CN101275141B - 阿嗪霉素的生物合成基因簇 - Google Patents

Abstract

本发明是一种由链霉菌产生的具有抗肿瘤活性的抗生素——阿嗪霉素(Azinomycin B)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。整个基因簇共包含34个基因：1个重复使用的I型聚酮合成酶基因；2个萘环修饰酶基因；8个非核糖体聚肽骨架合成及修饰酶基因；11个非天然氨基酸结构单元合成酶基因；1个抗性基因；3个后修饰酶基因以及8个功能不确定的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断阿嗪霉素的合成；对萘环合成和修饰基因的异源表达可产生其前体化合物。本发明所提供的基因及其蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

阿嗪霉素的生物合成基因簇

技术领域：

本发明属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗肿瘤抗生素阿嗪霉素(Azinomycin B)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

阿嗪霉素(Azinomycins)是一种能够诱导DNA链间交联的天然抗生物，由链霉菌Streptomyces sahachiroi NRRL2485所产生，结构十分独特。它含有两个活性很强的反应中心：氮杂双环(1-azabicyclo[3.1.0]hexane)的脱水氨基酸残基和环氧三元环。其中的氮环结构仅在天然化合物Ficellomycin中发现[J.Antibiot.(1989)42，357-360]。作为一类小分子化合物，阿嗪霉素可以结合在DNA的大沟，选择性地作用于序列5’-d(PuNpy)-3’[J.Am.Chem.Soc.(2002)124，13008-13017]，通过氮杂环上的C-10原子对DNA嘌呤氮的亲电子攻击形成烷基化的单聚络合物，进而启动环氧杂环系统的C-21原子对DNA互补链上鸟嘌呤G的N-7原子进行亲电子攻击，最终使DNA双链发生链间交联。阿嗪霉素具有良好的抗肿瘤活性，组分A和组分B在体外对于肿瘤细胞株L5178Y的IC₅₀抑制率分别为0.07和0.11ug/ml[J.Antibiot.(1986)39，1527-1532]。在体内一系列实体瘤的生长抑制方面，B组分要优于A组分，其治疗效果与临床上使用的ISC抗生物丝裂霉素C相当，但剂量更低(如能使肿瘤小鼠45天的存活率达到57％和生命期延长200％左右的阿嗪霉素B和丝裂霉素C的用量分别为32ug/kg/day和1mg/kg/day)[J.Antibiot.(1987)40，60-65]。由于阿嗪菌素所诱导细胞DNA的ISC反应和烷基化反应受pH影响很大，在pH较低的反应环境中发生较快；而肿瘤细胞相对于正常细胞，通常由于产生过多的乳酸导致pH较低，这就使阿嗪霉素在肿瘤治疗过程中具有一定的选择性[J.Biochem.(1977)55，630-635]。但是，阿嗪霉素化学结构的不稳定严重限制了它们在临床上的应用[J.Antibiot.(1986)39，1527-1532]。

鉴于阿嗪霉素良好的生物活性，近40种通过化学合成获得的结构类似物被用于大量肿瘤细胞株的活性测试，包括部分药物抗性细胞株[Tetrahedron(2001)57，4467-4488；Bioorg.Med.Chem.Lett.(2005)15，653-656]。研究发现，只保留环氧系统的结构类似物仍然具有很高的细胞毒性(只发生DNA的烷基化，不引起ISC效应)，而只有氮杂双环的结构类似物活性急剧下降，表明氮杂双环的化学结构虽然对于DNA的烷基化十分重要，但并非阿嗪霉素生物活性所必须[Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)10，239-241；Biochemistry(2000)39，14968-14975；Angew.Chem.Int.Ed.(2000)39，3467-3470]。同时，阿嗪霉素的抗肿瘤活性与环氧系统两侧的萘甲酸和氨基边链取代基的微小变化都会引起活性的明显变化，显示两者对活性中心环氧系统发生的效应有增强作用[Org.Lett.(2002)4，3545-3548]。

构效关系研究显示，诱导ISC的发生并非阿嗪霉素及其类似物产生细胞毒性的唯一途径，可能还存在由环氧系统所介导的其它细胞效应方式。一系列具有较好生物活性的类似物的获得，表明阿嗪霉素是一类很好的可用于新药开发的先导化合物。阿嗪霉素的药效基团和其它化学结构的重新组合，可能创造出更有临床应用价值的新型药物。但是，由于过于集中的化学官能团和结构的不稳定，阿嗪菌素的获得是合成化学的巨大挑战。自1986年首次发现以来，2001年才首次完成了阿嗪霉素A的化学合成[Tetrahedron(2001)57，4467-4488；J.Am.Chem.Soc.(2001)40，1736-1739]。通过化学合成所获得的结构类似物即使在活性和结构稳定性方面的性质得到改善，也可能因为合成的复杂性而使实际生产成本过高。

我们以微生物来源的阿嗪霉素为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成机制的研究揭示包括氮杂双环在内的独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰阿嗪霉素的生物合成途径，探索结构稳定、活性更好、并能通过微生物发酵大量生产的新型药物。

发明内容：

本发明涉及一种由链霉菌Streptomyces sahachiroi NRRL2485产生的具有抗肿瘤活性的抗生素—阿嗪霉素(Azinomycin)的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。

