CN102174530A - 环肽ym-216391的生物合成基因簇 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由高贵链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274产生的具有良好抗肿瘤活性的环肽YM-216391的生物合成基因簇。整个基因簇共包含10个基因:8个与环肽YM-216391大环骨架生物合成及后修饰相关的基因,2个调节基因。通过对上述生物合成基因簇的异源表达可产生环肽YM-216391。本发明所提供的基因及其蛋白可以用来寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物、基因或蛋白。
Description
技术领域:
本发明属于微生物基因资源和基因工程领域,具体涉及具有抗肿瘤活性的环肽YM-216391的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
技术背景:
环肽YM-216391(1,图1)由高贵链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274所产生,是2005年由日本科学家K.Sohda等在寻找新的抗癌药物的过程中发现的新型环肽类化合物,它具有良好的抗肿瘤活性[J.Antibiot.(2005)58,27-31;J.Antibiot.(2005)58,32-36]。环肽YM-216391具有独特的化学结构,包含2,4-连接的4个噁唑环和1个噻唑环,其两端由D-allo-异亮氨酸残基-L-缬氨酸残基-甘氨酸残基组成的三肽连接并成环,该结构与受到科学家广泛关注的端粒酶抑制剂Telomestatin(2,图1)以及同样具有抗肿瘤活性的IB-01211(3,图1)、Urukthapelstatin A(4,图1)的结构非常相似。
体外实验显示环肽YM-216391对人宫颈癌HeLa S3细胞生长具有很强的抑制活性,其细胞生长半数抑制剂量IC50值仅为14nM。对39种肿瘤细胞系的体外筛选实验初步表明,YM-216391可能导致肿瘤细胞的凋亡;同时通过与其他标准抗肿瘤药物的对比分析显示,YM-216391与其他抗肿瘤药物的活性谱没有特别明显的相关性,因而不能由此推测可能的作用靶标或机制。而其活性谱与RNA聚合酶抑制剂Actinomycin D、蒽环类抗肿瘤药物Epirubicin以及组蛋白脱乙酰化酶抑制剂FR901228有一定相关性,然而体外生化实验表明即使在10μM的浓度下(高于IC50值500~1000倍),YM-216391对组蛋白脱乙酰化酶仍然没有任何抑制作用。此外,YM-216391与Telomestatin结构类似,Telomestatin是很强的端粒酶抑制剂(IC50为5nM),然而对于很多肿瘤细胞的生长抑制活性YM-216391却比Telomestatin高50~250倍,因此两者是否具有不同的机制尚不清楚[J.Antibiot.(2005)58,27-31]。关于环肽YM-216391的抗肿瘤活性的更深入的药理学、作用机制以及构效关系研究正在进行中。
含噻唑啉和噻唑环的化合物除了具有明显的生物学活性外,进一步的研究表明它们能通过氢键或配位作用与小分子或者金属离子相结合。化学合成的含噻唑啉-噻唑环结构的手性大环分子与Pb2+和Cd2+具有较强的亲和能力,并且在金属离子的选择上有高度的特异性,这在环境污染的检测和治理上有很大的应用潜力[Chem.Commun.(2007)10,3444-3446]。因此,经结构改造后的环肽YM-216391的衍生物在结合并检测重金属离子方面也有很大的应用价值。
环肽YM-216391及其类似物的独特的化学结构和良好的抗肿瘤活性吸引了许多有机化学家从事其化学合成研究[Chem.Commun.(2005)8,797-799;Org.Biomol.Chem.(2008)6,1994-2010;J.Med.Chem.(2008)51,5722-5730;Org.Lett.(2006)8,4165-4167;Org.Lett.(2007)9,809-811]。化学合成方法得到的大量结构类似物可以用于构效关系的研究等,对多聚噁唑环-噻唑环类环肽药物发展具有重要意义。然而由于这些合成路线非常复杂,产率不高,因此还不能真正应用到药物生产中。而通过基因工程改造,利用微生物发酵的方法在提高环肽YM-216391的产量以及获得新的候选化合物方面都具有独特作用。
我们以链霉菌来源的环肽YM-216391为目标分子,从克隆其在Streptomyces nobilis JCM 4274(购自日本RIKEN生物资源中心)中的生物合成基因簇出发,采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成,通过体内基因操作,异源表达、体外蛋白活性测定等方法,提高其发酵产量,研究其生物合成机理,并合理修饰YM-216391的生物合成途径,探索结构稳定、活性更好、并能通过微生物大量发酵的新型YM-216391结构类似化合物。
