CN102144030A - 啶南平a生物合成基因 - Google Patents

啶南平a生物合成基因 Download PDF

Info

Publication number
CN102144030A
CN102144030A CN2009801288916A CN200980128891A CN102144030A CN 102144030 A CN102144030 A CN 102144030A CN 2009801288916 A CN2009801288916 A CN 2009801288916A CN 200980128891 A CN200980128891 A CN 200980128891A CN 102144030 A CN102144030 A CN 102144030A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotide sequence
polynucleotide
seq
nan ping
pyridine nan
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801288916A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102144030B (zh
Inventor
安西弘行
山本憲太朗
土田麻里子
尾山和彦
三富正明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mitsui Chemical Plant Protection Co ltd
Mitsui Chemicals Agro Inc
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Seika Kaisha Ltd filed Critical Meiji Seika Kaisha Ltd
Publication of CN102144030A publication Critical patent/CN102144030A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102144030B publication Critical patent/CN102144030B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

公开了分离的新多核苷酸，其包含编码参与啶南平A生物合成的至少一种多肽的核苷酸序列；公开了包含所述多核苷酸的重组载体和包含所述多核苷酸的转化体。本发明提供了用于新的啶南平类似物的生产、啶南平A生产菌的生产性的提高、微生物杀虫剂的制备、和抗害虫植物的创建的啶南平A生物合成基因。

