CN100465277C

CN100465277C - 氯丝菌素的生物合成基因簇及其应用

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Publication number: CN100465277C
Application number: CNB2005100274568A
Authority: CN
Inventors: 刘�文; 唐功利; 贾新颖
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2005-07-01
Publication date: 2009-03-04
Anticipated expiration: 2025-07-01
Also published as: CN1730657A

Abstract

本发明涉及一种聚酮类抗生素-氯丝菌素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能及其应用。整个基因簇共包含35个基因：1)6个聚酮合成酶基因chlA1，chlA2，chlA3，chlA4，chlA5，chlA6；2)6个2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸合成酶基因chlB1，chlB2，chlB3，chlB4，chlB5，chlB6；3)7个脱氧糖生物合成基因chlC1，chlC2，chlC3，chlC4，chlC5，chlC6，chlC7；4)4个3-碳单位生物合成基因chlD1，chlD2，chlD3，chlD4；5)3个大环骨架后修饰基因chlE1，chlE2，chlE3；6)3个调节和抗性基因chlF1，chlF2，chlG；7)及6个功能不确定的基因chlH，chlI，chlJ，chlK，chlL，chlM。通过对上述生物合成基因的遗传改造可以得到氯丝菌素的结构类似物。本发明所提供的基因及其蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

Description

氯丝菌素的生物合成基因簇及其应用

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及抗生素氯丝菌素(Chlorothricin)的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。

技术背景：

氯丝菌素(Chlorothricin)家族是聚酮类天然产物中非常有特色的一类，它们中的绝大多数是由放线菌产生的抗生素，对革蓝氏阳性菌具有良好的抗菌活性。其中代表性分子氯丝菌素是一个新型的大环内酯类抗生素(如图1所示)，首次分离自抗生链霉菌Tü 99(Streptomyces antibioticus，DSMZ40725)[Helv.Chim.Acta.(1969)52，127-142]，是该家族中唯一对丙酮酸羧化酶催化的大气CO₂固定具有抑制作用的抗生素[Eur.J.Biochem.(1973)39，591-600]。后来的研究发现，氯丝菌素及其衍生物可以抑制甲羟戊酸途径而抑制胆固醇的生物合成[J.Antibiot.(1991)44，207-212]。

氯丝菌素具有独特的化学结构(如图1所示)。分子大环骨架所具有的[6，6]并环和[6，5]螺环及螺-4-羟基乙酰乙酸内酯(spirotetronate)结构是该家族化合物的典型特征。除此而外，氯丝菌素还含有脱氧鼠李二糖的边链，且一个糖基被2-甲氧基-5-氯-6-甲基水扬酸所修饰。氯丝菌素大环内酯骨架最初是通过光谱分析和化学降解确定[Helv.Chim.Acta.(1972)55，2071-2094]，进一步经X射线晶体衍射分析确证[Helv.Chim.Acta.(1974)55，2094-2102]。之后，随着该家族其他化合物的发现，这一独特的化学结构吸引了许多有机化学家从事其化学合成研究[J.Am.Chem.Soc.(1994)116，6457-6458；J.Am.Chem.Soc.(1998)120，7411-7419]。然而对该家族化合物的生物合成研究多年来一直停留在同位素标记前体喂养的基础上。前体标记实验表明：氯丝菌素大环内酯骨架来源于10个乙酸单位、2个丙酸单位和1分子甘油，脱氧鼠李二糖边链来源于葡萄糖，6-甲基水扬酸来源于4个乙酸单位，甲基来源于甲硫氨酸[Biochemistry(1978)17，556-560；Biochemistry(1981)20，919-924；J.Antibiot.(1986)39，1123-1234]。

氯丝菌素大环核心骨架后修饰的不同及糖基边链的不同赋予该家族化合物不同的生物活性。因此自然界为人们提供了一个极好的天然组合生物合成的模型，对该家族天然产物的生物合成研究，从基因及酶催化两个层次进行探讨可以帮助人们理解自然界是如何合成如此众多的结构复杂而且类似的化合物。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上，人们可以利用组合生物合成的方法，生产很多自然界不存在的结构类似物，为新活性“非天然”天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。

发明内容：

本发明涉及一种具有独特聚酮结构的抗生素—氯丝菌素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能及其应用。本发明中整个氯丝菌素的生物合成基因簇共35个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中6个(chlA1，chlA2，chlA3，chlA4，chlA5，chlA6)用于编码I型聚酮合成酶(PKS)，共包含12个模块，59个功能域，负责催化氯丝菌素大环骨架部分聚酮链的生物合成；4个基因(chlD1，chlD2，chlD3，chlD4)编码的蛋白负责3-碳单位的生物合成，并进一步与聚酮链缩合、环化形成大环骨架的[6，6]并环和[6，5]螺环结构；6个(chlB1，chlB2，chlB3，chlB4，chlB5，chlB6)用于编码重复使用的PKS及氯化等修饰酶，负责催化2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸的生物合成；7个基因(chlC1，chlC2，chlC3，chlC4，chlC5，chlC6，chlC7)编码的蛋白负责脱氧鼠李糖的生物合成，并进一步与大环骨架缩合；3个基因(chlE1，chlE2，chlE3)编码氧化酶，催化氯丝菌素大环骨架的后修饰；还包括2个调节基因(chlF1，chlF2)和1个抗性基因(chlG)及6个功能不十分确定的基因(chlH，chlI，chlJ，chlK，chlL，chlM)。