发明内容:
本发明涉及一种由高贵链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274产生的具有抗肿瘤活性的环肽YM-216391的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。
本发明中整个基因簇共包含10个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1),其中基因ymB编码环肽YM-216391的前体肽,该前体肽包含信号肽和结构肽两个部分;4个基因(ymC,ymE,ymF,ymH)编码的蛋白负责催化形成噻唑环和噁唑环;基因ymA编码的蛋白负责催化异亮氨酸残基的异构化;基因ymD编码的蛋白负责催化苯丙氨酸残基的β-羟化;基因ymG编码的蛋白负责信号肽的切除与结构肽的环化;还包括2个调节基因(ymI,ymJ)。
本发明还提供了一个编码环肽YM-216391的前体肽的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列2中,命名为YmB,其基因的核苷酸序列位于序列1中第5652-5762个碱基处。
本发明还提供了一个编码催化环肽YM-216391的噻唑环和噁唑环形成的杂环化酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列3中,命名为YmC,其基因的核苷酸序列位于序列1中第5854-7284个碱基处。
本发明还提供了一个编码催化环肽YM-216391的噻唑环和噁唑环形成的杂环化酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列4中,命名为YmE,其基因的核苷酸序列位于序列1中第8809-9594个碱基处。
本发明还提供了一个编码催化环肽YM-216391的噻唑环和噁唑环形成的FAD依赖的氧化还原酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列5中,命名为YmF,其基因的核苷酸序列位于序列1中第9591-10547个碱基处。
本发明还提供了一个编码催化环肽YM-216391的噻唑环和噁唑环形成的NADH脱氢酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列6中,命名为YmH,其基因的核苷酸序列位于序列1中第11697-13175个碱基处。
本发明还提供了一个编码异构酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列7中,命名为YmA,其基因的核苷酸序列位于序列1中第4640-5662个碱基处。
本发明还提供了一个编码细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列8中,命名为YmD,其基因的核苷酸序列位于序列1中第7310-8812个碱基处。
本发明还提供了一个编码蛋白酶的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列9中,命名为YmG,其基因的核苷酸序列位于序列1中第10555-11700个碱基处。
本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列10中,命名为YmI,其基因的核苷酸序列位于序列1中第13166-13885个碱基处。
本发明还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列,其编码的氨基酸序列位于序列11中,命名为YmJ,其基因的核苷酸序列位于序列1中第13899-14399个碱基处。
序列1的互补序列可根据DNA碱基互补原则得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA质粒的途径。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与环肽YM-216391生物合成基因相似的基因。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从高贵链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列,也包含有Streptomyces nobilis JCM4274基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失,聚合酶链式反应,错误介导聚合酶链式反应,位点特异性突变,不同序列的重新连接,序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling),或通过紫外线或化学试剂诱变等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或得到其他致力于得到的产物。这些外源宿主包括链霉菌、小单孢菌、糖多饱菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。