Description

啶南平A生物合成基因
相关申请的相互参考
本专利申请要求2008年7月24日递交的日本专利申请190862/2008号、2008年10月20日递交的日本专利申请270294/2008号、和2009年1月30日递交的日本专利申请20591/2009号的优先权，这些日本申请的所有公开内容在本申请中作为本申请公开的一部分引入。
发明背景
技术领域
本发明涉及啶南平A(pyripyropene A)生物合成基因.
背景技术
如在日本特开360895/1992号公报(专利文献1)和Journal of Antibiotics(1993)，46(7)，1168-9(非专利文献1)中所公开的那样，啶南平A对ACAT(酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶)具有抑制活性，期待将其应用于治疗由胆固醇蓄积引起的疾病等。
另外，在Journal of Synthetic Organic Chemistry，Japan(1998)，第56卷，第6期，478-488(非专利文献2)，WO94/09147号公报(专利文献2)，日本特开184158/1994号公报(专利文献3)，日本特开239385/1996号公报(专利文献4)，日本特开259569/1996号公报(专利文献5)，日本特开269062/1996号公报(专利文献6)，日本特开269063/1996号公报(专利文献7)，日本特开269064/1996号公报(专利文献8)，日本特开269065/1996号公报(专利文献9)，日本特开269066/1996号公报(专利文献10)，日本特开291164/1996号公报(专利文献11)，和Journal of Antibiotics(1997)，50(3)，229-36(非专利文献3)中公开了啶南平类似物和衍生物、以及它们的ACAT抑制活性。
进一步地，Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35(非专利文献4)公开了啶南平A对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有杀虫活性。进一步地，WO2004/060065(专利文献12)公开了啶南平A对小菜蛾(Diamondback moth)幼虫和黄粉虫(Tenebrio molitor)具有杀虫活性。
此外，WO2006/129714(专利文献13)和WO2008/066153(专利文献14)公开了啶南平类似物对蚜虫具有杀虫活性。
此外，作为啶南平A的生产菌，在日本特开360895/1992号公报(专利文献1)中公开了烟曲霉(Aspergillus fumigatus)FO-1289株；在Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35(非专利文献4)中公开了网状孢正青霉(Eupenicillium reticulosporum)NRRL-3446株；在WO2004/060065(专利文献12)中公开了灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)F1959株；和在Journal of Technical Disclosure 500997/2008(专利文献15)中公开了粪生青霉(Penicillium coprobium)PF1169株。
另外，作为啶南平A的生物合成途径，Journal of Organic Chemistry(1996)，61，882-886(非专利文献5)和Chemical Review(2005)，105，4559-4580(非专利文献6)公开了在烟曲霉FO-1289株中的推定的生物合成途径。这些文献公开了在烟曲霉FO-1289株中，组合通过聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶分别合成的部分结构，通过环化酶合成啶南平A。
现有技术文献
[专利文献]
[专利文献1]日本特开360895/1992号公报
[专利文献2]WO94/09147号公报
[专利文献3]日本特开184158/1994号公报
[专利文献4]日本特开239385/1996号公报
[专利文献5]日本特开259569/1996号公报
[专利文献6]日本特开269062/1996号公报
[专利文献7]日本特开269063/1996号公报
[专利文献8]日本特开269064/1996号公报
[专利文献9]日本特开269065/1996号公报
[专利文献10]日本特开269066/1996号公报
[专利文献11]日本特开291164/1996号公报
[专利文献12]WO2004/060065号公报
[专利文献13]WO2006/129714号公报
[专利文献14]WO2008/066153号公报
[专利文献15]Journal of Technical Disclosure 500997/2008
[非专利文献]
[非专利文献1]Journal of Antibiotics(1993)，46(7)，1168-9
[非专利文献2]Journal of Synthetic Organic Chemistry，Japan(1998)，第56卷，第6期，478-488
[非专利文献3]Journal of Antibiotics(1997)，50(3)，229-36
[非专利文献4]Applied and Environmental Microbiology(1995)，61(12)，4429-35
[非专利文献5]Journal of Organic Chemistry(1996)，61，882-886
[非专利文献6]Chemical Review(2005)，105，4559-4580
发明概述
本发明人发现了编码参与啶南平A生物合成的至少一种多肽的核苷酸序列。本发明是基于此发现完成的。
因此，本发明的目的是提供分离的新多核苷酸，其具有编码参与啶南平A生物合成的至少一种多肽的核苷酸序列；提供包含所述多核苷酸的重组载体，以及包含所述多核苷酸的转化体。
进一步地，根据本发明的一个实施方案，提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸是
(a)具有SEQ ID NO：266的核苷酸序列的多核苷酸，
(b)具有在严格条件下能够与SEQ ID NO：266的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸，或者
(c)具有编码选自SEQ ID NO：267至274的至少一个氨基酸序列或与其基本上等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的多核苷酸。
另外，根据本发明的另一实施方案，提供了分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸具有选自任一以下(1)或(2)的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列：
(1)任一以下(a)至(h)的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第3342位至第5158位的核苷酸序列，
(b)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第5382位至第12777位的核苷酸序列，
(c)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第13266位至第15144位的核苷酸序列，
(d)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第16220位至第18018位的核苷酸序列，
(e)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第18506位至第19296位的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第19779位至第21389位的核苷酸序列，
(g)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第21793位至第22877位的核苷酸序列，
(h)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第23205位至第24773位的核苷酸序列；
(2)能够与(1)中所述的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
进一步地，根据本发明的另一实施方案，提供了编码参与啶南平A生物合成的至少一种多肽的多核苷酸。
另外，根据本发明的另一实施方案，提供了编码具有聚酮化合物合酶活性、异戊烯转移酶活性、羟化酶活性、乙酰转移酶活性或腺苷酸合酶活性中的任意一种或多种活性的多肽的多核苷酸。
进一步地，根据本发明的另一实施方案，提供了衍生自粪生青霉PF1169株的多核苷酸。
另外，根据本发明的另一实施方案，提供了包含上述多核苷酸的重组载体。
进一步地，根据本发明的另一实施方案，提供了包含上述多核苷酸的转化体。
此外，根据本发明的一个实施方案，提供了制备啶南平A前体的方法，其特征在于，同时或分别地培养掺入了具有上述(c)或(d)的核苷酸序列的多核苷酸的转化体，和从下式的啶南平E分离啶南平A前体：
Figure BPA00001306973400051
啶南平E
进一步地，提供了其中上述啶南平A前体是下式(I)所示化合物的制备方法：
Figure BPA00001306973400061
式(I)
另外，提供了制备啶南平A前体的方法，其特征在于，培养上述转化体和从下式代表的啶南平O分离啶南平A前体：
啶南平O
进一步地，提供了其中上述啶南平A前体是下式(II)所示化合物的制备方法：
式(II)
根据本发明的一个实施方案，能够进行新的啶南平类似物的生产、啶南平A生产菌的生产性的提高、新的微生物杀虫剂的制备、和新的抗害虫植物的创建等。
附图简述
[图1]图1显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp梯)，泳道1：SEQ ID NO：1和2的引物，泳道2：SEQ ID NO：239和240的引物，泳道3：SEQ ID NO：237和238的引物，泳道4：SEQ ID NO：241和242的引物，泳道5：SEQ ID NO：247和248的引物，泳道6：SEQ ID NO：251和252的引物，泳道7：SEQ ID NO：245和246的引物，泳道8：SEQ ID NO：243和244的引物，泳道9：SEQ ID NO：249和250的引物，泳道10：SEQ ID NO：235和236的引物，泳道11：SEQ ID NO：233和234的引物，泳道12：SEQ ID NO：227和228的引物，泳道13：SEQ ID NO：229和230的引物，泳道14：SEQ ID NO：231和232的引物。
[图2]类似于图1，图2显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：M：分子量标记物(100bp梯)，泳道1：SEQ ID NO：253和254的引物，泳道2：SEQ ID NO：257和258的引物，泳道3：SEQ ID NO：259和260的引物，泳道4：SEQ ID NO：255和256的引物，泳道5：SEQ ID NO：261和262的引物。
[图3]类似于图1，图3显示了PCR产物通过琼脂糖凝胶的电泳模式。对于电泳，使用了以下引物扩增的PCR产物：泳道1：分子量标记物(100bp梯)，泳道2：SEQ ID NO：264和265的引物(400bp扩增片段).
[图4]图4显示了pUSA的质粒图谱。
[图5]图5显示了pPP2的质粒图谱。
[图6]图6显示了P450-2 cDNA扩增的方案。
[图7]图7显示了pPP3的质粒图谱。
[图8]图8显示了啶南平E在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图9]图9显示了用质粒pPP2转化的米曲霉(Aspergillus oryzae)的培养产物在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图10]图10显示了啶南平O在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
[图11]图11显示了用质粒pPP3转化的米曲霉的培养产物在氘化乙腈中的1H-NMR谱。
发明详述
微生物的保藏
用质粒pCC1-PP1转化的大肠杆菌(Escherichia coli)(大肠杆菌EPI300TM-T1R)于2008年10月9日(原始保藏日)保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11133(从国内保藏FERM P-21704移管)(保藏者所用的识别标识：大肠杆菌EPI300TM-T1R/pCC1-PP1)。
用质粒pPP2转化的米曲霉于2009年6月23日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11137(保藏者所用的识别标识：米曲霉PP2-1)。
用质粒pPP3转化的米曲霉于2009年7月3日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，AIST，305-8566)，保藏号是FERM BP-11141(保藏者所用的识别标识：米曲霉PP3-2)。
分离的多核苷酸
本发明涉及分离的多核苷酸。本发明的分离的多核苷酸是(a)具有SEQ ID NO：266的核苷酸序列的多核苷酸，(b)具有在严格条件下能够与SEQ ID NO：266的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸，或者(c)具有编码选自SEQ ID NO：267至274的至少一个氨基酸序列或与其基本上等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的多核苷酸。上述分离的多核苷酸优选地具有这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有参与啶南平A的生物合成的酶活性的至少一种多肽。
在本发明中，“基本上等同的氨基酸序列”是指尽管具有由于一个或多个氨基酸的替换、缺失、添加或插入而引起的改变，但多肽的活性未受影响的氨基酸序列。改变的氨基酸残基数优选地是1至40个残基，更优选地是1至几个残基，更优选地是1至8个残基，最优选地是1至4个残基。
进一步地，不影响活性的改变的例子包括保守替换。术语“保守替换”是指将一个或多个氨基酸残基用其它化学相似的氨基酸残基替换，而多肽的活性基本上未改变。其例子包括将某个疏水性氨基酸残基用另一个疏水性氨基酸残基替换的情形和将某个极性氨基酸残基用另一个具有相同电荷的极性氨基酸残基替换的情形。能够进行此类替换的功能类似的氨基酸是本领域公知的每一氨基酸。具体而言，非极性(疏水性)氨基酸的例子包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸的例子包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。带正电荷的(碱性)氨基酸的例子包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。带负电荷的(酸性)氨基酸的例子包括天冬氨酸、谷氨酸等。
另外，本发明的分离的多核苷酸也可以是具有选自任一以下(1)或(2)的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列的多核苷酸：