本发明中整个基因簇共包含34个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中1个(aziB)用于编码重复使用的I型聚酮合成酶(PKS)，共包含5个功能域，负责萘甲酸基团的生物合成；2个基因(aziB1和aziB2)编码的氧化酶和甲基转移酶负责对萘环进行修饰；8个基因(aziA1，aziA2，aziA3，aziA4，aziA5，aziA6，aziA7，aziA8)负责合成非核糖体聚肽骨架合成及修饰；11个基因(aziC1，aziC2，aziC3，aziC4，aziC5，aziC6，aziC7，aziC8，aziC9，aziC10，aziC11)负责非天然氨基酸结构单元的合成酶；还包括1个抗性基因(aziE)、3个后修饰酶基因(aziD1，aziD2，aziD3)以及8个功能不确定的基因(aziH1，aziH2，aziH3，aziF，aziG，aziU1，aziU2，aziU3)。

本发明还提供了一个编码包含AL，KR，PCP非核糖体聚肽合成酶结构域的的苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列组成，命名为aziA3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第2596-6387碱基处。

本发明还提供了一个硫酯酶的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组成，命名为aziA6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第6384-7205碱基处。

本发明还提供了一个编码包含C，A，PCP非核糖体肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列组成，命名为aziA4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第7202-10513碱基处。

本发明还提供了一个编码硫酯酶的核苷酸序列，由序列5中的氨基酸序列组成，命名为aziA7，其基因的核苷酸序列位于序列1中第10796-11548碱基处。

本发明还提供了一个编码O-甲基转移酶的核苷酸序列，由序列6中的氨基酸序列组成，命名为aziB2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11548-12585碱基处。

本发明还提供了一个编码细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序列组成，命名为aziB1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第12587-13792碱基处。

本发明还提供了一个编码包含AL，PCP非核糖体肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列8中的氨基酸序列组成，命名为aziA1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第13873-15756碱基处。

本发明还提供了一个编码转运蛋白的核苷酸序列，由序列9中的氨基酸序列组成，命名为aziE，其基因的核苷酸序列位于序列1中第15839-17239碱基处。

本发明还提供了一个编码包含C，PCP，C非核糖体肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列10中的氨基酸序列组成，命名为aziA2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第17541-20888碱基处。

本发明还提供了一个编码硫酸腺苷酰转移酶亚单位1的核苷酸序列，由序列11中的氨基酸序列组成，命名为aziH2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第20878-22185碱基处。

本发明还提供了一个编码硫酸腺苷酰转移酶亚单位2的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组成，命名为aziH1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第22185-22997碱基处。

本发明还提供了一个编码腺苷酰硫酸激酶的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为aziH3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第23101-23658碱基处。

本发明还提供了一个编码硫酯酶的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为aziG，其基因的核苷酸序列位于序列1中第23726-24127碱基处。

本发明还提供了一个编码MbtH类似蛋白的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为aziF，其基因的核苷酸序列位于序列1中第24328-24516碱基处。

本发明还提供了一个编码O-酰基转移酶的核苷酸序列，由序列16中的氨基酸序列组成，命名为aziD1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第24547-25758碱基处。

本发明还提供了一个编码PCP/ACP的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命名为aziC11，其基因的核苷酸序列位于序列1中第25755-26018碱基处。

本发明还提供了一个编码酮基转移酶C-端亚单位的核苷酸序列，由序列18中的氨基酸序列组成，命名为aziC6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第26021-27043碱基处。

本发明还提供了一个编码酮基转移酶N-端亚单位的核苷酸序列，由序列19中的氨基酸序列组成，命名为aziC5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第27040-27975碱基处。

本发明还提供了一个编码氨基转移酶的核苷酸序列，由序列20中的氨基酸序列组成，命名为aziC7，其基因的核苷酸序列位于序列1中第27972-29294碱基处。

本发明还提供了一个编码N-己酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶的核苷酸序列，由序列21中的氨基酸序列组成，命名为aziC4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第29735-30658碱基处。

本发明还提供了一个编码N-己酰谷氨酸激酶的核苷酸序列，由序列22中的氨基酸序列组成，命名为aziC3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第30737-31615碱基处。

本发明还提供了一个编码N-己酰-鸟氨酸/N-己酰-赖氨酸脱酰基酶的核苷酸序列，由序列23中的氨基酸序列组成，命名为aziC10，其基因的核苷酸序列位于序列1中第31608-32738碱基处。

本发明还提供了一个编码己酰-CoA脱氢酶/还原酶的核苷酸序列，由序列24中的氨基酸序列组成，命名为aziC8，其基因的核苷酸序列位于序列1中第32741-33559碱基处。

本发明还提供了一个编码包含C，A，PCP，RE非核糖体肽合成酶结构域的核苷酸序列，由序列25中的氨基酸序列组成，命名为aziA5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第33638-38261碱基处。

本发明还提供了一个编码包含KS，AT，DH，KR，ACP结构域的重复使用的I型聚酮合成酶的核苷酸序列，由序列26中的氨基酸序列组成，命名为aziB，其基因的核苷酸序列位于序列1中第38515-43854碱基处。

本发明还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，由序列27中的氨基酸序列组成，命名为aziU1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第44054-44827碱基处。

本发明还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，由序列28中的氨基酸序列组成，命名为aziU2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第44838-45503碱基处。

本发明还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，由序列29中的氨基酸序列组成，命名为aziU3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第45500-46513碱基处。

本发明还提供了一个编码赖氨酸生物合成酶的核苷酸序列，由序列30中的氨基酸序列组成，命名为aziC2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第46593-47456碱基处。

本发明还提供了一个编码分枝氨基酸氨基转移酶的核苷酸序列，由序列31中的氨基酸序列组成，命名为aziC1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第47453-48184碱基处。

本发明还提供了一个编码细胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，由序列32中的氨基酸序列组成，命名为aziC9，其基因的核苷酸序列位于序列1中第48254-49513碱基处。