本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性,或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径,也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
本发明所提供的核苷酸序列编码的环肽YM-216391的前体肽可以通过插入、置换或缺失,聚合酶链式反应,错误介导聚合酶链式反应,位点特异性突变,不同序列的重新连接等方法来产生新的环肽类化合物。
包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成噻唑环、噁唑环、D-allo-异亮氨酸、L-β-羟基苯丙氨酸等结构单元,并可以通过与其他天然产物的生物合成途径或部分生物合成途径重组,来获得包含有这些结构单元的化合物。
包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成环肽YM-216391的大环骨架和其结构类似物。
本发明所提供的环肽YM-216391骨架的后修饰基因可用于通过遗传修饰得到环肽YM-216391类似物。
总之,本发明所提供的包含环肽YM-216391生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解环肽YM-216391的生物合成机制,为进一步遗传改造提供材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
附图说明:
图1:环肽YM-216391以及几个结构相似化合物的的化学结构。
图2:环肽YM-216391生物合成基因簇的基因结构(A)和YM-216391的生物合成途径(B)。
图3:包含环肽YM-216391生物合成基因簇的粘粒的限制性内切酶酶切电泳图。
图4:环肽YM-216391生物合成基因簇在链霉菌S.lividans 1326中异源表达的发酵产物的LC-MS分析。
(A)Streptomyces nobilis JCM 4274野生型菌株;(B)S.lividans 1326,导入整合型粘粒cJXH-4C8;(B)质谱鉴定图
符号说明:
图1
YM-216391:环肽YM-216391;Telomestatin:环肽Telomestatin;IB-01211:环肽IB-01211;Urukthapelstatin A:环肽Urukthapelstatin A。
图2
无。
图3
DL15000:DNAmarker,条带从上到下为15kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、1kb、0.25kb;DL10000:DNA marker,条带从上到下为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、0.5kb;1G7BamHI/BglII:粘粒cJXH-1G7经BamHI/BglII双酶切;4C8BamHI/BglII:粘粒cJXH-4C8经BamHI/BglII双酶切;7A5BamHI/BglII:粘粒cJXH-7A5经BamHI/BglII双酶切;1G7XhoI:粘粒cJXH-1G7经XhoI双酶切;4C8XhoI:粘粒cJXH-4C8经XhoI双酶切;7A5XhoI:粘粒cJXH-7A5经XhoI双酶切。
图4
S.nobilis JCM 4274WT:环肽YM-216391产生菌S.nobilis JCM 4274野生型;S.lividans 1326,+4C8:导入整合型粘粒cJXH-4C8的S.lividans 1326菌株。
具体实施方式:
以下结合图1-图4对本发明进一步详细说明。
1.环肽YM-216391基因簇的克隆:
环肽类天然产物的生物合成途径,从氨基酸聚合机制上可分为核糖体机制合成与非核糖体机制合成两大类。环肽YM-216391中包含4个噁唑环和1个噻唑环,它们通过异亮氨酸-缬氨酸-甘氨酸形成的3肽连接并成环[J.Antibiot.(2005)58,27-31;J.Antibiot.(2005)58,32-36]。在核糖体机制和非核糖体机制合成途径中,噁唑环或噻唑环都是由相同的氨基酸经过杂环化得到,噁唑环一般都来源于丝氨酸、苏氨酸,以及其它β-羟基氨基酸等,噻唑环一般来源于半胱氨酸等[Biochemistry 2001,40,5313-5321;Chem.Biol.(2004)11,261-271;Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(2005)102,7315-7320;Chem.Biol.