(1)任一以下(a)至(h)的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第3342位至第5158位的核苷酸序列，
(b)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第5382位至第12777位的核苷酸序列，
(c)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第13266位至第15144位的核苷酸序列，
(d)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第16220位至第18018位的核苷酸序列，
(e)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第18506位至第19296位的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第19779位至第21389位的核苷酸序列，
(g)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第21793位至第22877位的核苷酸序列，
(h)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第23205位至第24773位的核苷酸序列；
(2)能够与(1)中所述的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
具有选自任一上述(1)或(2)的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列的多核苷酸优选地编码具有参与啶南平A的生物合成的酶活性的至少一种多肽。
在本发明中的术语“严格条件”是指杂交后的膜的洗涤操作在低盐浓度的溶液中在高温进行的条件，例如，在2×SSC浓度(1×SSC：15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠)和0.5％ SDS的溶液中60℃洗涤20分钟的条件。
本发明的具有选自任一上述(1)或(2)的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列的多核苷酸是编码具有聚酮化合物合酶活性、异戊烯转移酶活性、羟化酶活性、乙酰转移酶活性或腺苷酸合酶活性中的任意一种或多种活性的多肽的多核苷酸；特别地是编码具有羟化酶活性的多肽的多核苷酸。
进一步地，根据本发明的一个实施方案，上述多核苷酸是编码具有羟化上述啶南平E或O的7位和/或13位的活性的多肽的多核苷酸，或者是编码具有羟化上述啶南平E的11位的活性的多肽的多核苷酸。
分离的多核苷酸的获得
不特别地限制用于获得本发明的分离的多核苷酸的方法。例如，多核苷酸可以通过下述方法自粪生青霉PF1169株或丝状菌分离。
基于通过下文实施例9的方法等获得的同源序列，合成能够特异扩增聚酮化合物合酶基因的引物。对另外制备的粪生青霉PF1169株的F粘粒基因组文库进行PCR，然后进行菌落杂交。获得了重组载体并确定了插入的DNA的碱基序列。
另外，基于通过下文实施例9的方法等获得的同源序列，合成能够特异扩增异戊烯转移酶基因的引物。进一步地，以上述相同的方式确定了插入的DNA的碱基序列。
进一步地，基于通过下文实施例9的方法等获得的同源序列，合成能够特异扩增聚酮化合物合酶基因和异戊烯转移酶基因中的任一种基因或这两种基因的引物。进一步地，以上述相同的方式确定了插入的DNA的碱基序列。
另外，基于本发明的选自SEQ ID NO：266和任一上述(1)或(2)的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列的同源序列，合成能够特异扩增聚酮化合物合酶基因、异戊烯转移酶基因、羟化酶基因、乙酰转移酶基因或腺苷酸合酶基因中的任意一种基因或多种基因的引物；优选地合成能够特异扩增羟化酶基因的引物。进一步地，以上述相同的方式确定了插入的DNA的碱基序列。
进一步地，基于不同丝状菌聚酮化合物合酶中的保守氨基酸序列，合成了用于扩增的简并引物并确定了插入的DNA的碱基序列。
转化体
一般而言，用于通过基因重组来提高二次代谢产物的生产性的方法的例子包括提高编码催化作为限速反应的生物合成反应的蛋白质的基因表达、增强调节生物合成基因表达的基因表达或破坏调节生物合成基因表达的基因、阻断不必要的二次代谢系统等。因此，特定生物合成基因使得可能将所述基因连接至合适的载体并将所述载体导入生产菌，从而提高二次代谢产物的生产性。
另一方面，为了通过基因重组产生新的活性物质，进行了聚酮化合物合酶的结构域改变[Ikada和Ohmura，“PROTEIN，NUCLEIC ACID AND ENZYME”，第43卷，1265-1277页，1998]，[Carreras，C.W.和Santi，D.V.，“Current Opinion in Biotechnology”，(UK)，1998，第9卷，403-411页]，[Hutchinson，C.R.，“Current Opinion in Microbiology”，(UK)，1998，第1卷，319-329页]，[Katz，L.和McDaniel，R.，“Medicinal Research Reviews”，(USA)，1999，第19卷，543-558页]；破坏生物合成基因；导入来自其它生物体的修饰酶基因[Hutchinson，C.R.，″Bio/Technology″，(USA)，1994，第12卷，375-380页]等。因此，特定生物合成基因使得可能将所述基因连接至合适的载体并将所述载体导入二次代谢产物的生产菌，从而创造出新颖的活性物质。
因此，通过将本发明的分离的多核苷酸连接至合适的载体、将所述载体导入宿主、表达它、增强其表达；或者利用同源重组，用部分分离的多核苷酸进行基因破坏而使其功能受损，从而能够生产啶南平A或者提高其生产性。
利用同源重组的基因破坏可按照常规方法实施。用于基因破坏的载体的制备和载体向宿主的导入对本领域技术人员是显而易见的。
本发明的重组载体优选地包含任意一种或多种这样的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO：266和上述(1)的核苷酸序列；具有能够与SEQ ID NO：266和上述(1)的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列；或者具有编码选自SEQ ID NO：267至274的至少一个氨基酸序列或与其基本上等同的氨基酸序列的多核苷酸序列。更优选地，本发明的重组载体是包含这样的多核苷酸的重组载体，所述多核苷酸羟化上述啶南平E或O的7位和/或13位，或者羟化上述啶南平E的11位。
用于基因导入的重组载体可以通过将本发明提供的多核苷酸根据目的以常规方法修饰为合适的形式、连接入载体而制备，所述常规方法例如[Sambrook，J.等人，“Molecular cloning：a laboratory manual”，(USA)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，1989]中所述的基因重组技术。
本发明中使用的重组载体可以合适地选自病毒、质粒、F粘粒、粘粒载体等。例如，当宿主细胞是大肠杆菌时，重组载体的例子包括基于λ噬菌体的噬菌体、基于pBR和pUC的质粒。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的情形时，重组载体的例子包括基于pUB的质粒。在酵母的情形时，重组载体的例子包括基于YEp、YRp、YCp和YIp的质粒。
此外，优选在所用的质粒中的至少一种质粒包含用于选择转化体的选择性标记。作为选择性标记，可以使用编码药物抗性的基因和互补营养缺陷的基因。作为其优选的具体例子，当使用的宿主是细菌时，选择性标记是氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因等；在宿主是酵母的情形时，选择性标记是色氨酸生物合成基因(TRP1)、尿嘧啶生物合成基因(URA3)、亮氨酸生物合成基因(LEU2)等；在宿主是真菌的情形时，选择性标记是潮霉素抗性基因、双丙氨磷抗性基因、博来霉素抗性基因、短梗霉菌素抗性基因等；在宿主是植物的情形时，选择性标记是卡那霉素抗性基因、双丙氨磷抗性基因等。
进一步地，在本发明中用作表达载体的DNA分子优选地具有表达每一基因所需的DNA序列，如启动子、转录起始信号、核糖体结合部位、翻译停止信号、终止子等转录调节信号和翻译调节信号。启动子的优选例子包括大肠杆菌(Escherichia coli)中的乳糖操纵子、色氨酸操纵子等的启动子；酵母中的醇脱氢酶基因、酸性磷酸酶基因、半乳糖代谢基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶基因等的启动子；真菌中的α-淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、纤维二糖水解酶基因、甘油醛3-磷酸脱氢酶基因、abp1基因等的启动子；植物中的CaMV 35S RNA启动子、CaMV 19S RNA启动子或胭脂碱合成酶基因启动子。
根据所使用的载体的类型，导入本发明的分离的多核苷酸的宿主可以适宜地选自放线菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母、丝状菌、植物细胞等。
根据受试宿主细胞，将重组载体导入宿主的方法可以选自接合转移、通过噬菌体的转导、以及钙离子法、锂离子法、电穿孔法、PEG法、农杆菌(Agrobacterium)法或粒子枪法等转化法。
在本发明中当将多种基因导入宿主细胞中时，所述基因可以包含在单一的DNA分子中或分别在不同的DNA分子中。进一步地，当宿主细胞是细菌时，可以设计每一基因表达为多顺反子mRNA并在一个DNA分子中。
本发明的转化体优选地包含任意一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸是具有SEQ ID NO：266和上述(1)中所述的核苷酸序列的多核苷酸；具有在严格条件下能够与SEQ ID NO：266和上述(1)中所述的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸；或者具有编码选自SEQ ID NO：267至274的至少一个氨基酸序列或与其基本上等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的多核苷酸。
获得的转化体能够通过常规方法培养并研究新获得的特性。作为培养基，可以使用常用的组分，例如，葡萄糖、蔗糖、淀粉浆、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动物油和植物油等作为碳源。另外，可以使用大豆粉、小麦胚芽、玉米浆、棉籽粕、肉膏、聚胨、麦芽糖提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、脲等作为氮源。此外，根据需要，添加钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸(磷酸氢二钾等)、硫酸(硫酸镁等)或其它能生成其它离子的无机盐是有效的。此外，根据需要，可以添加多种维生素如硫胺素(硫胺素盐酸盐等)、氨基酸如谷氨酸(谷氨酸钠等)或天冬酰胺(DL-天冬酰胺等)、微量营养素如核苷酸、或者选择剂如抗生素。进一步地，可以适当地添加帮助细菌生长和促进啶南平A产生的有机物和无机物。
培养基的pH是例如约pH 5.5至pH 8。作为培养方法，可以应用需氧条件下的固体培养法、振摇培养法、通气搅拌培养法、或深部需氧培养法，特别地，深部需氧培养法是最合适的。合适的培养温度是15℃至40℃，并且在许多情形下，在约22℃至30℃进行培养。啶南平A的生产根据培养基和培养条件或所用的宿主而不同。在任一培养法中，通常在2天至10天期间蓄积达到峰值。当啶南平A的蓄积在培养中达到峰值时停止培养并将目的物质从培养物中分离和纯化。
为了从培养物中分离啶南平A，可以利用啶南平A的特性通过常规的分离法如溶剂提取法、离子交换树脂法、吸附或分配柱层析法、凝胶过滤法、透析法、沉淀法、结晶法等，单独地或适当组合地进行分离和纯化。
啶南平A前体的制造法
为了分离啶南平A，可以使用已知的方法从啶南平A前体来分离啶南平A。作为已知的方法的例子包括WO2009/022702的方法。通过培养含有上述一种或多种的载体的微生物，可以将啶南平A前体从啶南平E分离。啶南平A前体可以是例如上述式(I)所示的化合物。
另外，通过培养含有一种或多种的载体的微生物，可以将啶南平A前体从啶南平O分离。例如可以是上述式(II)所示的化合物。
实施例
本发明将通过下列实施例进一步具体阐述本发明，这些实施例不用于限制本发明。
实施例1：制备粪生青霉PF1169株的基因组DNA
将无菌NB培养基(500ml)置于三角瓶(1L)。将在1/2 CMMY琼脂培养基中28℃预培养4天的粪生青霉PF1169株(Journal of Technical Disclosure No.500997/2008(专利文献15))加入上述培养基，并在28℃液体培养4天。用Miracloth过滤，获得5g菌体。从这些菌体根据基因组DNA纯化试剂盒Genomic-tip 100/G(Qiagen K.K.制)所附的手册获得30μg基因组DNA。
实施例2：用于扩增聚酮化合物合酶(PKS)的简并引物和其扩增片段
基于多种丝状菌聚酮化合物合酶中保守的氨基酸序列，设计并合成下列引物作为简并引物用于扩增：
LC1：GAYCCIMGITTYTTYAAYATG(SEQ ID NO：1)
LC2c：GTICCIGTICCRTGCATYTC(SEQ ID NO：2)
(其中R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，I＝肌苷)。
使用这些简并引物，将实施例1中制备的基因组DNA和ExTaq聚合酶(Takara Bio Inc.制)按照所附的手册进行反应。检测到约700bp的扩增片段(见图1)。进一步地，分析上述扩增片段来特定其内部的500bp序列(SEQ ID NO：3)。
实施例3：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索
将实施例1中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预处理并随后供Roche 454FLX DNA测序仪测序，获得了约250bp，103000个片段序列(总计49Mb的序列)。
对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列，选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：烟曲霉PKS 2146a.a.和灰黄青霉(Penicillium(P.)griseofluvum)6-甲基水杨酸(methylsalycilic acid)合酶1744a.a.；异戊烯转移酶：烟曲霉异戊烯转移酶，烟曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)和马尼菲青霉(Penicillium(P.)marneffei)异戊烯转移酶)，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得89个、86个、2个、1个和3个同源序列(见表1)。进一步地，从烟曲霉PKS 2146a.a.和灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的同源序列，分别获得19个和23个叠连序列(烟曲霉PKS 2146a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：179至197；灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.的叠连序列：SEQ ID NO：198至220)(见表1)。