本发明还提供了一个编码糖基转移酶的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列组成，命名为chlC7，其基因的核苷酸序列位于序列1中第5169-3934碱基处。

本发明还提供了一个编码重复使用的、包括KS-AT-KR-DH-ACP聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组成，命名为chlB1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第10470-5200碱基处。

本发明还提供了一个编码卤化酶的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列组成，命名为chlB4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第11893-10544碱基处。

本发明还提供了一个编码独立存在的酰基载体蛋白的核苷酸序列，由序列5中的氨基酸序列组成，命名为chlB2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第12179-11913碱基处。

本发明还提供了一个编码酮乙酰基-酰基载体蛋白合成酶/缩合酶的核苷酸序列，由序列6中的氨基酸序列组成，命名为chlB3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第13289-12246碱基处。

本发明还提供了一个编码未知功能蛋白的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序列组成，命名为chlH，其基因的核苷酸序列位于序列1中第13750-13337碱基处。

本发明还提供了一个编码氧-甲基转移酶的核苷酸序列，由序列8中的氨基酸序列组成，命名为chlB5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第13782-14498碱基处。

本发明还提供了一个编码酮乙酰基-酰基载体蛋白合成酶/缩合酶的核苷酸序列，由序列9中的氨基酸序列组成，命名为chlB6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第14736-15794碱基处。

本发明还提供了一个编码4-酮基还原酶的核苷酸序列，由序列10中的氨基酸序列组成，命名为chlC5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16608-15865碱基处。

本发明还提供了一个编码3-酮基还原酶的核苷酸序列，由序列11中的氨基酸序列组成，命名为chlC4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第17666-16671碱基处。

本发明还提供了一个编码2，3-脱水酶的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组成，命名为chlC3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第19014-17698碱基处。

本发明还提供了一个编码羰基转移酶的藕联蛋白的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为chlI，其基因的核苷酸序列位于序列1中第19374-19162碱基处。

本发明还提供了一个编码羰基转移酶的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为chlJ，其基因的核苷酸序列位于序列1中第21002-19395碱基处。

本发明还提供了一个编码TetR家族转录调节因子的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为chlF1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第21139-21747碱基处。

本发明还提供了一个编码泵蛋白的核苷酸序列，由序列16中的氨基酸序列组成，命名为chlG，其基因的核苷酸序列位于序列1中第21904-23370碱基处。

本发明还提供了一个编码双组份反馈调节因子的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命名为chlF2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第24370-23585碱基处。

本发明还提供了一个编码II型硫酯酶的核苷酸序列，由序列18中的氨基酸序列组成，命名为chlK，其基因的核苷酸序列位于序列1中第25179-24379碱基处。

本发明还提供了一个编码dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶的核苷酸序列，由序列19中的氨基酸序列组成，命名为chlC2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第27064-26081碱基处。

本发明还提供了一个编码dNDP-D-葡萄糖合成酶的核苷酸序列，由序列20中的氨基酸序列组成，命名为chlC1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第28145-27078碱基处。

本发明还提供了一个编码糖基转移酶的核苷酸序列，由序列21中的氨基酸序列组成，命名为chlC6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第29477-28263碱基处。

本发明还提供了一个编码黄素依赖的氧化酶的核苷酸序列，由序列22中的氨基酸序列组成，命名为chlE1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第29807-31357碱基处。

本发明还提供了一个编码包括KS^QL，ATL，ACPL，KS1，AT1，DH1，KR1，ACP1，KS2，AT2，DH2，KR2，ACP2聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列23中的氨基酸序列组成，命名为chlA1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第31481-45580碱基处。

本发明还提供了一个编码包括KS3，AT3，DH3，KR3，ACP3，KS4，AT4，DH4，ER4，KR4，ACP4聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列24中的氨基酸序列组成，命名为chlA2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第45580-57447碱基处。

本发明还提供了一个编码细胞色素P-450氧化酶的核苷酸序列，由序列25中的氨基酸序列组成，命名为chlE2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第57522-58718碱基处。

本发明还提供了一个编码包括KS5，AT5，DH5，ER5，KR5，ACP5，KS6，AT6，DH6，KR6，ACP6，KS7，AT7，DH7，KR7，ACP7聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列26中的氨基酸序列组成，命名为chlA3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第58888-76044碱基处。

本发明还提供了一个编码包括KS8，AT8，DH^*8，KR8，ACP8聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列27中的氨基酸序列组成，命名为chlA4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第76074-81635碱基处。

本发明还提供了一个编码包括KS9，AT9，DH9，ER9，KR9，ACP9，KS10，AT10，DH10，KR10，ACP10聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列28中的氨基酸序列组成，命名为chlA5，其基因的核苷酸序列位于序列1中第81667-93477碱基处。

本发明还提供了一个编码包括KS11，AT11，ACP11聚酮合成酶结构域的核苷酸序列，由序列29中的氨基酸序列组成，命名为chlA6，其基因的核苷酸序列位于序列1中第93554-98302碱基处。