本发明还提供了一个编码硫酯酶的核苷酸序列，由序列33中的氨基酸序列组成，命名为aziA8，其基因的核苷酸序列位于序列1中第49525-50274碱基处。

本发明还提供了一个编码己酰-CoA脱氢酶的核苷酸序列，由序列34中的氨基酸序列组成，命名为aziD3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第50308-51456碱基处。

本发明还提供了一个编码分枝氨基酸氨基转移酶的核苷酸序列，由序列35中的氨基酸序列组成，命名为aziC2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第51462-52463碱基处。

序列1的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA质粒的途径。

本发明还提供了产生阿嗪霉素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有序列1中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与阿嗪霉素生物合成基因相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从链霉菌Streptomyces sahachiroi NRRL2485基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有Streptomyces sahachiroiNRRL2485基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成3-氧甲基-5-甲基萘甲酸及阿嗪霉素非天然氨基酸聚肽骨架，进一步催化合成抗生素。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断阿嗪霉素生物合成的一个或几个步骤而得到新的阿嗪霉素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高阿嗪霉素或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

包含本发明所提供的非核糖体聚肽合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的非核糖体聚肽合成酶系统的一个或多个非核糖体聚肽合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚肽化合物。

包含本发明所提供的聚酮合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的聚酮合成酶系统的一个或多个聚酮合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚酮化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建非核糖体聚肽合成酶库或非核糖体聚肽合成酶衍生库或组合库。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建聚酮合成酶库或聚酮合成酶衍生库或组合库。

本发明所提供的催化合成5-甲基萘甲酸和3-氧甲基-5-甲基-萘甲酸的基因可用于合成5-甲基萘甲酸和3-氧甲基-5-甲基-萘甲酸

本发明所提供的阿嗪霉素骨架的后修饰基因提供了通过遗传修饰得到类似物的途径，所包含的氧化还原反应也可有其他应用。

总之，本发明所提供的包含阿嗪霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解阿嗪霉素类天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

附图说明：

图1：阿嗪霉素的化学结构

图2：阿嗪霉素生物合成基因簇的基因结构和限制性内切酶谱。(A)5个交叠的粘粒代表了抗生链霉菌基因组80kb的DNA区域，B代表限制性内切酶BamHI，实体表示已被DNA测序的部分，Probe-P1和P2代表标记的探针部分；(B)阿嗪霉素生物合成基因簇的基因组成。

图3：提出的阿嗪霉素各组成单元的生物合成途径。(A)3-甲氧基-5-甲基萘甲酸；(B)α-酮异戊酸；(C)氮丙啶[1，2a]吡啶氨基酸；(D)NRPS骨架合成和后修饰。

图4：基因置换与基因互补突变菌株发酵产物的生物活性检测和高效液相色谱(HPLC)分析

(A)生物活性检测和(B)HPLC分析；(1)野生型发酵产物；(2)PKS基因置换的突变体(ΔaziB)发酵产物；(3)NRPS基因置换的突变体(ΔaziA3)发酵产物；(4)aziC7基因置换的突变体(ΔaziC7)发酵产物；

图5：在S.albus中异源表达阿嗪霉素的生物合成基因

(A)含有空载体pTGV2的S.albus发酵产物；(B)含有aziB的突变株的发酵产物；(C)3-甲氧基-5-甲基-萘甲酸标准品；(D)含有aziB，aziB1和aziB2的突变株发酵产物。

图6：细菌中的重复使用的I型PKS

(A)结构域组成和机制(I)AviM和CalO(II)ChlB1和MadB(III)NcsB(IV)AziB；(B)AviM，CalO5，ChlB1，，MadB，，NcsB和AziB的同源性比较。

符号说明：

图1

Azinomycin：阿嗪霉素。

图2

Probe：探针；Skeleton Assembly：骨架生成；Naphthoate：萘甲酸；Tailoring：后修饰；Building Blocks from amino acid；Functional Unassigned：功能不确定；Resistance：抗性；Unknown Function：未知功能；Beyond the Cluster：基因簇之外。

图3

AL：酰基辅酶A连接酶；PCP：肽酰载体蛋白；C：缩合酶；KR：酮基还原酶A：腺苷化酶；RE：还原酶。

图6

KS：酮基合成酶；AT：酰基转移酶；DH：脱氢酶；KR：酮基还原酶；ACP：酰基载体蛋白；2-hydroxyl-5-methyl-NPA：2-羟基-5-甲基-萘甲酸；5-methyl-NPA：5-甲基-萘甲酸。

具体实施方式：

以下结合图1-图6对本发明进一步详细说明。

1.克隆阿嗪霉素的生物合成基因片断：

尽管在阿嗪霉素的化学合成和作用机制方面的研究很多，但有关其生物合成起源方面的认识却非常少。近年来，采用13C-标记的乙酸对阿嗪霉素的生物合成进行同位素标记喂养实验表明(Chem.Commun.(2004)8，990-991；Chem.Commun.(2004)22，2600-2601)，其萘甲酸结构单元可能来源于聚酮的生物合成途径，以己酰-CoA为起始，在聚酮合成酶(PKS)的催化下，于5个丙二酰-CoA之间的连续缩合反应形成线形的聚酮中间产物，经过醛缩反应成环，脱水、发生甲基取代最终形成萘甲酸的结构单元。标记实验同时显示，烯醇残基可能来源于苏氨酸，含有氮杂双环的脱水氨基酸残基则可能来源于α-酮戊二酸衍生物(如谷氨酸)。此外，推测环氧残基可能来源于缬氨酸。由于氨基酸残基的高度修饰，包含环氧系统和氮杂双环的短肽结构单元可能是由非核糖体聚肽合成酶(NRPS)催化形成。