[表1]
Figure BPA00001306973400161
  转移酶
实施例4：从基因组DNA的PCR扩增
从实施例3获得的blastx的检索结果，对于聚酮化合物合酶，合成了SEQ ID NO：227至252所示的13种引物对。类似地，对于异戊烯转移酶，合成了SEQ ID NO：253至262所示的5种引物对。当使用这些引物对基因组DNA进行PCR时，对所有的引物对观察到了预期大小的扩增片段(见图1和图2)。
实施例5：构建噬菌体基因组文库
使用λBlueSTAR Xho I Half-site Arms Kit(Takara Bio Inc.制，目录号69242-3)按照所附的手册构建粪生青霉PF1169株的λ噬菌体基因组文库。即，用限制性酶Sau3A1部分消化基因组DNA。将约20kb的DNA片段(0.5μg)连接至试剂盒所附的0.5μg λBlueSTAR DNA。将该连接溶液使用Lambda INN Packaging试剂盒(Nippon Gene Co.，Ltd.制)，根据该试剂盒所附的手册进行体外包装，获得1ml溶液。将该经包装的噬菌体溶液(10μl)感染100μl大肠杆菌ER1647株，并在噬斑形成培养基上37℃过夜培养，从而获得约500个克隆的噬斑。因此，构建了包含通过感染导入了10至20kb粪生青霉PF1169株的基因组DNA的噬菌体约50000个克隆的基因组文库。
实施例6：自噬菌体文库的筛选
从实施例5制备的噬菌体文库的10000个克隆，使用自上述制备的LC1-LC2c引物对扩增的PCR产物作为探针通过噬斑杂交进行初步筛选。对于探针的标记和检测，使用AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-Star(GE Healthcare制，目录号RPN3690)。上述杂交按照所附的手册进行。
通过初步筛选后，留下6个克隆作为候补。进一步地，作为通过噬斑杂交进行的二次筛选的结果，获得了4个克隆。将这些阳性克隆感染大肠杆菌BM25.8株，并按照所附的手册将噬菌体变换为质粒，从而获得了含有目的区域的4种质粒。
实施例7：制备F粘粒基因组文库
使用CopyControl Fosmid Library Production Kit(EPICENTRE制，目录号CCFOS110)，按照该试剂盒所述的手册，构建粪生青霉PF1169株的基因组文库。即，将约40kb基因组DNA 0.25μg的DNA片段末端平端化后掺入F粘粒载体pCCFOS(Epicentre制)。将该连接溶液使用该试剂盒所附的MaxPlax Lambda Packaging Extract，根据该试剂盒所附的手册进行体外包装。将该经包装的病毒溶液10μl感染100μl大肠杆菌EPI300TM-T1R株，并在含有氯霉素的培养基上37℃过夜培养并选择，从而获得约300个克隆的噬斑。因此，获得了通过感染导入了40kb粪生青霉PF1169株的基因组DNA的F粘粒约30000个克隆。将它们以每孔约50个克隆注入96孔板。从而构建了包含96个池的约4800个克隆的基因组文库。
实施例8：筛选F粘粒文库
按照F粘粒所附的手册，分别从实施例7制备的文库的96个池制备质粒DNA。使用实施例2中合成的用于聚酮化合物合酶扩增的简并引物，对96个池的这些质粒DNA样本实施PCR。结果，从9个池扩增了约700bp的DNA片段。进一步地，从所述阳性池制备含有约300个或以上克隆的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用LC1-LC2c引物对，自约4800个克隆获得了9种F粘粒。
实施例9：基因组DNA的大量测序和氨基酸序列同源性检索
将实施例1中获得的粪生青霉PF1169株的基因组DNA进行大量测序和氨基酸序列的同源性检索。具体地，将基因组DNA的50μg份进行预处理并随后供Roche 454FLX DNA测序仪测序，获得了平均重叠群长度19.621kb的1405个片段序列(总碱基长27.568160Mb的序列)。
对于这些序列，作为聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶中已知的序列，选择下列5种序列(衍生自聚酮化合物合酶：灰黄青霉6-甲基水杨酸合酶1744a.a.(P22367)和烟曲霉PKS 2146a.a.(Q4WZA8)；以及异戊烯转移酶：马尼菲青霉异戊烯转移酶(Q0MRO8)、烟曲霉异戊烯转移酶(Q4WBI5)和烟曲霉异戊烯转移酶(4-羟基苯甲酸八异戊烯转移酶)(Q4WLD0))，并用同源序列检索软件blastx进行检索，由此分别获得22个(P22367)、21个(Q4WZA8)、2个(Q0MRO8)、3个(Q4WBI5)和3个(Q4WLD0)同源序列。
实施例10：F粘粒文库筛选和簇集基因的序列分析
按照F粘粒试剂盒(EPICENTRE制，CopyControl Fosmid Library Production Kit)所附的手册，从实施例7制备的文库的96个池分别制备各质粒DNA。基于Roche 454FLX DNA测序仪确定的碱基序列，进行氨基酸序列的同源性检索，以检索与聚酮化合物合酶和异戊烯转移酶邻近的区域。基于所获得的区域的异戊烯转移酶碱基序列，合成能够扩增400bp DNA片段的引物对(No.27)。使用该引物，对48个池的质粒DNA样本进行PCR。结果，从11个池扩增了约400bp的预期DNA片段(SEQ ID NO：263)(见图3)。进一步地，从该阳性池中的6个池制备含有约300个或以上克隆的集落的平皿，并再次通过菌落杂交筛选。结果，使用27F+27R引物对(27F引物：SEQ ID NO：264，27R引物：SEQ ID NO：265)，自约4800个克隆获得了4种F粘粒。其中之一命名为pCC1-PP1，并且确定了插入片段的全序列(SEQ ID NO：266)。
将获得的pCC1-PP1转化入大肠杆菌EPI300TM-T1R株(包括在F粘粒试剂盒中)，由此获得了大肠杆菌EPI300TM-T1R株/pCC1-PP1。
当在上述SEQ ID NO：266的序列和腺苷酸形成酶、LovB样聚酮化合物合酶、作为羟化酶的细胞色素P450单加氧酶、整合膜蛋白、FAD依赖的单加氧酶、UbiA样异戊烯转移酶、作为乙酰基化酶的乙酰转移酶、毒素生物合成蛋白Tri7、以及转运阳离子的ATPase(上述酶均来自烟曲霉Af293株)之间分别进行同源性检索时，在任一检索中均观察到70％或以上的高同源性。
SEQ ID NO：266的核苷酸3342至5158编码腺苷酸形成酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：267所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸5382至12777编码LovB样聚酮化合物合酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：268所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸13266至15144(此后将该多核苷酸序列(P450-1)编码的蛋白质称为细胞色素P450单加氧酶(1))和核苷酸16220至18018(此后将该多核苷酸序列(P450-2)编码的蛋白质称为细胞色素P450单加氧酶(2))编码细胞色素P450单加氧酶，相应的多肽分别显示为SEQ ID NO：269和270所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸18506至19296编码整合膜蛋白，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：271所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸19779至21389编码FAD依赖的单加氧酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：272所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸21793至22877编码UbiA样异戊烯转移酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：273所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸23205至24773编码乙酰转移酶，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：274所示的氨基酸序列；SEQ ID NO：266的核苷酸25824至27178编码毒素生物合成蛋白Tri7，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：275所示的氨基酸序列；和SEQ ID NO：266的核苷酸27798至31855编码转运阳离子的ATPase，其相应的多肽显示为SEQ ID NO：276所示的氨基酸序列。
实施例11：通过转化米曲霉羟化啶南平E或啶南平O
以下所用的啶南平E可以例如基于日本特开239385/1996(专利文献4)、WO94/09147或美国专利号5597835中所述的方法通过微生物培养法而生产，或者可以根据Tetrahedron Letters，第37卷，第36期，6461-6464，1996所述的全合成方法而生产。另外，以下所用的啶南平O可以例如基于J.Antibiotics 49，292-298，1996或WO94/09147所述的方法通过微生物培养法而生产。
(1)丝状菌导入用表达载体的制备
将pUSA(图4)和pHSG399(Takara Bio Inc.)分别用KpnI消化并连接，由此获得pUSA-HSG。将该质粒用SmaI和KpnI按所提及的顺序消化，进行凝胶纯化，由此获得具有KpnI粘末端和SmaI平末端的线性载体DNA。
(2)质粒pPP2的制备
将F粘粒pCC1-PP1作为模板，使用具有Kpn F的P450-1(SEQ ID NO：277)/具有Swa R的P450-1(SEQ ID NO：278)的引物对扩增上述P450-1的多核苷酸。将纯化的DNA片段克隆入pCR-Blunt(Invitorogen，目录号K2700-20)。将获得的质粒用KpnI和SwaI消化。将上述P450-1片段连接入上述载体pUSA-HSG。由此获得了图5所示的质粒pPP2。
(3)质粒pPP3的制备
将F粘粒pCC1-PP1作为模板，按照图6所示的流程，首先，使用引物对F1(SEQ ID NO：279)/R1(SEQ ID NO：280)、F2(SEQ ID NO：281)/R2(SEQ ID NO：282)、F3(SEQ ID NO：283)/R3(SEQ ID NO：284)、F4(SEQ ID NO：285)/R4(SEQ ID NO：286)、F5(SEQ ID NO：287)/R5(SEQ ID NO：288)、和F6(SEQ ID NO：289)/R6(SEQ ID NO：290)仅扩增外显子，由此获得6个片段。接下来，用这些片段作为模板，使用引物对F1/R2、F3/R4和F5/R6进行扩增，由此获得更长的片段。进一步地，通过使用引物对F1/R4和F1/R6反复扩增，制备上述P450-2的多核苷酸的不含内含子的cDNA。将该cDNA片段插入pCR-Blunt(Invitorogen，目录号K2700-20)，并将所获得的质粒作为模板，使用引物对P450-2-cDNA的infusion F(SEQ ID NO：291)/P450-2-cDNA的infusion R(SEQ ID NO：292)进行扩增。使用In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit(Clontech)，根据该试剂盒的手册，获得了图7所示的质粒pPP3。
(4)米曲霉(A.oryzae)的转化
在CD-Met(含有40μg/ml L-甲硫氨酸)琼脂培养基中，30℃培养米曲霉(HL-1105株)一周。自该平皿收集分生孢子(＞108个)并接种于500ml烧瓶的100ml YPD液体培养基中。培养20小时(30℃，180转/分钟)后，获得具有藻球状的菌体。将这些菌体用3G-1玻璃滤纸收集，用0.8M NaCl洗，充分脱水。将获得物用TF溶液I(原生质体形成溶液)悬浮，然后30℃60转/分钟振摇2小时。每隔30分钟，在显微镜下观察，并检查原生质体的存在。然后过滤培养液，离心(2000转/分钟，5分钟)收集原生质体，然后将原生质体用TF溶液II洗。洗涤后，加入0.8体积的TF溶液II和0.2体积的TF溶液III并混合，由此获得原生质体悬液。
向200μl该悬液加入10μg质粒DNA(pPP2或pPP3)。将混合物置于冰上30分钟，加入TF溶液III(1mL)。将所得的混合物轻轻混合，然后置于室温15分钟。然后，将质粒DNA导入上述原生质体。向其加入TF溶液II(8mL)并离心(2000转/分钟离心5分钟)。进一步地，留下1至2ml而回收原生质体。将回收的原生质体溶液滴入再生培养基(下层)，并倒入再生培养基(上层)。将所得物旋转平皿混合后，30℃培养4至5天，长出的克隆在再生培养基(下层)中分离、传代培养并纯化，由此获得了转化体(米曲霉PP2-1和米曲霉PP3-2)。
使用下列组分制备上述TF溶液I(原生质体形成溶液)。
化合物名称                     浓度
Yatalase(Takara Bio Inc.制)    20mg/ml
硫酸铵                         0.6M
马来酸-NaOH                    50mM
制备上述组分(pH5.5)后，过滤灭菌。
使用下列组分制备上述TF溶液II。
化合物名称
1.2M山梨糖醇(MW＝182.17)       43.72g
50mM CaCl2                     10ml     1M CaCl2(1/20)
35mM NaCl                      1.4ml    5M NaCl
10mM Tris-HCl                  2ml      1M Tris-HCl(1/100)
至总体积                       200ml
制备上述组分后，高压灭菌。
使用下列组分制备上述TF溶液III。
化合物名称
60％ PEG4000        6g
50mM CaCl2          500μl 1M CaCl2(1/20)
50mM Tris-HCl       500μl  1M Tris-HCl(1/100)
至总体积            10ml
制备上述组分后，过滤灭菌。
使用下列组分制备上述再生培养基。
化合物名称                            浓度
山梨糖醇(MW＝182.17)    218.6g        1.2M
NaNO3                   3.0g          0.3％(w/v)
KCl                     2.0g          0.2％(w/v)
KH2PO4                  1.0g          0.1％(w/v)
MgSO4·7H2O             2ml 1M MgSO4  0.05％ 2mM
痕量元素溶液            1ml