本发明还提供了一个编码黄素依赖的氧化酶的核苷酸序列，由序列30中的氨基酸序列组成，命名为chlE3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第98302-99798碱基处。

本发明还提供了一个编码核糖体蛋白L15P的核苷酸序列，由序列31中的氨基酸序列组成，命名为chlL，其基因的核苷酸序列位于序列1中第100441-99866碱基处。

本发明还提供了一个编码3-氧乙酰基载体蛋白合成酶III的核苷酸序列，由序列32中的氨基酸序列组成，命名为chlM，其基因的核苷酸序列位于序列1中第100612-101739碱基处。

本发明还提供了一个编码甲氧基-丙二酰基载体蛋白合成酶的核苷酸序列，由序列33中的氨基酸序列组成，命名为chlD1，其基因的核苷酸序列位于序列1中第101743-103698碱基处。

本发明还提供了一个编码独立存在的酰基载体蛋白的核苷酸序列，由序列34中的氨基酸序列组成，命名为chlD2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第103695-103922碱基处。

本发明还提供了一个编码丙酮酸/2-氧代戊二酸脱氢酶的核苷酸序列，由序列35中的氨基酸序列组成，命名为chlD3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第103919-104734碱基处。

本发明还提供了一个编码水解酶/乙酰基转移酶的核苷酸序列，由序列36中的氨基酸序列组成，命名为chlD4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第104713-105801碱基处。

序列1的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应的DNA或使用其他合适的技术得到。本发明提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重组DNA载体的途径。

本发明还提供了产生氯丝菌素生物合成基因被中断或加倍的微生物体的途径，至少其中之一的基因包含有序列1中的核苷酸序列。

本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针以Southern杂交等方法从其他生物体中得到与氯丝菌素生物合成基因相似的基因。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从抗生链霉菌Tü99(DSM 40725)基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有抗生链霉菌基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化(DNA shuffling)，或通过紫外线或化学试剂诱变等。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。

本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。

包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。

包含本发明所提供的核苷酸序列编码的蛋白可以催化合成2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸、脱氧糖及氯丝菌素聚酮大环骨架，进一步催化合成抗生素氯丝菌素。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组载体以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断氯丝菌素生物合成的一个或几个步骤而得到新的氯丝菌素结构类似物或前体。包含DNA片段或基因可以用来提高氯丝菌素或其衍生物的产量，本发明提供了在基因工程微生物中提高产量的途径。

包含本发明所提供的聚酮合成酶可以通过缺失、插入或失活来自于相同或不同的聚酮合成酶系统的一个或多个聚酮合成酶结构域、模块或基因而产生新的聚酮化合物。

包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的片段或基因可以用来构建聚酮合成酶库或聚酮合成酶衍生库或组合库。

本发明所提供的催化合成2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸的合成基因可用于合成水扬酸衍生物或氯丝菌素衍生物。

本发明所提供的3-碳单位的生物合成基因及其他相关基因与聚酮合成藕联可用于合成氯丝菌素家族独特的[6，5]螺环及螺-4-羟基乙酰乙酸内酯结构极其类似物。

本发明所提供的氯丝菌素大环骨架的后修饰基因提供了通过遗传修饰得到类似物的途径，所包含的催化大环内酯生成的氧化反应可有其他应用。

总之，本发明所提供的包含氯丝菌素生物合成相关的所有基因和蛋白信息可以帮助人们理解氯丝菌素家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和知识。本发明所提供的基因及其蛋白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。

附图说明：

图1：氯丝菌素的化学结构

图2：氯丝菌素生物合成基因簇的基因结构和限制性内切酶谱。(A)7个交叠的粘粒代表了抗生链霉菌基因组122 kb的DNA区域，B代表限制性内切酶BamHI，实体表示已被DNA测序的部分，Probe-P1～P4代表标记的探针部分；(B)氯丝菌素生物合成基因簇的基因组成。

图3：提出的氯丝菌素各组成单元的生物合成途径。(A)脱氧鼠李糖；(B)2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸；(C)3碳单位。

图4：提出的氯丝菌素大环骨架的生物合成途径及各单元组装成完整的氯丝菌素分子。

图5：抗生链霉菌发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析。(I)氯丝菌素及脱氯氯丝菌素标准品；(II)野生型抗生链霉菌DSM40725；(III)氯丝菌素生物合成基因簇之外的一个编码dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶的基因中断的突变株；(IV)探针P1区域PKS基因中断的突变株；(V)探针P2区域PKS基因中断的突变株；(VI)chlC7基因中断的突变株；(VII)chlD3基因中断的突变株；(VIII)chlD4基因中断的突变株。

图6：I型聚酮合成酶PKSchlA1-A6的功能分析。(A)酰基转移酶结构域AT保守区域的分析，星号表示决定底物特异性的保守氨基酸，框内表示活化甲基丙二酰辅酶A的AT；(B)脱水酶结构域DH保守区域的分析，星号表示保守的酸性氨基酸，框内表示模块8中的DH因保守氨基酸的突变可能失去功能。

图7：遗传改造抗生链霉菌中氯丝菌素的生物合成基因得到氯丝菌素机构类似物的HPLC分析。(A)野生型抗生链霉菌DSM40725；(B)chlB6基因中断的突变株，箭头代表产生的新化合物。