阿嗪霉素的萘甲酸结构单元与新制癌菌素(neocarzinostatin)的萘甲酸结构单元非常相似。已有研究表明(Chem Biol(2005)12，293-302)，新制癌菌素的萘甲酸结构单元是由重复使用的I型PKS所合成。根据仅有的几例重复使用的I型PKS的保守区域，设计了简并性引物5’-GCG GAC GGC TAC GGS MGNGGNGAR GG-3’和5’-CGA GCC GTG GCC SGA RAA NAC CCA NAC-3’，采用快速PCR的方法(Biochem Biophys Res Commun(2006)345：133-139)，从阿嗪霉素产生菌的总DNA中克隆编码PKS基因部分序列，得到约0.8kb的PCR产物，克隆入pGEM-T Easy载体，经限制性内切酶分组，DNA顺序分析表明与已知的重复使用的I型PKS基因有很高的同源性。

2.阿嗪霉素生物合成基因簇的克隆，序列分析及功能分析：

将上述PKS基因片段用地高辛标记为探针Probe-1从Streptomyces sahachiroiNRRL2485的基因组文库约6000个克隆中筛选，分离得到的粘粒涵盖了染色体约50kb的区域。在此基础上经染色体步移得到了5个交叠的粘粒pAL1022，pAL1023，pAL10024，pAL1025，和pAL1026涵盖了染色体约80kb的区域(图2A)。DNA顺序分析了63,549bp的染色体区域，GC含量71.48％。生物信息学分析包含了47个开放读码框(图2B)。orf(-1)和详细的分析结果列于表1。

表1阿嗪霉素生物合成基因簇中各基因及编码蛋白的功能分析

基因	氨基酸数目	相似蛋白	同一性/相似性％	推测功能
					orf(-1)aziA3aziA6aziA4aziA7aziB2aziB1aziA1aziEaziA2aziH2aziH1aziH3aziGaziFaziD1aziC11aziC6aziC5aziC7aziC4aziC3aziC10aziC8aziA5aziBaziU1aziU2aziU3aziC2aziC1AziC9aziA8	143126327311032503454016274661115435270185133624038734031144030729237627215411779257221337287243419249	SpoIIE(CAK50935)CesA(ABK00751)GrsT(YP_001106480)EndB(ABD65957)TeLB(AAT45287)Strop_0204(YP_001157067)Haur_3696(YP_001546460)NosC(AAF17280)SpcT(AAF63340)NosD(AAF17281)SCO6097(NP_630205)SCO6098(NP_630206)ORFQ(BAC79014)Strop_1904(YP_001158744)SimX2(AAK06794)Srm6<sup>*</sup>(CAM96572)PPA1287(YP_055995)TktC(NP_561213)TM0954(NP_228762)OleN2(AAD55458)ArgC(YP_604156)TTC1541(YP_005510)Caur_1204(YP_001634822)ORF39(ABD65959)SfmC(ABI22133)NcsB(AAM77986)Orf(-12)(AAN85502)Rxyl_2597(YP_645326)SMb20513(NP_437034)Rcas_3469(YP_001433537)At5g27410(Q9ASR4)CypLB(AAT45286)BorB(CAE45660)	75/6260/4157/4150/3865/5264/5048/3153/3749/3145/3088/8393/8881/6766/5555/4756/4258/3661/4161/4453/4355/4555/3654/4063/4730/4266/5250/3247/3042/2561/4443/2858/3954/40	孢子化蛋白NRPS(A-KR-PCP)硫酯酶NRPS(C-A-PCP)硫酯酶O-甲基转移酶细胞色素P450羟化酶NRPS(AL-PCP)转运蛋白NRPS(C-PCP-C)硫酸腺苷酰转移酶亚单位1硫酸腺苷酰转移酶亚单位2腺苷酰硫酸激酶硫酯酶MbtH类似蛋白O-己酰转移酶PCP/ACP酮基转移酶C-端亚单位酮基转移酶N-端亚单位氨基转移酶N-己酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶N-己酰谷氨酸激酶N-己酰-鸟氨酸/N-己酰-赖氨酸脱己酰基酶己酰-CoA脱氢酶NRPS(C-A-PCP-RE)重复使用I型PKS(KS-AT-DH-KR-ACP)未知蛋白未知蛋白未知蛋白赖氨酸生物合成酶分枝氨基酸氨基转移酶细胞色素P450羟化酶硫酯酶

aziD3aziD2orf1orf2orf3orf4orf5orf6orf7orf8orf9orf10orf11orf12

382333371175128207249249199151137286493198

MAV_1338(YP_880582)Acd_9(YP_326591)Nfa26740(YP_118885)SACE_4220(YP_001106414)Franean1_6978(YP_001511217)Mmc1_2644(YP_866546)ECA0747(YP_048859)SACE_4949(YP_001107140)SACE_4948(YP_001107139)StPAI005(AAW49299)Orf2(BAF46969)SAML0296(CAJ89283)SCO2878(NP_627106)SAV_5747(NP_826924)

53/3337/2562/5073/6263/5254/4071/5991/8488/8360/4778/6362/4547/3089/81

己酰-CoA脱氢酶己酰-CoA脱氢酶未知蛋白未知蛋白未知蛋白转座酶短链脱氢酶短链脱氢酶TetR-家族转录调节因子未知蛋白转录调节因子脱氢酶未知蛋白二元系统调节因子