葡萄糖                  20.0g         2％(w/v)
至总体积                1L
制备上述组分(pH5.5)后，高压灭菌。
另外，使用下列组分制备上述痕量元素溶液。
化合物名称
FeSO4·7H2O            1.0g
ZnSO4·7H2O            8.8g
CuSO4·5H2O            0.4g
Na2B4O7·10H2O         0.1g
(NH4)6Mo7O24·4H2O     0.05g
至总体积               1L
制备上述组分后，高压灭菌。
(5)P450-1的功能分析和添加培养试验
向含有1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)右旋糖)中加入1/100体积的啶南平E的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基A。从Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP2-1菌群收集分生孢子，并悬于无菌水中。将该分生孢子悬液调节为104个孢子/mL。进一步地，将该调节的分生孢子悬液100μL添加至10mL培养基A，并在25℃振摇培养96小时。向该培养液加入10mL丙酮，并充分混合。然后，用离心浓缩器去除丙酮。向其加入10mL乙酸乙酯并充分混合所得的混合物，然后仅回收乙酸乙酯层。通过使用离心浓缩器去除乙酸乙酯获得干燥的产物，将其溶解于1000μL甲醇。将其作为样本，并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695S eparation module，柱：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))和LC-NMR(Avance500，Burker Daltonik制)进行分析。
由上述LC-MS测定的结果，证实了所获得的化合物是与啶南平E相比较而言分子量增加了16的单一化合物A。此外，由LC-NMR测定的结果，证实了该化合物A是啶南平E的11位羟化物。这证实了上述细胞色素P450单加氧酶(1)是以啶南平E作为底物，羟化啶南平E的11位的酶。
上述化合物A的物理化学特性如下所示：
1.质谱：ES-MS 468M/Z(M+H)+
2.分子式：C27H33NO6
3.HPLC：柱：Waters XTerra Column C18(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，移动相：在10分钟从20％乙腈水溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速：0.8ml/分钟，检测：在UV 323nm的保留时间6.696分钟
4.1H-NMR谱(CD3CN，2H：3.134，3.157H-11)
啶南平E的1H-NMR谱和上述4所述的1H-NMR谱分别显示于图8和图9。
(6)P 450-2的功能分析和添加培养试验
向含有1％(w/v)麦芽糖的YPD培养基(1％(w/v)酵母提取物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)右旋糖)中加入1/100体积的啶南平E的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基B；类似地，加入1/100体积的啶南平O的2mg/mL二甲亚砜溶液，以提供培养基C。从Czapek Dox琼脂培养基中培养的米曲霉PP3-2菌群收集分生孢子，并悬于无菌水中。将该分生孢子悬液调节为104个孢子/mL。进一步地，将该调节的分生孢子悬液500μL添加至50mL培养基B或培养基C，并在25℃振摇培养96小时。向该培养液加入50mL丙酮，并充分混合。然后，用离心浓缩器去除丙酮。向其加入50mL乙酸乙酯并充分混合所得的混合物，然后仅回收乙酸乙酯层。通过使用离心浓缩器去除乙酸乙酯获得干燥的产物，将其溶解于1500μL甲醇。将其作为样本，并通过LC-MS(Waters，Micromass ZQ，2996PDA，2695 Separation module，柱：Waters XTerra C18(Φ4.5×50mm，5μm))和LC-NMR(Burker Daltonik制，Avance500)进行分析。由上述LC-MS测定的结果，自培养基B得到的样本检测到了与啶南平E相比较而言分子量增加了32的化合物B。此外，自培养基C得到的样本检测到了与啶南平O相比较而言分子量增加了32的化合物C。进一步地，由LC-NMR测定的结果，证实了化合物C是啶南平O的7位和13位羟化物。这证实了上述细胞色素P450单加氧酶(2)是羟化每一啶南平E或啶南平O的7位和13位的酶。
上述化合物B的物理化学特性如下所示：
1.质谱：ES-MS 484M/Z(M+H)+
2.分子式：C27H33NO7
3.HPLC：柱：Waters XTerra Column C18(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，移动相：在10分钟从20％乙腈水溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速：0.8ml/分钟，检测：在UV 323nm的保留时间5.614分钟
上述化合物C的物理化学特性如下所示：
1.质谱：ES-MS 542M/Z(M+H)+
2.分子式：C29H35NO9
3.HPLC：柱：Waters XTerra Column C18(5μm，4.6mm×50mm)，40℃，移动相：在10分钟从20％乙腈水溶液至100％乙腈(线性梯度)，流速：0.8ml/分钟，检测：在UV 323nm的保留时间5.165分钟
4.1H-NMR谱(CD3CN，1H 4.858H-13)，(CD3CN，1H 3.65H-7)
啶南平O的1H-NMR谱和上述化合物C的1H-NMR谱分别显示于图10和图11。
保藏号
FERM BP-11133
FERM BP-11137
FERM BP-11141
Figure IPA00001306972900011
Figure IPA00001306972900021
Figure IPA00001306972900031
Figure IPA00001306972900041
Figure IPA00001306972900051
Figure IPA00001306972900061
Figure IPA00001306972900071
Figure IPA00001306972900081
Figure IPA00001306972900091
Figure IPA00001306972900101
Figure IPA00001306972900111
Figure IPA00001306972900131
Figure IPA00001306972900141
Figure IPA00001306972900151
Figure IPA00001306972900161
Figure IPA00001306972900191
Figure IPA00001306972900201
Figure IPA00001306972900221
Figure IPA00001306972900231
Figure IPA00001306972900241
Figure IPA00001306972900251
Figure IPA00001306972900271
Figure IPA00001306972900281
Figure IPA00001306972900291
Figure IPA00001306972900301
Figure IPA00001306972900321
Figure IPA00001306972900331
Figure IPA00001306972900351
Figure IPA00001306972900361
Figure IPA00001306972900381
Figure IPA00001306972900401
Figure IPA00001306972900411
Figure IPA00001306972900421
Figure IPA00001306972900441
Figure IPA00001306972900451
Figure IPA00001306972900471
Figure IPA00001306972900481
Figure IPA00001306972900491
Figure IPA00001306972900501
Figure IPA00001306972900511
Figure IPA00001306972900521
Figure IPA00001306972900531
Figure IPA00001306972900541
Figure IPA00001306972900551
Figure IPA00001306972900561
Figure IPA00001306972900581
Figure IPA00001306972900591
Figure IPA00001306972900601
Figure IPA00001306972900611
Figure IPA00001306972900621
Figure IPA00001306972900641
Figure IPA00001306972900651
Figure IPA00001306972900661
Figure IPA00001306972900681
Figure IPA00001306972900691
Figure IPA00001306972900701
Figure IPA00001306972900711
Figure IPA00001306972900721
Figure IPA00001306972900731
Figure IPA00001306972900751
Figure IPA00001306972900761
Figure IPA00001306972900771
Figure IPA00001306972900781
Figure IPA00001306972900791
Figure IPA00001306972900801
Figure IPA00001306972900821
Figure IPA00001306972900831
Figure IPA00001306972900861
Figure IPA00001306972900871
Figure IPA00001306972900881
Figure IPA00001306972900901
Figure IPA00001306972900911
Figure IPA00001306972900921
Figure IPA00001306972900941
Figure IPA00001306972900951
Figure IPA00001306972900961
Figure IPA00001306972900971
Figure IPA00001306972900991
Figure IPA00001306972901001
Figure IPA00001306972901021
Figure IPA00001306972901031
Figure IPA00001306972901041
Figure IPA00001306972901051
Figure IPA00001306972901061
Figure IPA00001306972901071
Figure IPA00001306972901081
Figure IPA00001306972901101
Figure IPA00001306972901111
Figure IPA00001306972901131
Figure IPA00001306972901141
Figure IPA00001306972901161
Figure IPA00001306972901181
Figure IPA00001306972901191
Figure IPA00001306972901231
Figure IPA00001306972901241
Figure IPA00001306972901251
Figure IPA00001306972901261
Figure IPA00001306972901271
Figure IPA00001306972901281
Figure IPA00001306972901291
Figure IPA00001306972901301
Figure IPA00001306972901311
Figure IPA00001306972901321
Figure IPA00001306972901331
Figure IPA00001306972901341
Figure IPA00001306972901351
Figure IPA00001306972901361
Figure IPA00001306972901381
Figure IPA00001306972901391
Figure IPA00001306972901401
Figure IPA00001306972901421
Figure IPA00001306972901431
Figure IPA00001306972901441
Figure IPA00001306972901451
Figure IPA00001306972901461
Figure IPA00001306972901471
Figure IPA00001306972901491
Figure IPA00001306972901501
Figure IPA00001306972901521
Figure IPA00001306972901541
Figure IPA00001306972901551
Figure IPA00001306972901571
Figure IPA00001306972901581
Figure IPA00001306972901591
Figure IPA00001306972901601
Figure IPA00001306972901621
Figure IPA00001306972901641
Figure IPA00001306972901651
Figure IPA00001306972901661
Figure IPA00001306972901671
Figure IPA00001306972901681
Figure IPA00001306972901691
Figure IPA00001306972901701
Figure IPA00001306972901711
Figure IPA00001306972901721
Figure IPA00001306972901731
Figure IPA00001306972901741
Figure IPA00001306972901751
Figure IPA00001306972901761
Figure IPA00001306972901771
Figure IPA00001306972901781
Figure IPA00001306972901791
Figure IPA00001306972901801
Figure IPA00001306972901811
Figure IPA00001306972901821
Figure IPA00001306972901841
Figure IPA00001306972901851
Figure IPA00001306972901871
Figure IPA00001306972901881
Figure IPA00001306972901891