具体实施方式：

以下结合图1、图2、图3、图4、图5、图6及图7对本发明进一步详细说明。

1.克隆、分析氯丝菌素的生物合成基因簇：

前人的研究发现，许多脱氧糖的生物合成途径中均包含dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶催化的反应。采用PCR和Southern相结合的方法，韩国学者从氯丝菌素的产生菌抗生链霉菌Tü99中克隆了至少3个编码dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶的基因片段[J.Biochem.Mol.Biol.(1996)29，183-191]，其中的一个因与PKS基因藕联被认为是与氯丝菌素的脱氧糖生物合成相关[J.Microbiol.Biotechnol.(1999)9，206-212]。因此首先根据该发表的序列设计PCR引物(5’-GAT GAA TTC ATGAAC CTC CTC GTC ACC-3’和5’-CGG AAG CTT TCA GCC ATCGCG-3’)，PCR获得该dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶基因片段1kb，经顺序分析进一步确证。然而该基因中断的突变菌株仍然产生与野生型相当的氯丝菌素(图5，III)排除了该基因参与氯丝菌素的生物合成。

既然前体标记实验证明了氯丝菌素大环内酯骨架是由聚酮合成酶PKS催化合成的，本发明采用兼并性引物(5’-GGC CGG GCC TTC CAG GAC SNS GGSNTS RAC TC-3’和5’-CGC CAG GTG CAT CGC CAC SAR SGA SGA SGARCA-3’)PCR克隆编码PKS基因部分序列的方法得到750bp的PCR产物，克隆入pGEM-Teasy载体，经限制性内切酶分组，DNA顺序分析表明与已知的PKS基因有很高的同源性。进一步经基因中断发现相应基因失活的突变菌株完全丧失了产生氯丝菌素的能力(图5，IV and V)，证明克隆了与氯丝菌素生物合成相关的PKS基因片段。于是将它们用地高辛标记为探针P1和P2从抗生链霉菌的基因组文库约6000个克隆中筛选，分离得到的粘粒涵盖了染色体约70kb的区域。在此基础上经染色体步移获得了7个交叠的粘粒pTL1501，pTL1502，pTL1503，pTL1504，pTL1505，pTL1506和pTL1507涵盖了染色体约122kb的区域(图2A)。DNA顺序分析了107,069bp的染色体区域，GC含量71.8％。生物信息学分析包含了40个开放读码框(图2B)。

2.氯丝菌素的生物合成基因簇边界的确定：

根据基因编码蛋白的功能分析，氯丝菌素的生物合成基因簇被确定为从基因chlC7到chlD4(图2B)，涵盖染色体101.8kb的区域，包含35个开放读码框。基因中断及基因置换进一步确定氯丝菌素的生物合成基因簇的边界：失活chlC7，chlB6，chlD3或chlD4完全抑制了氯丝菌素的产生(图5)，而失活上游或下游之外的其他基因对氯丝菌素的产生没有影响。整个氯丝菌素的生物合成基因簇共35个基因，其中6个(chlA1，chlA2，chlA3，chlA4，chlA5，chlA6)用于编码I型聚酮合成酶(PKS)，共包含12个模块，负责催化氯丝菌素大环骨架部分聚酮链的生物合成；4个基因(chlD1，chlD2，chlD3，chlD4)编码的蛋白负责3-碳单位的生物合成，并进一步与聚酮链缩合、环化形成大环骨架的[6，6]并环和[6，5]螺环结构；6个(chlB1，chlB2，chlB3，chlB4，chlB5，chlB6)用于编码重复使用的PKS及氯化等修饰酶，负责催化2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸的生物合成；7个基因(chlC1，chlC2，chlC3，chlC4，chlC5，chlC6，chlC7)编码的蛋白负责脱氧鼠李糖的生物合成，并进一步与大环骨架缩合；3个基因(chlE1，chlE2，chlE3)编码氧化酶，催化氯丝菌素大环骨架的后修饰；还包括2个调节基因(chlF1，chlF2)和1个抗性基因(chlG)及6个功能不十分确定的基因(chlH，chlI，chlJ，chlK，chlL，chlM)。

3.脱氧糖的生物合成：

脱氧糖的生物合成如图3A所示：chlC1编码的dNDP-D-葡萄糖合成酶催化dNDP-D-葡萄糖的合成，然后在chlC2编码的dNDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶的催化下发生6位脱水，接着在chlC3编码的2，3-脱水酶的催化下发生2位脱水，然后在chlC4编码的3-酮基还原酶的作用下3位酮基还原为羟基，接着在chlC5编码的4-酮基还原酶作用下发生4位酮基还原，从而完成氯丝菌素中脱氧糖单元的生物合成。

4.2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸的生物合成：

2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸合成酶的生物合成如图3B所示：chlB1编码的重复使用的聚酮合成酶(包括KS，AT，DH，KR，ACP结构域)催化1分子乙酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A缩合，脱除3分子水生成6-甲基水扬酸，然后经chlB3编码的酮乙酰基-酰基载体蛋白合成酶/缩合酶活化，连接到chlB2编码的酰基载体蛋白上，接着在chlB编码的氧-甲基转移酶催化下发生羟基甲基化修饰，进一步在chlB4编码的卤化酶作用下发生氯化，从而完成氯丝菌素中2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸单元的生物合成。