(2009)16,141-147]。而在上述两种不同途径中,负责催化杂环形成的酶在氨基酸序列上有很大差异。我们针对这两种不同途径,基于已有的核糖体机制中的环化脱水酶和非核糖体机制中的NRPS环化结构域的保守区域,分别设计了兼并性引物,以来源于链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274的基因组DNA为模板,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR产物经克隆、DNA测序分析表明,与已知的杂环化酶基因有很高的同源性。进一步的基因中断实验发现,得到的所有基因的中断突变菌株不能阻断YM-216391的生物合成。上述实验结果说明了在链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274中,YM-216391中噁唑环或噻唑环的催化形成不是由上述克隆得到的杂环化酶所负责,而是由其他未知的蛋白所催化的。由于没有更有依据的其他推测途径可以用于YM-216391基因簇的克隆,我们考虑从链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274的基因组测序出发,寻找并克隆其生物合成基因簇。
在链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274的基因组序列中,本发明人通过基因组搜索以及BLAST比对、功能分析的方法,寻找到了负责YM-216391生物合成的基因簇。然后采用PCR筛选基因组文库的方法,得到了包含YM-216391生物合成基因的3个粘粒:cJXH-1G7,cJXH-4C8,cJXH-7A5。将筛选得到的粘粒用BamHI+BglII酶切分组并对其相对位置进行关联,3个粘粒共涵盖了染色体约50kb的区域。通过与全测序得到的基因簇序列的BamHI+BglII酶切图谱进行比较,证实上述3个粘粒包括预期的基因簇。分别用针对基因簇中的每个基因的特异性引物对这3个粘粒进行PCR检测,都扩增得到了特异性条带,进一步证实该3个粘粒都包含有全部的YM-216391生物合成的基因。
2.环肽YM-216391的生物合成基因簇的序列分析及功能分析:
本发明人分析了基因组中包含YM-216391生物合成基因簇的21,000bp连续核苷酸序列,其GC含量为70.53%,共包含了17个开放式读码框(open reading frame,ORF),其中与环肽YM-216391生物合成相关的有10个。各个基因功能的分析结果见表1。
表1环肽YM-216391生物合成基因簇中各基因编码蛋白的功能分析
3.环肽YM-216391的生物合成基因簇边界的确定:
根据对生物合成基因簇以及两侧的基因编码的蛋白的功能分析,我们初步判定环肽YM-216391的生物合成基因簇从基因pnA到pnJ(图2),共10个开放式读码框,涵盖染色体9.76kb的区域。其中1个基因(ymB)用于编码环肽YM-216391的前体肽;4个基因(ymC,ymE,ymF,ymH)用于编码噁唑环或噻唑环合成酶;1个基因(ymA)用于编码异构酶;1个基因(ymD)用于编码P-450氧化酶;1个基因(ymG)用于编码蛋白酶;还包括2个调节基因(ymI,ymJ)。
4.环肽YM-216391中前体肽的生物合成:
基因簇中的基因ymB负责编码YM-216391的前体肽,该前体肽由两端的信号肽和中间结构肽部分组成。N端信号肽序列MTAEIEEVDIEVG,以及C端信号肽序列SLELEEDDLDVAADE,主要作用负责后续催化蛋白对前体肽的识别和转运等;中间结构肽序列FIVGSSSC,与环肽YM-216391的大环骨架的氨基酸前体顺序完全吻合。这也从基因水平上证实了环肽YM-216391的大环骨架是按照核糖体机制来合成的。该过程类似于细胞中蛋白质和多肽的生物合成,在核糖体中经过翻译逐步形成环肽YM-216391的聚肽链前体,前体经水解释放后,再由后续的酶催化形成各种杂环单元,以及大环骨架和其他后修饰基团。
5.环肽YM-216391中噁唑环和噻唑环单元的生物合成:
根据基因簇中的基因ymC和ymE所编码的蛋白的生物信息学分析,ymC和ymE负责编码环化脱水酶或杂环化酶,它们负责催化肽链骨架上的丝氨酸和β-羟基苯丙氨酸残基上的羟基或半胱氨酸残基上的巯基进攻上游邻位的羰基,形成5元N杂环,接着脱去一分子水,形成噁唑啉或噻唑啉。然后由ymH编码的NADH脱氢酶或ymF编码的FAD依赖的氧化还原酶催化脱去一分子氢,将噁唑啉或噻唑啉分别转变为噁唑或噻唑。由β-羟基苯丙氨酸残基形成的噁唑单元需要在苯丙氨酸残基的β-羟基化和肽链大环骨架成环以后才能催化形成,因此其在生物合成途径中的合成时序与其他噁唑或噻唑单元不同,负责催化这两种反应的酶在底物选择上也有差异。具体来说,在第一步的杂环化中,基因ymC和ymE所编码的蛋白协同作用,形成3个噁唑啉或1个噻唑啉,然后经ymH编码的NADH脱氢酶作用形成噁唑或噻唑;在第二步杂环化中,基因ymE所编码的环化脱水酶作用于聚肽大环环合后的底物,形成第4个噁唑啉,然后经ymF编码FAD依赖的氧化还原酶作用形成噁唑。