Claims (27)

1.分离的多核苷酸，其是
(a)具有SEQ ID NO：266的核苷酸序列的多核苷酸，
(b)具有在严格条件下能够与SEQ ID NO：266的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸，或者
(c)具有编码选自SEQ ID NO：267至274的至少一个氨基酸序列或与其基本上等同的氨基酸序列的多核苷酸序列的多核苷酸。
2.根据权利要求1的多核苷酸，其编码参与啶南平A的生物合成的至少一种多肽。
3.根据权利要求1或2的多核苷酸，其编码具有聚酮化合物合酶活性、异戊烯转移酶活性、羟化酶活性、乙酰转移酶活性或腺苷酸合酶活性中的任意一种或多种活性的多肽。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的多核苷酸，其衍生自粪生青霉(Penicillium coprobium)PF1169株。
5.分离的多核苷酸，其具有选自任一以下(1)或(2)的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列：
(1)任一以下(a)至(h)的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第3342位至第5158位的核苷酸序列，
(b)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第5382位至第12777位的核苷酸序列，
(c)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第13266位至第15144位的核苷酸序列，
(d)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第16220位至第18018位的核苷酸序列，
(e)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第18506位至第19296位的核苷酸序列，
(f)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第19779位至第21389位的核苷酸序列，
(g)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第21793位至第22877位的核苷酸序列，
(h)SEQ ID NO：266所示核苷酸序列的第23205位至第24773位的核苷酸序列；
(2)能够与(1)中所述的核苷酸序列在严格条件下杂交的核苷酸序列。
6.根据权利要求5的多核苷酸，其编码参与啶南平A的生物合成的至少一种多肽。
7.根据权利要求5或6的多核苷酸，其编码具有聚酮化合物合酶活性、异戊烯转移酶活性、羟化酶活性、乙酰转移酶活性或腺苷酸合酶活性中的任意一种或多种活性的多肽。
8.根据权利要求5或6的多核苷酸，其编码具有羟化酶活性的多肽。
9.根据权利要求5至8中任意一项所述的多核苷酸，其衍生自粪生青霉PF1169株。
10.根据权利要求5至9中任意一项所述的多核苷酸，其编码具有羟化啶南平E或啶南平O的7位和/或13位的活性的多肽。
11.根据权利要求5至9中任意一项所述的多核苷酸，其编码具有羟化啶南平E的11位的活性的多肽。
12.重组载体，其包含根据权利要求1或权利要求5的任意一种或多种所述多核苷酸。
13.根据权利要求12的重组载体，其包含编码具有羟化啶南平E或啶南平O的7位和/或13位的活性的多肽的多核苷酸。
14.根据权利要求12的重组载体，其包含编码具有羟化啶南平E的11位的活性的多肽的多核苷酸。
15.根据权利要求12的重组载体，其中所述重组载体是质粒pCC1-PP1。
16.根据权利要求12的重组载体，其中所述重组载体是质粒pPP2。
17.根据权利要求12的重组载体，其中所述重组载体是质粒pPP3。
18.转化体，其包含根据权利要求1或权利要求5的任意一种或多种所述多核苷酸。
19.根据权利要求18的转化体，其中所述转化体是包含质粒pCC1-PP1的大肠杆菌(Escherichia coli)。
20.根据权利要求18的转化体，其中所述转化体是包含质粒pPP2的米曲霉(Aspergillus oryzae)。
21.根据权利要求18的转化体，其中所述转化体是包含质粒pPP3的米曲霉。
22.啶南平A前体的制造法，其包括培养含有权利要求12至17中所述的任意一种或多种载体的微生物，和从啶南平E分离啶南平A前体。
23.啶南平A前体的制造法，其包括同时或分别地培养权利要求20所述的转化体和权利要求21所述的转化体，和从啶南平E分离啶南平A前体。
24.根据权利要求22或23的制造法，其中所述啶南平A前体是下式(I)所表示的化合物，
Figure FPA00001306973300031
式(I)。
25.啶南平A前体的制造法，其包括培养含有权利要求12至17中所述的任意一种或多种载体的微生物，和从啶南平O分离啶南平A前体。
26.啶南平A前体的制造法，其包括培养权利要求21的所述转化体，和从啶南平O分离啶南平A前体。
27.根据权利要求25或26的制造法，其中所述啶南平A前体是下式(II)所表示的化合物，
Figure FPA00001306973300041
式(II)。
CN200980128891.6A 2008-07-24 2009-07-24 啶南平a生物合成基因 Active CN102144030B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008190862 2008-07-24
JP190862/2008 2008-07-24
JP270294/2008 2008-10-20
JP2008270294 2008-10-20
JP020591/2009 2009-01-30
JP2009020591 2009-01-30
PCT/JP2009/063293 WO2010010955A1 (ja) 2008-07-24 2009-07-24 ピリピロペンa生合成遺伝子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102144030A true CN102144030A (zh) 2011-08-03
CN102144030B CN102144030B (zh) 2016-05-04