5.氯丝菌素聚酮大环骨架的合成及各单元组装成完整的氯丝菌素分子：

氯丝菌素大环骨架聚酮链部分是由典型的I型聚酮合成酶PKS催化合成的(图4)。其中chlA1编码的PKS包含三个模块，起始模块包含KS^QL，ATL，ACPL三个结构域，KS^QL中因KS催化缩合关键的活性位点由半胱氨酸C突变为谷氨酰胺Q而仅具有脱羧活性。延伸模块1包含KS1，AT1，DH1，KR1，ACP1结构域，延伸模块2包含KS2，AT2，DH2，KR2，ACP2结构域。chlA2编码的PKS包含两个延伸模块，延伸模块3包含KS3，AT3，DH3，KR3，ACP3结构域，延伸模块4包含KS4，AT4，DH4，ER4，KR4，ACP4结构域。chlA3编码的PKS包含延伸模块5，6，7，包含KS5，AT5，DH5，ER5，KR5，ACP5，KS6，AT6，DH6，KR6，ACP6，KS7，AT7，DH7，KR7，ACP7结构域。chlA4编码PKS只包含一个延伸模块8，由KS8，AT8，DH^*8，KR8，ACP8结构域组成，其中的DH结构域因关键的保守氨基酸突变而不具有活性(图6B)。chlA5编码的PKS包含延伸模块9和10，由结构域KS9，AT9，DH9，ER9，KR9，ACP9，KS10，AT10，DH10，KR10，ACP10构成。chlA6编码的PKS含最后一个模块11，由KS11，AT11，ACP11结构域组成。分析所有模块中的AT结构域发现只有模块1和模块10中的AT识别甲基丙二酰辅酶A，而其他模块的AT均识别丙二酰辅酶A为底物(图6A)。

在上述PKS的催化下2分子甲基丙二酰辅酶A与10分子丙二酰辅酶A依此经活化、脱羧缩合生成聚酮长链；同时由甘油代谢的中间体经chlD1编码的甲氧基-丙二酰基载体蛋白合成酶活化，连接到chlD2编码的酰基载体蛋白上，然后经chlD3编码的丙酮酸/2-氧代戊二酸脱氢酶的催化脱水生成3碳单位(图3C)，在chlD4编码的水解酶/乙酰基转移酶的催化下将聚酮长链由模块11的ACP上释放，在其他酶催化下发生两次分子内[4+2]切酶Diels-Alder反应生成前氯丝菌素糖苷单元(图4)。然后依此在chlE1编码的黄素依赖的氧化酶，chlE2编码的细胞色素P-450氧化酶和chlE3编码的黄素依赖的氧化酶催化下发生甲基到羧基的氧化和Baeyer-Villiger氧化成酯生成氯丝菌素大环内酯骨架。再由chlC6和chlC7编码的糖基转移酶将2个脱氧糖连接大大环内酯上，chlB6编码的酮乙酰基-酰基载体蛋白合成酶/缩合酶将2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸转移到糖基上，从而完成整个氯丝菌素的生物合成(图4)。

6.氯丝菌素生物合成基因簇的应用一对生物合成基因簇的遗传修饰获得结构类似物：

在克隆、分析了完整氯丝菌素生物合成基因簇，研究了各基因编码蛋白可能的功能的基础上，本发明对氯丝菌素的生物合成机制进行了初步探讨，这有助于理解氯丝菌素的生物合成机制，同时也为进一步通过对生物合成基因簇进行遗传修饰获得氯丝菌素机构类似物提供了可能。如本发明通过对chlB6(编码酮乙酰基-酰基载体蛋白合成酶/缩合酶)基因进行基因中断获得的突变菌株不再产生氯丝菌素，但可以产生几个新的氯丝菌素机构类似物(图7)。

以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本发明，仅用作说明而不限制本发明的应用范围。

实施例1

氯丝菌素产生菌抗生链霉菌DSM 40725总DNA的提取：

吸取100μl-80℃冻存的抗生链霉菌孢子悬液接种到含有3mlTSB(30g/LTryptone Soya Broth)培养基的试管中，30℃，振荡培养约24小时，接种5％至50mL TSB培养基中，30℃，振荡培养约18个小时，镜检，3500rpm离心收集菌体，用裂解洗两次，存于-20℃供提取基因组DNA用。向收集的菌丝中加入10ml裂解洗(含溶菌酶5mg/ml)，涡旋至均一，37℃温浴20分钟，加入0.1ml蛋白酶K(4mg/ml)，1ml 10％SDS，混匀迅速放入70℃水浴15分钟，待溶液澄清。置于冰上冷却，加入2.5ml 5M KAc，冰上冷却15分钟。加入10ml饱和酚，混匀(蛋白较多尽量混匀)，10ml氯仿，混匀，12000-15000rpm，4℃离心20分钟。用破口的枪头将水相吸出转移至新的离心管，加等当量的氯仿/异戊醇(24：1)抽提，12000rpm，4℃离心10分钟，用破口的枪头将水相吸出置于新的离心管，加入0.1体积的3M NaAC，2倍体积的乙醇，混匀，有大团的DNA出现。将其勾出置于新的离心管，加5ml 70％乙醇洗涤，将液体倾出，用枪吸净，加5mL TE溶解，加32μl RNA酶(终浓度为50μg/ml)，37℃温浴0.5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次，氯仿/异戊醇抽提两次，向水相中加入0.1体积的3M NaAc，2体积的无水乙醇，轻轻的混合充分，有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管(每管中有1ml 70％乙醇)，将乙醇吸出，再加1ml无水乙醇洗涤，吸出，超净台中吹干，溶于1ml TE(50mL菌液收集的菌丝体提出的总DNA溶于1mL TE缓冲液)中。