6.环肽YM-216391中β-羟基苯丙氨酸残基的生物合成:
YM-216391生物合成基因簇中存在一个细胞色素P450氧化酶基因ymD,负责环肽YM-216391生物合成途径中的氧化后修饰,催化YM-216391上苯丙氨酸残基的β-位的羟化,具体催化底物可以是线性前体肽,也可以是大环环合以后的环肽。催化生成的苯丙氨酸β-位的羟基作为亲核基团,进攻邻位的羰基形成第4个噁唑环。
7.环肽YM-216391中D-allo-异亮氨酸残基的生物合成:
环肽YM-216391中的异亮氨酸经过NMR分析、酸水解分析、化学全合成等方法证实了其构型为D-allo-异亮氨酸[J.Antibiot.(2005)58,32-36;Chem.Commun.(2005)8,797-799],而核糖体机制可以利用的天然异亮氨酸构型为L-异亮氨酸,因此在YM-216391的生物合成途径中必然存在一个起异构化作用的蛋白负责其构型的转变。经过生物信息学分析,推测基因ymA编码的蛋白负责催化L-异亮氨酸残基的异构化,形成D-allo-异亮氨酸。
8.环肽YM-216391生物合成基因簇的应用——通过对环肽YM-216391生物合
成基因簇的异源表达可以在异源宿主中合成环肽YM-216391
将包含全部YM-216391生物合成基因簇的粘粒cJXH-4C8,通过实施例5中属间接合转移的方法导入到变铅青链霉菌Streptomyces lividans 1326中,经阿泊拉霉素抗性筛选,得到异源表达突变株。突变株通过基因型验证正确后,参照实施例7中的发酵和检测方法进行表型分析,通过LC-MS检测在突变株中新产生的环肽YM-216391化合物。结果表明,环肽YM-216391生物合成基因簇可以在变铅青链霉菌Streptomyces lividans 1326中表达并催化产生环肽YM-216391化合物。
以下进一步提供实施实例,这些实施实例有助于理解本发明,仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
实施例1
环肽YM-216391产生菌链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274总DNA的提取:
将100μL 1x108链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274孢子悬液接种到3mLISP-2(酵母提取物0.4%,麦芽提取物1.0%,葡萄糖0.4%,pH 7.2)液体培养基中,30℃,230rpm培养约24hr后达到对数生长期后期,取2mL接种到50mLISP-2中(含25mM氯化镁),30℃,250rpm培养约23hr后达到稳定生长期前期,呈乳黄色浑浊,将菌液4℃,3500rpm,离心15min收集菌丝,用裂解液洗涤,收集淡乳黄色菌丝0.5mL。向1mL菌丝中加入10mL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)共四管,涡旋至均一,37℃水浴15min。加入0.1mL蛋白酶K(10mg/mL,用裂解液新鲜配制),1mL 10%十二烷基硫酸钠,混匀后迅速放入70℃水浴15min,呈澄清。置冰上冷却,加入2.5mL 5M KAc,冰上冷却15min。加入10mL饱和酚,充分混匀,加入10mL氯仿,混匀,12000rpm,4℃离心20min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管,加等量的氯仿-异戊醇(24:1)抽提,12000rpm,4℃离心10min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管,加2倍的无水乙醇,混匀,有大团的DNA出现。将其钩出置于新的离心管,加5mL70%乙醇洗涤,将液体倾出,用枪吸净,加5mL TE溶解,加RNase A使终浓度为50μg/mL,37℃温育0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次,氯仿-异戊醇抽提两次,向水相中加入0.1体积的3M醋酸钠,2体积的无水乙醇,轻轻的混合充分,有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管(每管中有1mL 70%乙醇用于洗涤),将液体吸出,再加1mL无水乙醇洗涤,吸出乙醇,超净台中吹干,溶于适当体积的TE(pH 8.0)中。
实施例2
环肽YM-216391产生菌链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274遗传转移系统的建立:
培养含有适当质粒的E.coli ET12567至OD6000.4-0.6,20mL LB培养液中的细菌细胞离心收集,用等体积的LB洗两次,重悬于2mL LB中,作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于-80℃的Streptomyces nobilis JCM 4274的20%甘油孢子悬液500μL,用等体积的TES(2-[(三(羟甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸)缓冲液(50mM TES Na,pH 8.0)洗两次,重悬于等体积的TES缓冲液,50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB培养基,37℃温育2-5hr。离心重悬于0.5-1mLLB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mM氯化酶的MS平板培养基(甘露糖醇2.0%,黄豆粉2.0%,琼脂粉2.0%)上,30℃温浴20hr后,采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌,在每一平板的表面覆盖1mL含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和相应抗生素的无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。
实施例3
环肽YM-216391产生菌链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274基因组文库的构建:
EPI300-T1R菌种的复苏:将试剂盒中提供的宿主菌EPI300-T1R取出,涂布或者画线于不含任何抗生素的LB平板上,37℃过夜培养后保存于4℃冰箱中(最好不超过一个星期)。在准备包装的前一天,从保存的平板上挑取单克隆于含10mM硫酸镁的50ml LB中,37℃过夜培养。
文库载体的制备:使用含有三个cos位点的pOJ446-152作为载体构建基因组文库。制备方法如下:用EcoRV单酶切,然后脱磷(防止载体自连)。
插入片段的制备:Cosmid DNA文库插入片段的大小在40kb左右,其制备可以使用注射器或者小孔的吸管(移液管)通过反复的吸取和推出来实现,次数根据片段原始的大小来决定,一般每50次用电泳检查一次效果,直至片段大小合乎要求(10%左右的片段在36kb的对照DNA附近)。此步骤中,基因组总DNA的用量最少在2.5μg以上。
目标片段的蔗糖梯度分离及回收:取进口蔗糖梯度离心管(高速离心管,体积10ml,直径约1cm)一只,加入6ml 40%蔗糖,然后小心在其顶部加入6ml10%蔗糖。用封口膜将管口封住(可以用绳子扎住),在干毛巾上缓慢地将管子倾斜成水平位置,用其本身地气泡来调平,室温下放置3.5小时。缓慢将管子回复回复垂直位置,蔗糖梯度即成。拿掉封口膜,把待分离的已打碎的总DNA样品加在12ml的蔗糖梯度上。严格配平,精确到小数点后三位。17℃,2,4000rpm离心16小时。结束离心,以400ul一管的体积从上到下收集,要把枪头剪平。从每管中取出10ul用0.3%或者0.4%的胶电泳检测。取目标管总DNA,加1/10体积的氯化钠,2.5倍体积乙醇沉淀,洗涤,抽干后溶于ddH20。电泳并定量。
将大小合适的DNA片段脱磷,体系如下:
将体系37℃温浴1小时,补加10μL SAP混匀,接着温浴1小时后,70℃加热变性使酶失活。依次加0.1体积的3M NaAc,3倍体积的无水乙醇沉淀DNA,70%乙醇洗,抽干后溶于50μL ddH20。经连接检测脱磷完全。连接体系为:
1)2μL 脱磷脱氧核糖核酸
将DNA片段连至载体:以10∶1(载体∶片段)的比例进行连接反应。反应体系如下:
室温反应2h。70℃温浴10min将Fast-Link DNA Ligase失活,然后存于-20℃。
包装:以复苏的EPI300-T1R为种子,以10%的接种量,接入10mM硫酸镁的50ml LB中,37℃培养至OD600=0.8-1.0,冰上放置(最长可放置72h)。以10μl连接产物/1管包装蛋白的比例,冰上融化包装蛋白。取1.5ml灭菌离心管,置于冰上,从每支包装蛋白取25μl(总量的一半)加到离心管中,并迅速将剩下的25μl包装蛋白冻存于-70℃。将5.3中的10μl连接产物加入到含25μl包装蛋白的离心管中,置于冰上。混匀(用移液枪),注意不要引入气泡,短暂离心,将液体甩至管底。30℃温浴90min。将每支包装蛋白剩下并冻存的25μl包装蛋白迅速加入至含反应物的离心管中,混匀。30℃温浴90min。向每支离心管中加入稀释缓冲液至终体积为1ml.,轻轻混匀后。向每支加入25μl氯仿,轻轻混匀后保存于4℃。
滴度测定:按照下述比例稀释包装蛋白:噬菌体稀释缓冲液
A)1∶102稀释度:10ul包装噬菌体溶液加入到990ul噬菌体稀释缓冲液.