Family

ID=41570415

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980128891.6A Active CN102144030B (zh) 2008-07-24 2009-07-24 啶南平a生物合成基因

Country Status (17)

Country Link
US (2) US8557550B2 (zh)
EP (1) EP2319923B1 (zh)
JP (2) JP4642922B2 (zh)
KR (1) KR101690802B1 (zh)
CN (1) CN102144030B (zh)
AU (1) AU2009274832B2 (zh)
BR (1) BRPI0916355B8 (zh)
CA (1) CA2731760C (zh)
DK (1) DK2319923T3 (zh)
ES (1) ES2453665T3 (zh)
IL (1) IL210795A (zh)
MX (1) MX2011000023A (zh)
NZ (1) NZ590795A (zh)
PL (1) PL2319923T3 (zh)
RU (1) RU2540017C2 (zh)
WO (1) WO2010010955A1 (zh)
ZA (1) ZA201100709B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102791871A (zh) * 2010-01-26 2012-11-21 明治制果药业株式会社 通过酶法生产啶南平衍生物的方法
CN104017839A (zh) * 2010-01-26 2014-09-03 明治制果药业株式会社 生产啶南平的方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2319923B1 (en) * 2008-07-24 2013-12-25 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Pyripyropene a biosynthetic genes
BR112012019458B8 (pt) * 2010-01-26 2022-08-02 Mmag Co Ltd construção de ácidos nucleicos, transformante, e métodos para produzir piripiropenos
WO2012035015A2 (en) 2010-09-14 2012-03-22 Basf Se Composition containing a pyripyropene insecticide and an adjuvant
KR101938020B1 (ko) 2010-09-14 2019-01-11 바스프 에스이 피리피로펜 살곤충제 및 염기를 함유하는 조성물
CA2831613A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EP3682905B1 (en) * 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
WO2013073689A1 (ja) * 2011-11-17 2013-05-23 Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 ピリピロペン生合成遺伝子発現植物体
CN104168769B (zh) 2012-03-12 2016-12-14 巴斯夫欧洲公司 生产啶南平杀虫剂的含水悬浮液浓缩物配制剂的方法
KR102055551B1 (ko) 2012-03-12 2019-12-13 바스프 에스이 피리피로펜 살충제 ｉ 함유 액체 농축 제형
KR102055550B1 (ko) 2012-03-12 2019-12-13 바스프 에스이 피리피로펜 살충제 ⅱ 를 함유하는 액체 농축 제형
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
EP2971033B8 (en) 2013-03-15 2019-07-10 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015196128A2 (en) 2014-06-19 2015-12-23 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
AU2015289656A1 (en) 2014-07-16 2017-02-16 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
US11434486B2 (en) 2015-09-17 2022-09-06 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
US10148618B2 (en) 2016-06-07 2018-12-04 Abb Schweiz Ag Network isolation
KR102098018B1 (ko) 2017-12-22 2020-04-07 주식회사 포스코 압력탱크