实施例2

氯丝菌素产生菌抗生链霉菌DSM 40725遗传转移系统的建立：

28—30℃，250rpm，YEME培养基(酵母提取物0.3％，蛋白胨0.5％，肉提取物0.3％，葡萄糖1.0％，蔗糖34％，MgCl₂.6H₂O 0.1％，pH＝7.0)振荡20—24hr至菌丝的对数生长期后期。3,000-4,000rpm离心10分钟收集菌丝。用15ml 10.3％的蔗糖洗两次，悬浮菌丝沉淀于5—8ml的溶菌酶溶液1-2mg(1-2mg加入P缓冲液：Tris 0.31％，CaCl₂·2H₂O 0.386％，MgCl₂·6H₂O 0.204％，蔗糖10.3％，葡萄糖0.1％，pH 7.6)，30℃温浴15—60分钟。每隔10—15分钟，用5ml的移液管吹吸三次。加等体积的P缓冲液，继续用5ml的移液管吹吸三次使原生质体从菌丝体上游离。过滤除去没有消化的菌丝体，≤2,000rpm离心10—15分钟收集原生质体。用10mLP缓冲液洗涤一次。悬浮于0.5-1ml的P缓冲液中，计数，分装后置于冰上，保存于—80℃冰箱中。

50μL的原生质体(10¹⁰/mL)，加入5μL的DNA，轻敲混匀，立即加入200μL的25％ PEG 1000(溶于P缓冲液)，用枪吹打四次使其充分混匀。在两块干的R₂YE平板上涂布，30℃培养14—20小时以后，加盖含有Apramycin 50μg/mL灭菌水，继续于30℃培养3—5天。

实施例3

氯丝菌素产生菌抗生链霉菌DSM 40725基因组文库的建立：

首先通过一系列的稀释实验来确定Sau 3AI的用量，在此基础上大量酶切得到的DNA片段略大于40kb，脱磷。SuperCosl先用Xba I从两个cos序列中间切开并脱磷，然后再从多克隆位点处用Bam HI切开，获得两个臂，与制备的40kb的DNA片段连接过夜。从-80℃冰箱中取出包装混合物置于干冰桶中，将包装混合物在指间迅速融化，在刚刚开始融化时加入4μL的连接产物，用枪混匀，22℃水浴2小时。加入500μL SM缓冲液[(L^-1)：5.8g NaCl，2.0g MgSO₄，50.0mL1M Tris.HCl(pH＝7.5)，5.0mL 2％(w/v)明胶]和50μL氯仿，轻轻混匀，离心机离心4秒，上下界面出现沉淀，转移上清至新管中，于4℃保存。将冻存于-80℃的菌株E.coli vcs257涂布在LB培养基上复苏。调取单克隆接种于50mL LB培养基中(蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl 1.0％，pH＝7.0；添加0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄)，37℃，220rpm振荡6.5小时，测得其OD₆₀₀＝0.83时，取用100μL的包装上清和100 OD₆₀₀＝0.83的菌液，轻弹管壁使其混匀，平行操作5份。22℃水浴30分钟，加入800μL的LB培养基，37℃水浴1.5小时，每15分钟倒转一次。每一份涂布一块大板，LB琼脂(Amp:100μg/mL)(15mm×15mm)，每一份用200μL的LB培养基涮洗，37℃培养18个小时。测定噬菌斑形成单位(pfu)以估算文库的校价。然后用LB培养基刮洗，加入氨苄西林和甘油，使氨苄西林的终浓度为50μg/mL，甘油的终浓度为18％。分装成1mL×12，0.5mL×48，025mL×24。保存于-80℃。

实施例4

氯丝菌素生物发酵、产物分离纯化与鉴定：

液体发酵：接种20％甘油保存的孢子到50ml培养基(大豆粉2％，甘露醇2％，CaCO₃ 0.2％，250ml锥形瓶)中，孢子终浓度是5.2×10⁶，235rpm，30℃培养。孢子复苏48—55小时后，按5％的量接种到发酵培养基(大豆粉2％，甘露醇2％，CaCO₃ 0.2％)中，240rpm，30℃培养。发酵72小时后，3800rpm，10分钟，4℃，离心收集菌丝。菌丝体用水洗两次，冷冻抽干，尽量除去水分。菌丝体悬浮于适量甲醇中，冰水浴中超声破菌(10秒/次，间隔50秒，共10分钟)。悬浮液用磁力搅拌器搅拌1小时，3800rpm，4℃离心10分钟分离上清后，菌丝体再用适量甲醇搅拌1小时，离心分离上清。合并两次所得上清，旋转蒸发浓缩到少量的体积。加入等体积的水后，pH值调到5。用乙酸乙酯萃取三次，3800rpm，4℃离心5分钟促使混合液分层。合并三次分离得到的有机相，无水MgSO₄干燥。过滤除去MgSO₄，旋转蒸发浓缩至干。用10—30ml甲醇溶解后加入两倍体积的石油醚脱脂(可以再重复一次)，取下相(若体积较大，可进行浓缩；如果有不溶物，可离心除去)。TLC纯化，展开液为乙酸乙酯：甲醇(1：1)，取Rf＝0.4的组分。将回收组分旋干后用HPLC、MS等方法检测，HPLC的条件如下：