3.阿嗪霉素生物合成基因簇边界的确定：

根据基因编码蛋白的功能分析，阿嗪霉素的生物合成基因簇被确定为从基因aziA3到aziD2(图2B)，包含34个开放读码框。其中1个(aziB)用于编码重复使用的I型聚酮合成酶(PKS)，共包含5个功能域，负责萘甲酸基团的生物合成；2个基因(aziB1和aziB2)编码的氧化酶和甲基转移酶负责对萘环进行修饰；8个基因(aziA1，aziA2，aziA3，aziA4，aziA5，aziA6，aziA7，aziA8)负责合成非核糖体聚肽骨架合成及修饰；11个基因(aziC1，aziC2，aziC3，aziC4，aziC5，aziC6，aziC7，aziC8，aziC9，aziC10，aziC11)负责非天然氨基酸结构单元的合成酶；还包括1个抗性基因(aziE)、3个后修饰酶基因(aziD1，aziD2，aziD3)以及8个功能不确定的基因(aziH1，aziH2，aziH3，aziF，aziG，aziU1，aziU2，aziU3)。基因中断及基因置换aziB，aziC7，和aziA3完全抑制了阿嗪霉素的产生(图4)，进一步证明了克隆到基因簇为阿嗪霉素的生物合成基因簇。

4.萘甲酸结构单元的生物合成途径：

萘甲酸结构单元的生物合成如图3A所示。aziB编码的重复使用的聚酮合成酶(包括KS，AT，DH，KR，ACP结构域)催化1分子乙酰辅酶A和5分子丙二酰辅酶A缩合，脱除5分子水生成5-甲基萘甲酸。aziB1编码的P450羟化酶催化5-甲基萘甲酸在3-位的羟化反应，生成的羟基接着在aziB2编码的O-甲基转移酶催化下进行甲基化修饰，从而完成阿嗪霉素中3-甲氧基-5-甲基萘甲酸单元的生物合成。

5.来源于氨基酸的特殊结构单元的生物合成：

α-酮戊二酸推测由缬氨酸在aziC1所编码分枝氨基酸氨基转移酶的作用下发生脱氨基反应所产生(图3B)，此过程与初级代谢中缬氨酸分解代谢的第一步反应一致。

阿嗪霉素中含有一个非常特别的氮杂双环[3.1.0]己烷的螺环体系，该结构的生物合成过程如图3C所示。aziC2编码的N-乙酰基转移酶催化谷氨酸α-氨基的乙酰化，接着在aziC3编码的N-乙酰谷氨酸激酶和aziC4编码的γ-谷氨酰磷酸还原酶的作用下生成N-乙酰谷氨酸γ-半醛。在aziC5与aziC6共同编码的转羟乙醛基酶的作用下，N-乙酰谷氨酸γ-半醛完成一次两碳单元的延伸生成2-乙酰氨基-5，7-二羟基-6-酮庚酸。aziC7编码的转氨酶对其进行转氨反应后，在aziC8编码的脱氢酶催化下形成α，β不饱和庚酸，此不饱和酸在6-氨基的亲核进攻下发生分子内Michael加成反应生成四氢吡咯环，随后的进一步的修饰作用形成阿嗪霉素中的氮杂双环结构，在此过程中还伴随着aziC9编码的P450羟化酶催化四氢吡咯环C4位的羟化反应。最后在aziC10编码的脱乙酰基酶的催化作用下脱去氨基上的乙酰基，从而生成阿嗪霉素中的氮杂双环[3.1.0]己烷的螺环结构单元。

6.阿嗪霉素骨架合成及后修饰反应

阿嗪霉素生物合成基因簇中有五个基因(aziA1-A5)，它们负责编码阿嗪霉素骨架组装的相关酶(AziA1-A5)。AziA1包括两个功能域(AL-PCP)，其中AL域负责将起始萘甲酸单元的活化并将其装载在PCP上。AziA3包含三个功能域(AL-KR-PCP)，其中的AL与一些α-酮酸腺苷化域同源，它负责将α-酮异戊酸活化并将其装载在对应的PCP上，KR结构域对酮基进行还原，生成第一个延伸单元α-羟基异戊酰-PCP。AziA2包含三个功能域(C-PCP-C)，它负责催化α-羟基异戊酰-PCP与起始单元的缩合。AziA4与AziA5则是两个典型的NRPS，它们分别含有三个功能域(C-A-PCP)和四个功能域(C-A-PCP-Re)。AziA5中的A与很多负责苏氨酸腺苷化的功能域同源，它负责苏氨酸的活化与装载，AziA4的A则负责特殊氮杂双环氨基酸的活化与装载。这两个氨基酸延伸单元在各自对应的C功能域催化下与上游的酰基发生缩合完成阿嗪霉素骨架的组装，最后在AziA5的Re功能域的作用下将组装好的酰基-PCP还原，以醛基的形式从NRPS上释放下来。释放的化合物进一步在AziD1，AziD2和AziD3的催化作用下分别发生乙酰化、氧化和环氧化反应最终形成完整的阿嗪霉素分子。整个过程如图3D所示。

7.阿嗪霉素生物合成基因簇的应用一生物合成基因簇中的基因可以在异源宿主S.albus中进行异源表达：

在克隆、分析了完整的阿嗪霉素生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对阿嗪霉素萘甲酸结构单元的生物合成机制进行了初步探讨。将推测的萘甲酸结构单元的合成基因—重复使用的I型PKS aziB基因置于ErmE^*启动子下于S.albus中进行异源表达，得到的突变株经发酵、HPLC和LC-MS分析，显示aziB导入的突变株可产生5-甲基萘甲酸(图4II)。将我们推测的两个萘甲酸修饰酶AziB1和AziB2一起导入S.albus，产生了预期的3-甲氧基-5-甲基萘甲酸(图4IV)，证实了我们对阿嗪霉素萘甲酸结构单元生物合成途径的推测。同时也证实阿嗪霉素生物合成基因簇中的基因可以在异源宿主S.albus中进行异源表达。