B)1∶104稀释度:10ul 1∶102稀释度溶液加入到990ul噬菌体稀释缓冲液.
C)1∶105稀释度:100ul 1∶104稀释度溶液加入到900ul噬菌体稀释缓冲液.
D)1∶106稀释度:100ul 1∶105稀释度溶液加入到900ul噬菌体稀释缓冲液.
取1.5ml灭菌离心管,向其中加入中宿主菌EPI300-T1R各100μl,并向各管中分别加入10μl 7.1中的稀释液,37℃温浴20min。将转染好的菌液涂布于含50μg/ml阿泊拉霉素的LB平板,37℃过夜。克隆计数,计算滴度。
转染与保存:根据滴度确定的稀释比例将得到的包装DNA稀释,此时可以加入甘油至终浓度20%,然后将包装DNA作为初级文库冻存于-70℃;或者进行转染,并将转染后得到的克隆用合适体积的LB洗下后加入甘油(终浓度20%),冻存于-70℃。
实施例4
PCR方法克隆环肽YM-216391生物合成基因簇:
PCR体系包含:二甲基亚砜(8%,v/v),氯化酶(25mM),三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)(2.5mM),筛库第一对引物(40mM),Taq DNA聚合酶(2.5u)及适量模板(Streptomyces nobilis JCM 4274总DNA,或者Cosmid文库粘粒)。首先95℃,3min,1轮;然后94℃,1min,68℃,1min,72℃,2min,5轮;94℃,1min,65℃,1min,72℃,2min,30轮;最后72℃,10min,1轮。PCR结束后,1%琼脂糖电泳检查结果。对于PCR有阳性条带的粘粒,采用第二对引物加以PCR验证。对于两队引物PCR都有阳性条带的粘粒,选用BamHI+BglII双酶切,XhoI酶切,分析酶切图谱(图3),并与基因组序列中的相应酶切图谱比较,最终确证所得到的粘粒包含有环肽YM-216391的生物合成基因簇。筛选文库采用的引物分别为:
第一对引物YA15’-GGGGACAAGGAAGTCAGGAGG-3’;
YA25’-GCTGCGATGCCGAAGGAGA-3’;
第二对引物YJ-15’-CGATTCCCGGCAAGTGCA-3’;
YJ-25’-CCGCTTCTCGTCGGTGATGTT-3’。
实施例5
变铅青链霉菌Streptomyces lividans 1326异源表达突变株的获得:
培养含有适当质粒的E.coli S17-1至OD6000.4-0.6,20mL LB培养液中的细菌细胞离心收集,用等体积的LB洗两次,重悬于2mL LB中,作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于-80℃的Streptomyces lividans 1326的20%甘油孢子悬液500μL,用等体积的TES(2-[(三(羟甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸)缓冲液(50mM TES Na,pH 8.0)洗两次,重悬于等体积的TES缓冲液,50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB培养基,37℃温育2-5hr。离心重悬于0.5-1mLLB中作为链霉菌受体细胞。将100μL的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mM氯化酶的MS平板培养基(甘露糖醇2.0%,黄豆粉2.0%,琼脂粉2.0%)上,30℃温浴20hr后,采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌,在每一平板的表面覆盖1mL含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和阿泊拉霉素(终浓度为100ng/μL)的无菌水。30℃培养3天以上挑取接合子。
将获得的接合子接种到液体培养基TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL,萘啶酮酸=25μg/mL)中,30℃振荡约28hr。取出100μL涂布在MS(阿伯拉霉素=50μg/mL),30℃培养7天,收孢子,保存于-80℃;取出100μL菌液接种于在TSB(阿伯拉霉素=25μg/mL,5mM氯化酶,0.5%甘氨酸)中,30℃振荡培养2天,用于抽提突变菌株的基因组总DNA,采用PCR方法验证其基因型。
实施例6