固态发酵：在R₂YE^*(无蔗糖)20ml平板上涂抗生链霉菌DSM40725孢子100-200μl(～10⁹/ml)，30℃培养5天；将培养好的固体培养基冷冻抽干，捣碎后加50ml无水甲醇，超声破菌10分钟(超声10秒，间隔50秒)，搅拌器搅拌1小时；过滤(或离心)收集有机相，培养基用50ml无水甲醇再萃取一次，搅拌小时，收集并合并两次的有机相；旋蒸除去甲醇，得到深褐色残余物，用1ml无水甲醇溶解，离心后HPLC分析。

R₂YE^*培养基：酵母提取物0.4％，蛋白胨0.4％，蔗糖10.3％，葡萄糖1.0％，酪蛋白氨基酸0.01％，Tris 0.3％，K₂SO₄ 0.0025％，CaCl₂·2H₂O 0.735％，MgCl₂·6H₂O 1.102％，K₂HPO₄ 0.0025％，微量元素溶液0.2mL％，pH7.5[微量元素溶液(％)：ZnCl₂ 0.004，FeCl₃·6H₂O 0.002，CuCl₂·2H₂O 0.001，Na₂B₄O₇·10H₂O 0.001，MnCl₂·4H₂O 0.001]。

实施例5

基因中断突变菌株的获得：

将获得的转化子接种到液体培养基TSB(Am 25μg/ml)中，30℃振荡约28hr。取出200μl涂布在R₂YE^*(无蔗糖)(Am 50μg/ml)，30℃培养6-8天，收孢子，保存于-80℃；取出10μl在R₂YE(Am 50μg/ml)画线，37℃培养，放置2—3天。挑37℃整合生长的单菌落，接种至液体培养基TSB(Am 25μg/ml)，37℃，振荡2—3天。取出涂布在R₂YE(Am 50μg/ml)，37℃整合2-3天，收孢子，保存于-80℃。取出200μL涂布在R₂YE(Am 50μg/ml)，30℃放置2—5天，用于鉴定其生物活性。

实施例6

核酸分子杂交：

1)DIG DNA标记：将待标记的DNA用无菌水稀释至总体积15μL，沸水浴中加热变性10分钟，立即置于冰盐浴中冷却。接着加入2μL引物混合物，2μLdNTP混合物，1μL酶，混合均匀后，37℃水浴约16小时。加入0.8μL 0.8MEDTA(pH8.0)以终止反应，加入2.5μL 4M LiCl混合均匀，再加入75μL预冷的无水乙醇沉淀标记后的DNA，置于—80℃沉降40分钟。4℃，12000rpm离心20分钟收集DNA，用预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后重新溶于50μLTE((pH 8.0)中。

2)DIG DNA探针标记后的质量检测：稀释标记的DNA探针，至以下六个梯度，1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。稀释标记的对照DNA至浓度分别为以下浓度1μg/mL，100ng/mL，10ng/mL，1ng/mL，0.1ng/mL，0.01ng/mL。分别取1μL上述梯度的DNA样品点在杂交用的尼龙膜上，根据7)所述步骤进行显色反应，对比标记的DNA探针和DIG标记的对照DNA的显色强度以决定标记的DNA探针浓度。

3)菌落杂交(文库筛选)的膜转移：将保存于—80℃的基因文库稍融，取50μL，用450μL LB稀释得到10^-1的稀释倍数，倍比稀释得到10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6。300μL涂平板(15cm×15cm，平板为LB/50μg/mL卡那霉素)。选取合适的比例，使每块平板约1200—1500个克隆。照选定的比例均匀涂布四块平板，37℃培养过夜。根据平板的大小剪取尼龙膜，小心地覆盖于平板表面不要产生气泡，做好位置标记，1分钟后取下尼龙膜置于干燥滤纸上，干燥10分钟直至菌落结合在尼龙膜上。原始的平板置于培养箱中4—5hr，使克隆重新生长作为原平板。将尼龙膜置于变性液(0.25M NaOH，1.5M NaCl)饱和的滤纸上15分钟(不要浸过膜)，转移至中和液(1.0M Tris.HCl，1.5M NaCl，pH 7.5)饱和的滤纸上5分钟。转移至2×SSC(20xSSC储备液(L^-1)：NaCl，350.6g，柠檬酸钠，176.4g，pH＝7.0)饱和的滤纸上自然风干。取下尼龙膜置于烘箱中，120℃固定45分钟。常温下于3×SSC/0.1％ SDS溶液中振荡洗涤3小时，以除去细胞碎片。