以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

                     实施例1

阿嗪霉素产生菌链霉菌Streptomyces sahachiroi NRRL2485总DNA的提取：

将100μL 1×10⁸ S.lavendulae 314孢子悬液接种到3mL TSB液体培养基中，30℃，230rpm培养约24hr后达到对数生长期后期，取2mL接种到50mL TSB(含10mM氯化镁，0.1％甘氨酸)，30℃，250rpm培养约23hr后达到稳定生长期前期，呈乳黄色浑浊，将菌液4℃，3500rpm，离心15min收集菌丝，用裂解液洗涤，收集淡乳黄色菌丝0.5mL。向1mL菌丝中加入10mL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)共四管，涡旋至均一，37℃水浴15mim。加入0.1mL蛋白酶K(10mg/mL，用裂解液新鲜配制)，1mL 10％SDS，混匀后迅速放入70℃水浴15mim，呈澄清。置冰上冷却，加入2.5mL 5M KAc，冰上冷却15min。加入10mL饱和酚，混匀，10mL氯仿，混匀，12000rpm，4℃离心20min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加等量的CHCl₃-异戊醇(24∶1)抽提，12000rpm，4℃离心10min。用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加2倍的无水乙醇，混匀，有大团的DNA出现。将其钩出置于新的离心管，加5mL70％乙醇洗涤，将液体倾出，用枪吸净，加5mL TE溶解，加RNase A使终浓度为50μg/mL，37℃温育0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次，CHCl₃-异戊醇抽提两次，向水相中加入0.1体积的3M NaAc，2体积的无水乙醇，轻轻的混合充分，有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管(每管中有1mL 70％乙醇用于洗涤)，将液体吸出，再加1mL无水乙醇洗涤，吸出乙醇，超净台中吹干，溶于适当体积的TE(pH 8.0)中。

                        实施例2

阿嗪霉素产生菌链霉菌Streptomyces sahachiroi NRRL2485遗传转移系统的建立：

培养含有适当质粒的E.coli S17-1至OD₆₀₀ 0.3-0.4，20mL LB培养液中的细菌细胞离心收集，用等体积的LB洗两次，重悬于2mL LB中，作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于-80℃的Streptomyces sahachiroi NRRL2485的20％甘油孢子悬液500μL，用等体积的TES缓冲液(50mM TES Na，pH 8.0)洗两次，重悬于等体积的TES缓冲液，50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB培养基，37℃温育2-5hr。离心重悬于0.5-1mL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mMMgCl₂的平板上，30℃温浴20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖3mL含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和相应抗生素的LB软琼脂或1mL无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。

由于Streptomyces sahachiroi NRRL2485对硫链丝菌肽，阿泊拉霉素和红霉素都敏感，最后确定遗传转移所用抗生素的浓度：硫链丝菌肽25μg/mL，阿泊拉霉素50μg/mL，红霉素50μg/mL。IWL-4(可溶性淀粉1.0％，K₂HPO₄ 0.1％，MgSO₄ 0.1％，NaCl 0.1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，CaCO₃ 0.2％，FeSO₄ 0.0001％，MnCl₂.6H₂O 0.0001％，ZnSO₄ 0.0001％，酵母提取物0.05％，胰化蛋白胨0.1％，琼脂2.0％，pH 7.2)培养基最好，接合转移效率最高。在IWL-4培养基上，无论是在链霉菌中可以自主复制的质粒pKC1139，pHZ1358，还是位点特异性整合的质粒pSET152都可以得到相应的接合子。

                      实施例3

阿嗪霉素产生菌链霉菌Streptomyces sahachiroi NRRL2485基因组文库的构建：

首先通过一系列的稀释实验来确定Sau 3AI的用量，在此基础上大量酶切得到的DNA片段略大于40kb，脱磷。pOJ446先用Hpa I从两个cos序列中间切开并脱磷，然后再从多克隆位点处用BamH I切开，获得两个臂，与制备的40kb的DNA片段连接过夜。于冰上融化于-80℃取出地Promega Packagene exract，立即加入10ul连接产物，轻弹混匀，于室温(约22℃)放置3hr。加入445ul Phagebuffer，倒转混合；加入25ul氯仿终止反应，离心使氯仿沉于底部，4℃保存。将冻存于-80℃的菌株E.coli LE392涂布在LB培养基上复苏。调取单菌落接种于3ML LB培养基中(0.2％maltose10和mMMgSO4)，37℃，220rpm振荡培养过夜，转接1％到50ML LB培养基中(0.2％maltose10和mMMgSO4)，37℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.6-0.8。取5ul包装液，加入95ul phage buffer，稀释，再加入100ul E.Coli LE392(OD600＝0.67)，混匀，37℃，30min，涂于LB(含100ug/mlApramycin)平板上。37℃倒置培养过夜，测定噬菌斑形成单位(pfu)以估算文库的效价。取100ul包装液加入3.9ml phage buffer混匀，再加入4ml E.Coli LE392(OD600＝0.72)菌液，室温，30min，加入4ml LB，37℃，75min；2500rpm，10min，去上清，剩余1-3ml涂于LB(含100ug/ml Apramycin)平板上。37℃倒置培养过夜。