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US500997A (en) 1893-07-04 Oar unloadee
JP2993767B2 (ja) 1991-06-06 1999-12-27 社団法人北里研究所 Ｆｏ−１２８９ａ物質およびその製造法
JP3233476B2 (ja) 1992-10-22 2001-11-26 社団法人北里研究所 Ｆｏ−１２８９物質およびその製造法
KR0125129B1 (ko) 1993-10-08 1997-11-28 김은영 신규 아실-코에이 : 콜레스테롤 아실전이효소(acat) 활성 저해물질 및 이의 제조 방법
JPH08239385A (ja) 1995-03-03 1996-09-17 Kitasato Inst:The Ｆｏ−１２８９物質およびその製造法
JP3725198B2 (ja) 1995-03-27 2005-12-07 社団法人北里研究所 ピリピロペン誘導体
JPH08269063A (ja) 1995-03-28 1996-10-15 Kitasato Inst:The ピリピロペン誘導体
JPH08269062A (ja) 1995-03-30 1996-10-15 Kitasato Inst:The ピリピロペン誘導体
JPH08269065A (ja) 1995-04-03 1996-10-15 Kitasato Inst:The ピリピロペン誘導体
JPH08269064A (ja) 1995-04-03 1996-10-15 Kitasato Inst:The ピリピロペン誘導体
JPH08269066A (ja) 1995-04-03 1996-10-15 Kitasato Inst:The ピリピロペン誘導体
JP3688337B2 (ja) 1995-04-18 2005-08-24 社団法人北里研究所 ピリピロペン誘導体
KR100522446B1 (ko) 2003-01-07 2005-10-18 한국생명공학연구원 아실 코에이:콜레스테롤 아실 트란스퍼라제의 저해활성을갖는 화합물 또는 그 염을 유효성분으로 하는 살충제
JP4360895B2 (ja) 2003-12-11 2009-11-11 日立Ｇｅニュークリア・エナジー株式会社 中性子監視装置
US8680079B2 (en) * 2004-05-28 2014-03-25 Novartis Ag Tetrahydro-imidazo [1,5-A] pyridyin derivatives as aldosterone synthase inhibitors
US20060135664A1 (en) 2004-12-17 2006-06-22 David Glassel Methods and compositions of matter for treatment of cellulose
TWI388282B (zh) 2005-06-01 2013-03-11 Meiji Seika Pharma Co Ltd 害蟲控制劑
US7491738B2 (en) 2005-06-01 2009-02-17 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Pest control agents
WO2008066153A1 (fr) 2006-11-30 2008-06-05 Meiji Seika Kaisha, Ltd. Agent antiparasitaire
JP2008270294A (ja) 2007-04-16 2008-11-06 Sumitomo Electric Ind Ltd ヒートシンク部材および半導体装置
JP2009020591A (ja) 2007-07-10 2009-01-29 Canon Inc プリンタアダプタ装置および制御方法
EP2592084B8 (en) 2007-08-13 2014-08-27 Basf Se Process for producing pyripyropene derivatives and intermediates for the production thereof.
JP4267680B2 (ja) 2008-03-26 2009-05-27 株式会社東芝 加熱調理器
EP2319923B1 (en) * 2008-07-24 2013-12-25 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Pyripyropene a biosynthetic genes
DK2426124T3 (da) * 2009-05-13 2013-09-30 Meiji Seika Pharma Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af pyripyropene derivater

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROSHI TOMODA, ET AL.: "Biosynthesis of Pyripyropene A", 《J. ORG. CHEM.》 *
NATALIE D. FEDOROVA, ET AL.: "Genomic Islands in the Pathogenic Filamentous Fungus Aspergillus fumigatus", 《PLOS GENETICS》 *
TOSHIAKI SUNAZUKA, ET AL.: "Total Synthesis of r-Pyrone Meroterpenoids, Novel Bioactive Microbial Metabolites", 《CHEM. REV.》 *
WILLIAM C. NIERMAN, ET AL.: "Genomic sequence of the pathogenic and allergenic filamentous fungus Aspergillus fumigatus", 《NATURE》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102791871A (zh) * 2010-01-26 2012-11-21 明治制果药业株式会社 通过酶法生产啶南平衍生物的方法
CN104017839A (zh) * 2010-01-26 2014-09-03 明治制果药业株式会社 生产啶南平的方法
CN104531726A (zh) * 2010-01-26 2015-04-22 明治制果药业株式会社 生产啶南平的方法
CN104017839B (zh) * 2010-01-26 2017-01-18 明治制果药业株式会社 生产啶南平的方法
CN104531726B (zh) * 2010-01-26 2017-10-10 明治制果药业株式会社 生产啶南平的方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009274832B2 (en) 2015-07-16
ES2453665T3 (es) 2014-04-08
RU2540017C2 (ru) 2015-01-27
ZA201100709B (en) 2012-05-01
BRPI0916355B1 (pt) 2021-11-09
JP4642922B2 (ja) 2011-03-02
EP2319923A4 (en) 2011-12-28
MX2011000023A (es) 2011-03-30
US8557550B2 (en) 2013-10-15
BRPI0916355B8 (pt) 2022-12-13
IL210795A (en) 2014-12-31
RU2011106496A (ru) 2012-08-27
NZ590795A (en) 2012-11-30
PL2319923T3 (pl) 2014-05-30
EP2319923B1 (en) 2013-12-25
AU2009274832A1 (en) 2010-01-28
BRPI0916355A2 (pt) 2020-08-18
CA2731760A1 (en) 2010-01-28
US9315785B2 (en) 2016-04-19
DK2319923T3 (en) 2014-02-24
US20140142289A1 (en) 2014-05-22
JP2010193878A (ja) 2010-09-09
EP2319923A1 (en) 2011-05-11
KR101690802B1 (ko) 2016-12-28
IL210795A0 (en) 2011-04-28
WO2010010955A1 (ja) 2010-01-28
CA2731760C (en) 2019-09-24
US20120015410A1 (en) 2012-01-19
CN102144030B (zh) 2016-05-04
KR20110038678A (ko) 2011-04-14
JPWO2010010955A1 (ja) 2012-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102144030A (zh) 啶南平a生物合成基因
CN102762737B (zh) 生产啶南平的方法
JP5864267B2 (ja) ピリピロペン生合成遺伝子群およびマーカー遺伝子を含む核酸構築物
CN102791871A (zh) 通过酶法生产啶南平衍生物的方法
CN1509334B (zh) 生产pf1022物质衍生物的转化体及其制备方法以及新型生物合成基因
CN114561405A (zh) 木霉菌Harzianolide的合成基因簇在制备提高植物灰霉病抗性制剂中的应用
JP2004173537A (ja) カナマイシン生合成遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Address after: Tokyo, Japan

Applicant after: MEIJI SEIKA PHARMA Co.,Ltd.

Address before: Tokyo, Japan

Applicant before: MEIJI SEIKA Kabushiki Kaisha Ltd.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. (JP) TOKYO, JAPAN TO: MEIJI SEIKA PHARMA CO., LTD.

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220616

Address after: Tokyo, Japan

Patentee after: MMAG Co.,Ltd.

Address before: Tokyo, Japan

Patentee before: MEIJI SEIKA PHARMA Co.,Ltd.

CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: Tokyo

Patentee after: Mitsui Chemical Plant Protection Co.,Ltd.

Country or region after: Japan

Address before: Tokyo

Patentee before: MITSUI CHEMICALS AGRO, Inc.

Country or region before: Japan

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240226

Address after: Tokyo

Patentee after: MITSUI CHEMICALS AGRO, Inc.

Country or region after: Japan

Address before: Tokyo, Japan

Patentee before: MMAG Co.,Ltd.

Country or region before: Japan