环肽YM-216391产生菌链霉菌Streptomyces nobilis JCM 4274的发酵、产物分离纯化与鉴定:
取Streptomyces nobilis JCM 4274冻存孢子100μL接种到MS平板上,30℃培养7天;将培养好的固体培养基冷冻抽干,捣碎后加50mL 80%丙酮,超声破菌60分钟(超声10秒,间隔50秒),搅拌器搅拌2小时;过滤(或离心)收集有机相,将丙酮旋转蒸发后,用乙酸乙酯萃取有机相,旋蒸除去乙酸乙酯,得到浸膏,用1mL无水甲醇溶解,离心后HPLC及LC-MS分析。
取发酵液提取物的甲醇的溶液20μL进样;检测波长:UV=287nm;流动相条件:流速=0.85mL/min;A流动相=H2O(含0.05%TFA);B流动相=乙腈(含0.05%TFA);洗脱条件:0-10min 10%B;10-20min 50%B;20-30min 10%B洗脱时间为30min。
实施例7
链霉菌Streptomyces lividans 1326野生型和异源表达突变株的发酵、产物分离纯化与鉴定:
分别取Streptomyces lividans 1326野生型和异源表达突变株的冻存孢子100μL,接种10ml的YEME种子培养基中,30℃摇床培养24h;取2m1种子培养液接种到50ml YEME发酵培养基中,30℃摇床培养5天。离心取菌丝体,用50mL 80%丙酮,超声破菌60分钟(超声10秒,间隔50秒),搅拌器搅拌2小时;过滤(或离心)收集有机相,将丙酮旋转蒸发后,用乙酸乙酯萃取有机相,旋蒸除去乙酸乙酯,得到浸膏,用1mL无水甲醇溶解,离心后HPLCC及LC-MS分析。
取发酵液提取物的甲醇的溶液20μL进样;检测波长:UV=287nm;柱子:Agilent ZORAX SB-C18 5μm 4.6*250mm;流动相条件:流速=0.85mL/min;A=H2O(含0.05%TFA);B=乙腈(含0.05%TFA);洗脱条件:0-10min 10%B;10-20min 50%B;20-30min 10%B洗脱时间为30min。
Claims (9)
1.一种环肽YM-216391的生物合成基因簇,该基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其中编码环肽YM-216391生物合成所涉及的10个基因,包括环肽YM-216391的前体肽基因ymB,杂环化酶基因ymC和ymE,NADH脱氢酶基因ymH,异构酶基因ymA,细胞色素P450氧化酶基因ymD,蛋白酶基因ymG,FAD依赖的氧化还原酶基因ymF,调节基因ymI和ymJ。
2.根据权利要求1所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇,其特征在于所述的该核糖体机制编码的前体肽包含下述两个部分:信号肽部分和结构肽部分。
3.一种根据权利要求1所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇的用途,其编码蛋白用于催化合成环肽YM-216391及其类似物或者用于调节环肽YM-216391及其类似物的产量。
4.根据权利要求3所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇的用途,其特征是所述的基因簇的编码蛋白催化合成环肽YM-216391的大环骨架。
5.根据权利要求3所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇的用途,其特征是所述的基因簇的编码蛋白催化合成噻唑环。
6.根据权利要求3所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇的用途,其特征是所述的基因簇的编码蛋白催化合成噁唑环。
7.根据权利要求3所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇的用途,其特征是所述的基因簇的编码蛋白催化肽链骨架上异亮氨酸残基的异构化。
8.根据权利要求3所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇的用途,其特征是所述的基因簇的编码蛋白催化肽链骨架上苯丙氨酸残基的β-羟化。
9.根据权利要求3所述的环肽YM-216391的生物合成基因簇的用途,其特征是所述的基因簇通过在链霉菌中的异源表达可以产生环肽YM-216391。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110907 |