平板长有超过20,000个克隆，用LB刮下，加入甘油(终浓度18％)和Apramycin(终浓度50ug/ml)，分装，于-80℃保存。随机从平板中调取10个克隆，接种于LB培养基中培养，按大肠杆菌的质粒的碱法小量制备的方法抽提重组黏粒。用Bam HI鉴定，于0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，根据限制酶切的电泳分析图谱，我们判断出黏粒被酶切产生的片断大小，加和这些片断，从而推算出整个黏粒的大小，实验表明每个黏粒的插入片断约为40Kb左右。对于链霉菌而言，其染色体DNA的大小约为8Mb，如果插入片断为20kb的文库效价是2000-5000cfu，就足以代表它的整个基因组。根据以上实验，我们建立的文库效价超过为10000pfu/μg DNA，插入片断约为40kb左右，这表明我们建立的文库具有良好的质量，能够满足文库筛选的需要。

                    实施例4

阿嗪霉素产生菌链霉菌Streptomyces sahachiroi NRRL2485的发酵、产物分离纯化与鉴定：

取100ul Streptomyces sahachiroi NRRL2485孢子涂布在GYM(葡萄糖0.36％，酵母提取物0.4％，麦芽提取物1％，碳酸钙0.3％，琼脂2％，自来水，pH 6.8)平板上，30℃培养七天后，用接种一块(约1cm²)长满孢子的琼脂块接种到75％PS5+培养基(Pharmamedia 0.5％，可溶性淀粉0.5％，葡萄糖0.2％，Casein acid hydrolysate 0.5％，硫酸铵0.2％，赖氨酸0.05％，鸟氨酸0.05％，甘氨酸0.05％，pH7.0)中，24小时后，转接5ml到100mL(500mL锥形瓶)75％PS5+培养基。。转接15ml到100mL(500mL锥形瓶)25％PS5+培养基，30℃，250rpm培养72小时。离心收集上清，将二氯甲烷萃取两次，有机相用无水硫酸镁干燥，真空旋干后于-80℃保存。100ml发酵产物溶于100ul甲醇，取20μL经HPLC检测。

HPLC分析：

UV＝218nm；柱子：Aglient Rp18column，4.6×250mm；流动相条件：V＝1mL/min；A＝H₂O，B＝CH₃CN

时间/min	0	10	35	37	40
						B/％	20	20	80	20	20

                    实施例5

PCR克隆阿嗪霉素的生物合成基因：

PCR体系包含：DMSO(8％，v/v)，MgCl₂(25mM)，dNTP(2.5mM)，兼并性引物(40mM)，Taq DNA聚合酶(2.5u)及适量模板Streptomyces sahachiroiNRRL2485总DNA。首先95℃，3min，1轮；然后94℃，1min，68℃，1min，72℃，2min，5轮；94℃，1min，65℃，1min，72℃，2min，30轮；最后72℃，10min，1轮。PCR结束后，1％琼脂糖电泳检查结果。低熔点胶回收预期大小的DNA片段，与pGEM T Easy vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含有氨苄青霉素，IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的LB平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落过夜培养，抽提质粒，EcoR I酶切鉴定是否含有预期大小的DNA插入片段。插入有预期大小DNA片段的质粒测序。

                    实施例6

核酸分子杂交：

1)DIG DNA标记：将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15μL，沸水浴中加热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2μL引物混合物，2μLdNTP混合物，1μL酶，混合均匀后，37℃水浴约16小时。加入0.8μL 0.8MEDTA(pH8.0)以终止反应，加入2.5μL 4M LiCl混合均匀，再加入75μL预冷的无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于-80℃沉降40分钟。4℃，12000rpm离心20分钟收集DNA，用预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后重新溶于50μLTE((pH 8.0)中。

2)DIG DNA探针标记后的质量检测：稀释标记的DNA探针，至以下六个梯度，1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。稀释标记的对照DNA至浓度分别为以下浓度1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。分别取1μL上述梯度的DNA样品点在杂交用的尼龙膜上，根据7)所述步骤进行显色反应，对比标记的DNA探针和DIG标记的对照DNA的显色强度以决定标记的DNA探针浓度。

3)菌落杂交(文库筛选)的膜转移：将保存于-80℃的基因文库稍融，取50μL，用450μL LB稀释得到10^-1的稀释倍数，倍比稀释得到10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6。300μL涂平板(15cm×15cm，平板为LB/50μg/mL卡那霉素)。选取合适的比例，使每块平板约1200-1500个克隆。照选定的比例均匀涂布四块平板，37℃培养过夜。根据平板的大小剪取尼龙膜，小心地覆盖于平板表面不要产生气泡，做好位置标记，1分钟后取下尼龙膜置于干燥滤纸上，干燥10分钟直至菌落结合在尼龙膜上。原始的平板置于培养箱中4-5hr，使克隆重新生长作为原平板。将尼龙膜置于变性液(0.25M NaOH，1.5M NaCl)饱和的滤纸上15分钟(不要浸过膜)，转移至中和液(1.0M Tris.HCl，1.5M NaCl，pH 7.5)饱和的滤纸上5分钟。转移至2×SSC(20×SSC储备液(L^-1)：NaCl，175.3g，柠檬酸钠，88.2g，pH＝7.0)饱和的滤纸上自然风干。取下尼龙膜置于烘箱中，120℃固定45分钟。常温下于3×SSC/0.1％SDS溶液中振荡洗涤3小时，以除去细胞碎片。