4)Southern杂交的膜转移：DNA样品在适当浓度的琼脂糖凝胶上电泳至适当距离，做好标记。浸泡于400mL 0.25M HCl中脱嘌呤20分钟，使溴酚蓝变黄，用去离子水洗数次。室温下浸入碱性缓冲液(0.5M NaOH，1M NaCl)15分钟并轻轻振荡。换液一次继续浸泡凝胶20分钟，并轻轻振荡，去离子水洗三次。取一张每边都比凝胶大1mm的尼龙膜，用去离子水完全浸湿，做好标记。采用向上毛细管转移方法，用10×SSC转移缓冲液转移8—24hr。用2×SSC略微洗膜，120℃烘烤30分钟。

5)预杂交和杂交：预热杂交液(20mL/100cm²)至杂交温度68℃，放入杂交尼龙膜，轻轻振荡并保温30分钟。将DIG标记的DNA探针在沸水浴中变性5分钟，立即置于冰盐浴中冷却。冷却后，将DNA探针与合适体积的DIG杂交液(2.5mL/100cm²)混合均匀。去除预杂交液并立即把DNA探针/DIG杂交液加入，轻轻振荡保持杂交温度64℃或68℃约16小时。

6)杂交后严紧洗脱：室温下用2×SSC/0.1％SDS漂洗两次，每次5分钟。68℃，用0.1×SSC/0.1％ SDS振荡漂洗两次，每次15分钟。

7)显色反应和检测：严紧洗脱后的尼龙膜在洗涤缓冲液(0.1M马来酸，0.15MNaCl，pH＝7.5，0.3％(v/v)Tween20)中平衡1-5分钟，接着在封闭缓冲液(封闭试剂以10％的浓度溶于0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH＝7.5)中封闭30分钟，然后在抗体中浸泡30分钟。用洗涤缓冲液漂洗尼龙膜两次后，用检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH＝9.5)中平衡2-5分钟，最后将尼龙膜置于10mL新配制的显色溶液[NBT(nitroblue tetrazolium chloride)溶于70％ DMF，浓度为70mg/mL，BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)溶于水，浓度为50mg/mL。用时10mL显色溶液中加45μLNBT，35μL BCIP]中，置于黑暗中显色。显色合适后用去离子水漂洗以终止反应。

实施例7

氯丝菌素生物合成基因簇的应用一对生物合成基因的遗传修饰获得结构类似物：

在氯丝菌素生物合成基因簇中，chlB6编码酮乙酰基-酰基载体蛋白合成酶/缩合酶，该酶被推测与脱氧糖基边链的修饰有关，催化将2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸转移到糖基上的反应。该基因失活的突变菌株由于丧失了将2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸转移到糖基上的能力有可能产生脱2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸的氯丝菌素结构类似物。本发明首先通过亚克隆的方法获得含chlB6基因片段的重组质粒，经PvuII限制性内切酶酶切获得0.7kb的基因片断，连接入载体制粒pKC1139的EcoRV限制性内切酶多克隆位点，得到构建chlB6基因中断突变株的重组制粒。将该质粒以实施例2所示方法导入氯丝菌素的产生菌抗生链霉菌中，按实施例5所示方法获得chlB6基因中断的突变菌株，按实施例4所示方法发酵、提取产物，HPLC分析发现chlB6基因中断的突变菌株可以产生几个新的氯丝菌素机构类似物，HPLC—MS进一步分析发现其中产量最高的化合物与脱2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸的氯丝菌素具有相同的分子量。

以下根据本发明内容提供基因和蛋白序列

序列列表：

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院上海有机化学研究所

<120>氯丝菌素(Chlorothricin)生物合成基因簇

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>107069

<212>DNA

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>2

<211>411

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>3

<211>1756

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptormyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>4

<211>449

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

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<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

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<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>7

<211>137

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

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<210>8

<211>238

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

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<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>10

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<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

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<211>331

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

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<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

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<211>70

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

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<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

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<210>15

<211>202

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

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<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

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<211>261

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

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<211>266

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>19

<211>327

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>20

<211>355

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>21

<211>404

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>22

<211>516

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>23

<211>4699

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>24

<211>3955

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>25

<211>398

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>26

<211>5718

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>27

<211>1853

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>28

<211>3936

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>29

<211>1583

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>30

<211>498

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>31

<211>191

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>32

<211>375

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>33

<211>651

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>34

<211>75

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>35

<211>271

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

<210>36

<211>362

<212>PRT

<213>抗生链霉菌DSM40725(Streptomyces antibioticus DSM 40725)

<400>1

Claims

1.一种氯丝菌素的生物合成基因簇，该基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种根据权利要求1所述的氯丝菌素的生物合成基因簇在制备催化合成抗生素氯丝菌素的蛋白中的应用。

3.根据权利要求1所述的氯丝菌素的生物合成基因簇在制备催化合成2-甲氧基-5-氯-6-甲基-水扬酸及6-甲基-水扬酸的蛋白中的应用。

4.根据权利要求1所述的氯丝菌素的生物合成基因簇在制备催化合成2-脱氧糖的蛋白中的应用。

5.根据权利要求1所述的氯丝菌素的生物合成基因簇在制备催化合成氯丝菌素聚酮大环骨架的蛋白中的应用。