。反应结束后，加入20mL的甲醇以终止反应，涡旋震荡，于室温静置20分钟后，1,2000×g离心20分钟，取上清蒸干，残留物溶于2mMCuSO4溶液，利用手性HPLC进行纯化，条件为：使用MCI GEL CRS10W column(Mitsubishi,50×4.6mm,3μm)手性分析柱；流动相为2mM CuSO4溶液；流速为1mL/min，检测时间为30分钟，检测波长为254nm。将持留时间为13分钟的馏分接出合并后，加入乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)至终浓度为2mM，并将以上混合液的pH值调至4.0。用等体积的正庚烷和二-(2-乙基己基膦酸)的混合液(7:3)对以上pH 4.0溶液进行抽提两遍，收集合并有机相。用等体积的5％的HCl溶液对以上收集合并的有机相反萃两遍，收集合并水相。将收集合并的水性蒸干，残留物进一步用正向硅胶柱进行纯化(利用正丁醇-冰醋酸-水(4:1:5)进行等梯度洗脱)，获得纯的酶促反应产物L-allo-Ile(图12A中的V，图12A和12B中i和ii分别为L-Ile和L-allo-Ile的标准品)。其1H NMR图谱如图13所示。
酶促反应产物l-allo-Ile:HR-ESI-MS[M+H]+＝132.1038(calc.for C6H13NO2,132.1019)；1H NMR(500MHz,D2O),δ0.86(3H,t,J＝7.5Hz),0.83(3H,d,J＝7.0Hz),1.19～1.40(2H,m),1.96(1H,m),3.62(1H,m).[α]D 25+23.4°(c 0.0575,aq HCl,pH 2.5).CD[θ]202+165.7°(c 0.0575,aq.HCl,pH 2.5).
l-allo-Ile标准品:1H NMR(500MHz,D2O),δ0.86(3H,t,J＝8.0Hz),0.84(3H,d,J＝7.0Hz),1.20～1.40(2H,m),1.98(1H,m),3.64(1H,m).[α]D 25+23.2°(c 0.1,aq HCl,pH2.5).CD[θ]202+333.3°(c 0.1,aq.HCl,pH 2.5).
(2)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，置于30℃条件下反应4小时。按照步骤(1)的进行分析和结构鉴定，未获得酶促反应产物L-allo-Ile(图12A中的iii)。
(3)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时。按照步骤(1)的进行分析和结构鉴定，未获得酶促反应产物L-allo-Ile(图12A中的iV)。
(4)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，不加入任何酶，置于30℃条件下反应4小时。按照步骤(1)的进行分析和结构鉴定，未获得酶促反应产物L-allo-Ile(图12A中的Vi)。
(5)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时。按照步骤(1)的进行分析和结构鉴定，获得纯的酶促反应产物L-allo-Ile(图12B中的V)。
(6)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，置于30℃条件下反应4小时。按照步骤(1)的进行分析和结构鉴定，未获得酶促反应产物L-allo-Ile(图12B中的iii)。
(7)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时。按照步骤(1)的进行分析和结构鉴定，未获得酶促反应产物L-allo-Ile(图12B中的iV)。
(8)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，不加入任何酶，置于30℃条件下反应4小时。按照步骤(1)的进行分析和结构鉴定，未获得酶促反应产物L-allo-Ile(图12B中的Vi)。
二、以L-allo-Ile作为底物
(1)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-Ile(图14A中的V，图14A和14B中i和ii分别为L-Ile和L-allo-Ile的标准品)。
(2)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-Ile(图14A中的iii)。
(3)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-Ile(图14A中的iV)。
(4)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，不加入任何酶，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-Ile(图14A中的Vi)。
(5)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-Ile(图14B中的V)。
(6)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-Ile(图14B中的iii)。
(7)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-Ile(图14B中的iV)。
(8)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，不加入任何酶，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-Ile(图14B中的Vi)。
三、
(1)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-allo-Ile(图16A中的iii，图16A和16B中i和ii分别为L-Ile和L-allo-Ile的标准品)。
(2)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-allo-Ile(图16A中的iV)。
(3)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-allo-Ile(图16A中的V)。
(4)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-allo-Ile(图16A中的Vi)。
(5)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-Ile，不加入任何酶，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-allo-Ile(图16A中的Vii)。
(6)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-Ile(图16B中的iii)。
(7)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶DsaD，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-Ile(图16B中的iV)。
(8)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，5μM异构酶MfnH，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-Ile(图16B中的V)。
(9)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，5μM氨基转移酶MfnO，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时，获得纯的酶促反应产物L-Ile(图16B中的Vi)。
(10)在10mL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入1mM的底物L-allo-Ile，不加入任何酶，置于30℃条件下反应4小时，未获得酶促反应产物L-Ile(图16B中的Vii)。
实施例8
DsaD/DsaE催化的可逆反应平衡常数测定：
在50μL磷酸钠缓冲液(50mM,pH 8.0)中，加入2.5mM的底物L-Ile或者L-allo-Ile，0.1mM PLP，5μM氨基转移酶DsaD，5μM异构酶DsaE，置于30℃条件下反应4小时。反应结束后，加入200μL的甲醇以终止反应，涡旋震荡，于室温静置20分钟后，1,2000×g离心20分钟，取上清用旋转蒸发仪蒸干，残留物溶于40μL 2mM CuSO4溶液，取25μL进行手性HPLC分析，以检测酶促反应情况。手性HPLC分析条件为：使用MCI GEL CRS10W column(Mitsubishi,50×4.6mm,3μm)手性分析柱；流动为2mM CuSO4溶液；流速为1mL/min，检测时间为30分钟，检测波长为254nm。底物和产物的终浓度通过对相应的HPLC峰值进行积分计算而得。平衡常数(Keq)跟据以下计算公式计算而得Keq＝([产物浓度]/[底物浓度])。
测得以L-Ile为底物时，DsaD/DsaE催化的可逆反应的平衡常数为1.37(如图15)。

Claims (5)

1.氨基转移酶和异构酶形成的酶对在催化L-异亮氨酸形成L-别异亮氨酸或者催化L-别异亮氨酸形成L-异亮氨酸中的应用，所述的氨基转移酶为氨基转移酶DsaD或氨基转移酶MfnO，所述的异构酶为异构酶DsaE或异构酶MfnH，所述的氨基转移酶DsaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述的异构酶DsaE的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述的氨基转移酶MfnO的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的异构酶MfnH的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的氨基转移酶MfnO的编码基因mfnO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的异构酶MfnH的编码基因mfnH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的氨基转移酶DsaD的编码基因dsaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的异构酶DsaE的编码基因dsaE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
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