4)Southern杂交的膜转移：DNA样品在适当浓度的琼脂糖凝胶上电泳至适当距离，做好标记。浸泡于400mL 0.25M HCl中脱嘌呤20分钟，使溴酚蓝变黄，用去离子水洗数次。室温下浸入碱性缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)15分钟并轻轻振荡。换液一次继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻振荡，去离子水洗三次。取一张每边都比凝胶大1mm的尼龙膜，用去离子水完全浸湿，做好标记。采用向上毛细管转移方法，用10×SSC转移缓冲液转移8-24hr。用2×SSC略微洗膜，120℃烘烤30分钟。

5)预杂交和杂交：预热杂交液(20mL/100cm²)至杂交温度68℃，放入杂交尼龙膜，轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性5分钟，立即置于冰盐浴中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂交液(2.5mL/100cm²)混合均匀。去除预杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交液加入，轻轻振荡保持杂交温度64℃或68℃约16小时。

6)杂交后严紧洗脱：室温下用2×SSC/0.1％SDS漂洗两次，每次5分钟。68℃，用0.1×SSC/0.1％SDS振荡漂洗两次，每次15分钟。

7)显色反应和检测：严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液(0.1M马来酸，0.15MNaCl，pH＝7.5，0.3％(v/v)Tween 20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲液(封闭试剂以10％的浓度溶于0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH＝7.5)中封闭30分钟，然后在抗体中浸泡30分钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH＝9.5)中平衡2-5分钟，最后将尼龙膜置于10mL新配制的显色溶液[NBT(nitroblue tetrazolium chloride)溶于70％DMF，浓度为70mg/mL，BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)溶于水，浓度为50mg/mL。用时10mL显色溶液中加45μL NBT，35μL BCIP]中，置于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。

                        实施例7

基因中断突变菌株的获得：

将获得的转化子接种到TSB液体培养基(Am 25μg/ml)中，30℃振荡约28hr。取出200μl涂布在ISP-4(Am 50μg/ml)平板，30℃培养6-8天，收孢子，保存于-80℃；取出10μl在ISP-24(Am 50μg/ml)平板画线，37℃培养，放置2-3天。挑37℃整合生长的单菌落，接种至液体培养基ISP-4(Am 25μg/ml)，37℃，振荡2-3天。取出涂布在ISP-4平板(Am 50μg/ml)，37℃整合2-3天，收孢子，保存于-80℃。

基因中断或基因置换所用载体为pOJ260或pKC1139，基因置换用红霉素抗性基因替代目标基因中间的DNA片段。构建好的质粒通过实施例2所述属间接合转移的方式导入Streptomyces sahachiroi NRRL2485中得到双交换突变体，所得突变体通过Southern杂交在基因型上加以证明。

                        实施例8

基因在S.albus中表达及发酵产物分析：

将目标基因和红霉素启动子克隆到pTGV2载体。正确的质粒通过ET12567和S.Alus J1074的属间接合转移得到各突变体的异源表达菌株

将培养至对数生长期的细菌(约48hr)转接0.5％的菌液于R5A(蔗糖100g/l，硫酸钾0.25g/l，六水氯化镁10.12g/l，葡萄糖10g/l，Hy-case amino 0.1g/l，酵母提取物5g/l，Mops 21g/l，2ml R5 trace elements solution，调PH＝6.85，高压灭菌)的液体培养基中继续培养120hr，把所有的发酵物(包括菌体和菌液)的PH调至2-3，超声15min(10s/50s)；用滤纸滤去大部分菌体，用等体积的乙酸乙酯萃取两次，旋干，重旋于甲醇中。

HPLC分析：

UV＝218nm；柱子：Aglient Rp18 column，4.6×250mm；流动相条件：V＝1mL/min；A＝H2O(1‰TFA)，B＝CH3CN(1‰TFA)

时间/min	0	5	10	25	26	29	30
								B/％	10	10	20	70	95	95	10

以下根据本发明内容提供的基因和蛋白序列：

                氨基酸/核苷酸序列表：

                SEQUENCE LISTING

Claims (5)

1.一种抗肿瘤活性的抗生素—阿嗪霉素的萘甲酸结构单元合成基因，其特征在于，所述的基因选自下组：

1)I型聚酮合成酶基因，即aziB基因：

aziB位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列第38515-43854个碱基处，长度为5340个碱基对，编码I型聚酮合成酶，1779个氨基酸，氨基酸序列如SEQ IDNO：26所示；

2)萘环修饰酶基因，即aziB1基因和aziB2基因：

aziB1位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列第12587-13792个碱基处，长度为1206个碱基对，编码细胞色素P450氧化酶，401个氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO：7所示；

aziB2位于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列第11548-12585个碱基处，长度为1038个碱基对，编码O-甲基转移酶，345个氨基酸，氨基酸序列如SEQ IDNO：6所示。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤活性的抗生素—阿嗪霉素的萘甲酸结构单元合成基因所编码的编码蛋白，其特征在于，所述的编码蛋白选自下组：

1)aziB基因编码的I型聚酮合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示；

2)aziB1基因编码的细胞色素P450氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；和

3)aziB2基因编码的O-甲基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

3.如权利要求2所述的阿嗪霉素的萘甲酸结构单元生物合成基因的编码蛋白的用途，其特征在于，用于催化合成3-甲氧基-5-甲基萘甲酸。

4.如权利要求1所述的阿嗪霉素的萘甲酸结构单元生物合成基因的用途，所述的基因是aziB基因，其特征在于，所述的基因在Streptomyces albus J1074中进行异源表达产生5-甲基萘甲酸。

5.如权利要求1所述的阿嗪霉素的萘甲酸结构单元生物合成基因的用途，所述的基因是aziB、aziB1和aziB2基因，其特征在于，所述基因在Streptomyces albusJ1074中进行异源表达产生3-甲氧基-5-甲基萘甲酸。

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